全 文 ：药 物 生 物 技 术
Pharmaceutical Biotechnology 2014，21(3) :226 ～ 230
毛脉酸模悬浮细胞系的建立及优化
岳赛男1，王谦博2，刘 奂1，郭 美1，王振月1
*
(1. 黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150000;2. 黑龙江食品药品检验所，黑龙江 哈尔滨 150000)
摘 要 为了建立毛脉酸模悬浮细胞系，研究不同植物激素配比对毛脉酸模愈伤组织性状的影响，研究毛脉
酸模悬浮细胞培养的多种影响因素，应用正交设计优化毛脉酸模悬浮细胞培养的条件。结果显示:在 2，4-D
0. 5 mg /L，6-BA 3. 0 mg /L，蔗糖 30 g /L，培养温度(25 ± 2)℃，光照 14 h /d，光照强度 1 500 ～ 2 000 Lx的培养条件
下，毛脉酸模愈伤组织呈松散颗粒状，可作为悬浮细胞培养的材料;在初始接种量 1 g，2，4-D 0. 5 mg /L，6-BA
2. 5 mg /L，蔗糖 30 g /L，培养温度(25 ± 2)℃，120 r /min黑暗振荡的培养条件下，可获得悬浮细胞，当培养到 24 d
时细胞鲜重增长量达到最大值 1. 010 3 g。结论:应用优化的细胞悬浮培养条件，能获得较大量的毛脉酸模悬浮
细胞。
关键词 毛脉酸模;愈伤组织;激素;悬浮培养;悬浮细胞;优化
中图分类号 Q943. 1 文献标志码 A 文章编号 1005-8915(2014)03-0226-05
毛脉酸模(Ｒumex gmelini turcz)为蓼科(Polygonaceae)
酸模属(Ｒumex)植物，民间以根及根茎入药，以治疗淋病、
癣病、疮毒、止血、肿瘤和调血脂等著称［1］，具有抗真菌、抗
肿瘤、抗病毒和抗氧化作用［2］，其根中富含白藜芦醇及白藜
芦醇苷、酸模素、大黄酚、大黄素等化合物［3-6］。利用植物组
织培养生产次生代谢产物具有保护植物资源、生产周期短、
不受地区和季节限制、利于生物转化，寻找新的有效药物成
分等优点［7］。因此，应用细胞悬浮培养技术，提取毛脉酸模
次生代谢产物，进行工厂化生产，从而满足人们食用、药用
保健及新药开发、避免与农业争地等需求。本试验以毛脉
酸模无菌苗下胚轴为材料进行了愈伤组织的诱导，确定获
得松散型愈伤组织的最佳激素配比，并以此为基础建立起
毛脉酸模悬浮细胞培养体系，为细胞大规模悬浮培养生产
天然活性成分奠定了基础，为毛脉酸模次生代谢产物物质
的生物开发利用提供依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 愈伤组织 实验材料采自黑龙江中医药大学药园
毛脉酸模种子(经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定确
认) ，经无菌条件培养出无菌苗，取下胚轴为外植体通过诱
导发育成毛脉酸模愈伤组织。
1. 1. 2 培养基 愈伤组织诱导培养基是在MS培养基中加
入不同浓度的 2，4-D、6-BA;细胞悬浮培养基不添加琼脂，
其它成分和愈伤组织诱导培养基相同。
1. 2 方法
1. 2. 1 无菌苗的培养 选取颗粒饱满的毛脉酸模种子，用
120 目砂纸磨去种皮，浸泡在蒸馏水中 24 h;在无菌条件下
用 75%的酒精浸泡 2 min，无菌水冲洗 3 次，再用 10%
NaClO浸泡 8 min，无菌水冲洗 5 次，置于两层湿润的滤纸上
10 h;用 10%NaClO浸泡 10 min，无菌水冲洗 5 次，将消毒的
种子接种在不含植物生长激素的 MS 培养基中，置于光照
培养箱，培养温度 25 ℃。
1. 2. 2 疏松愈伤组织的诱导 根据前期的试验以确定植物
激素 2，4-D和 6-BA的浓度分别为 1. 7 mg /L和 3. 0 mg /L时
可稳定获得大量的愈伤组织。选取生长良好的愈伤组织，
接种在含有不同植物激素(表 1)的 MS培养基中，培养温度
(25 ± 2)℃，光照 14 h /d，光照强度 1 500 ～ 2 000 Lx，进行疏
松愈伤组织的诱导。每个培养皿内接种 6 个外植体，20 个
培养皿为 1 组，重复 3 次。
1. 2. 3 悬浮细胞系的建立 将改良成质地疏松、生长旺盛
的下胚轴愈伤组织继代 2 ～ 3 次，用无菌镊子夹碎，接种在
装有 40 mL MS 液体培养基的 100 mL 锥形瓶中，加入植物
激素，培养温度(25 ± 2)℃，120 r /min 黑暗振荡培养。7 d
后用 80 目细胞筛去除大的细胞团块。将细胞悬浮培养物
摇匀，稍静止，倒出上层培养液，加入新的培养液到 40 mL
(新旧培养液比例 1∶ 1) ，连续继代 4 ～ 5 代，可得到具有一
定量的悬浮培养细胞(图 1)。
622
* 收稿日期:2013-10-08 修回日期:2013-12-09
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No. 30970300) ;哈尔滨市科技创新人才研究专项基金资助项目(优秀学科带头人:
2010rfxxs031)。
作者简介:岳赛男(1988-) ，黑龙江中医药大学，2011 级硕士研究生。Tel:18646004658。
* 通讯作者:王振月(1956-) ，教授，博士生导师，主要研究方向为中药资源开发与生物技术。E-mail:wangzhen_yue163@ . com。
岳赛男，等:毛脉酸模悬浮细胞系的建立及优化
Tab 1 Different ratios of hormones concentrations
No.
Concentration ratios
2，4-D /(mg /L) 6-BA /(mg /L)
1 0. 3 3. 0
2 0. 5 3. 0
3 0. 7 3. 0
4 1. 0 3. 0
5 1. 5 3. 0
6 1. 5 2. 5
7 1. 0 2. 5
8 0. 7 2. 0
9 0. 5 2. 0
10 0. 3 2. 0
Fig 1 Ｒumex gmelini cell
1. 2. 4 悬浮细胞体系生长特性的测定 在优化的培养条
件下，准备 30 个 100 mL 的锥形瓶，每瓶 20 mL 培养基，接
种量相同，培养 30 d，每隔 3 d，随机取 3 瓶测鲜重量增长
量。以培养时间为横坐标，鲜重增长量为纵坐标，绘制生长
曲线，考察生长特性。［鲜重增长量 =收获细胞鲜重 －初始
接种细胞鲜重］(细胞鲜重的测定方法:悬浮细胞经 80 目尼
龙网真空抽滤后称重。)
Fig 2 The micrograph of Ｒumex gmelini cell
2 结果与分析
2. 1 植物激素对毛脉酸模外植体疏松愈伤组织诱导的
影响
通过调节不同的植物激素配比浓度，培养毛脉酸模愈
伤组织，通过观察愈伤组织性状及颜色判断出最优培养条
件。由表 2 可以看出，不同配比的植物生长激素对毛脉酸
模疏松愈伤组织的影响很大。当 2，4-D 在 0. 3 ～ 0. 7 mg /L
之间、6-BA 为 3. 0 mg /L 时，愈伤组织均较湿润、呈松散颗
粒状，状态良好;当 2，4-D 浓度在 1. 0 ～ 1. 5 mg /L 时，6-BA
为 3. 0 mg /L 时，愈伤组织疏松效果不明显;当 2，4-D 在
0. 3 ～ 0. 7 mg /L之间，6-BA 为 2. 0 mg /L 时，愈伤组织均较
干燥、呈块状，状态差，不适合作为培养悬浮细胞的材料。
综上所述，当 2，4-D 0. 5 mg /L，6-BA 3. 0 mg /L时，愈伤组织
的性状及颜色最佳，可以按照此配比培养获得疏松的毛脉
酸模愈伤组织。
Tab 2 Effects of different concentrations of 2，4-D、6-BA on callus
No.
Concentration ratios
2，4-D /(mg /L) 6-BA /(mg /L)
Callus traits Color
1 0. 3 3. 0 Ｒelatively moist，loose granular Yellow-green
2 0. 5 3. 0 Moist，loose granular Yellowish-white，yellow-green
3 0. 7 3. 0 Moist，relatively loose granular Yellowish-white，yellow-green
4 1. 0 3. 0 Moist，relatively loose slug Yellowish-white，yellowish-brown
5 1. 5 3. 0 Ｒelatively moist，relatively dense slug Yellow-green，yellowish-brown
6 1. 5 2. 5 Ｒelatively moist，relatively dense slug Yellow-green，yellowish-brown
7 1. 0 2. 5 Ｒelatively dry，relatively dense clump yellowish-brown
8 0. 7 2. 0 Ｒelatively dry，relatively dense clump yellowish-brown，dark brown
9 0. 5 2. 0 Dry，dense clump Dark brown
10 0. 3 2. 0 Dry，dense clump Dark brown
722
药 物 生 物 技 术 第 21 卷第 3 期
各组实验照片见图 3:
Fig 3 The photograph of each group in Tab 2
2. 2 优化悬浮细胞系的条件筛选
选取影响毛脉酸模悬浮细胞培养的 4 个主要因素，采
用 4 因素 3 水平正交试验设计 L9(3
4) ，考察初始接种量
(A)、2，4-D(B)、6-BA(C)和蔗糖浓度(D) ，筛选最优悬浮
细胞系的条件，结果见表 3。
Tab 3 Levels and factors of orthogonal test
Levels
Factors
A /g B /(mg /L) C /(mg /L) D/(g /L)
1 1. 0 0. 5 2. 0 20
2 2. 0 1. 0 2. 5 30
3 3. 0 1. 5 3. 0 40
按正交试验设计，配制不同的培养基，接种后在温度
(25 ± 2)℃，转速 120 r /min黑暗振荡条件下培养，结果见
表 4。对毛脉酸模悬浮细胞培养条件进行 L9(3
4)试验，结
果表明:4个因素对毛脉酸模细胞的生长影响顺序依次是
A ＞ C ＞ B ＞ D，即初始接种量 ＞6-BA ＞2，4-D ＞蔗糖浓度。当
初始接种量为 1 g 时，鲜重增长率最高。6-BA 分别为 3. 0，
2. 5 mg /L时增长率均较高，避免长时间高浓度植物激素对细
胞可能造成的损害，故 6-BA选取 2. 5 mg /L为宜。通过结果
分析，可以看出 2，4-D 浓度和蔗糖浓度对悬浮细胞培养的
影响较小，为使愈伤组织细胞能尽快适应液体培养环境，故
保持接种时的浓度，2，4-D 0. 5 mg /L、蔗糖浓度 30 g /L。经
过分析得出最优培养毛脉酸模悬浮细胞的组合为
A1C2B1D2，即初始接种量 1 g、2，4-D 0. 5 mg /L、6-BA
2. 5 mg /L、蔗糖 30 g /L 条件下培养，可获得稳定的毛脉酸
模悬浮细胞。
2. 3 毛脉酸模悬浮细胞生长特性的研究
2. 3. 1 毛脉酸模悬浮细胞的生长曲线 由图 4 可以看出，
毛脉酸模悬浮细胞的生长曲线基本呈“S”型，即增长量呈
先上升后下降的趋势。接种 d 1 ～ 7 为延迟生长期，增长量
很小;d 8 ～ 24 为快速生长期，增长量迅速增加;d 24 增长量
最大，细胞鲜重达到 1. 010 3 g，d 25 ～ 30 为生长减慢期，增
长量下降。
Tab 4 Ｒesults and range analysis of orthogonal test
No. A B C D FW growth /%
1 1 1 1 1 78. 52
2 1 2 2 2 74. 43
3 1 3 3 3 69. 82
4 2 1 2 3 63. 74
5 2 2 3 1 52. 15
6 2 3 1 2 59. 41
7 3 3 2 1 45. 99
8 3 1 3 2 53. 16
9 3 2 1 3 44. 25
K1 74. 257 62. 750 63. 697 58. 303
K2 58. 430 59. 910 60. 807 59. 943
K3 47. 800 57. 827 55. 983 62. 240
Ｒ 26. 457 4. 923 7. 714 3. 937
Fig 4 The changes of Ｒumex gmelini cell fresh
weight increase during the growth period
822
岳赛男，等:毛脉酸模悬浮细胞系的建立及优化
2. 3. 2 毛脉酸模悬浮细胞活力的变化 毛脉酸模悬浮细
胞活力的变化如图 5 所示，呈先上升后下降的趋势。接种
d 1 ～ 10 的细胞活力急剧上升，d 10 到达最大值，d 10 ～ 35
细胞活力逐渐下降。
Fig 5 The changes of Ｒumex gmelini cell
viability during the growth period
3 结论与讨论
本研究表明:植物激素浓度对毛脉酸模愈伤组织有很
大的影响。实验通过不同植物激素配比浓度对毛脉酸模愈
伤组织进行了筛选。在 2，4-D 0. 5 mg /L，6-BA 3. 0 mg /L，
蔗糖 30 g /L，培养温度(25 ± 2)℃，光照 14 h /d，光照强度
1 500 ～ 2 000 Lx的培养条件下，可获得大量适于培养悬浮
细胞的松散颗粒状愈伤组织。
有研究表明，2，4-D 对植物器官的脱分化、愈伤组织的
增殖与体细胞胚诱导具有促进作用，但也有报道指出 2，4-
D对细胞分化有抑制作用［8-10］，本研究结果与这些报道研
究是一致的。2，4-D在诱导毛脉酸模愈伤组织的启动浓度
为 1. 7 mg /L，在进行继代培养时，降低 2，4-D 的浓度，亦可
达到满足生长的需求，使愈伤组织呈湿润、松散颗粒状，且
避免了长期高浓度 2，4-D培养可能对细胞造成的副作用。
本研究表明:建立毛脉酸模悬浮细胞培养系时，考察了
初始接种量、2，4-D浓度、6-BA浓度、蔗糖浓度对其体系建立
的影响。通过设计正交试验，筛选出最优培养条件
A1C2B1D2，初始接种量 1 g，2，4-D 0. 5 mg /L，6-BA 2. 5 mg /L，
蔗糖 30 g /L，培养温度(25 ±2)℃，120 r /min黑暗振荡培养。
目前对植物悬浮细胞系的建立过程中，主要考察和分
析起始愈伤组织的选择、接种量、植物激素浓度配比和营养
成分的使用量等方面。通过设计合理的正交试验、均匀试
验等方法，优化各因素的影响，从而获得稳定大量的悬浮细
胞［11-12］。因此本试验的方法和分析是科学有效的。据报
道，接种量的高低对悬浮细胞的生长影响较大，接种量过
高，悬浮细胞生长速度快，若继代不及时，细胞易处于“饥
饿”状态，细胞内含物减少，液泡变大，用此类悬浮细胞分离
的原生质体产量和活力都很低;接种量过低，细胞增殖缓
慢，容易衰老，也不利于悬浮细胞生长［13］。因此，接种量是
建立毛脉酸模悬浮细胞系的主要影响因素，与正交试验结
果分析结果一致。
本研究表明:毛脉酸模悬浮细胞的生长曲线呈“S”型，
即增长量呈先上升后下降的趋势，d 25 ～ 30 为生长减慢期，
增长量下降。因此，悬浮细胞培养到 22 ～ 24 d 继代为宜。
这与水翁、西洋参、桑树等悬浮细胞生长曲线的趋势一
致［14-16］。毛脉酸模悬浮细胞活力呈先上升后下降的趋势，
并在接种 d 10 的细胞活力达到最大值，认为在进行原生质
体制备研究时以接种 d 10 取材为宜。这与桑树、红豆杉的
结果一致［14，17］，即生长延迟期细胞活力最高，快速生长期
细胞活力下降。
生长曲线呈“S”型可以直观的反映悬浮细胞的生长动
态。刚接种时细胞因需适应新的培养环境导致增长量很
小，适应后增长量迅速增加，培养后期细胞系颜色由浅黄色
转为黄褐色，这可能是由于三角瓶内细胞量较高，培养基营
养成分消耗过大，细胞代谢产物抑制自身生长，最终导致部
分细胞老化甚至死亡。因此，毛脉酸模悬浮细胞培养到
22 ～ 24 d时，需及时继代。
总结:本研究在毛脉酸模组织培养的基础上，以松散颗
粒状愈伤组织为材料，建立了毛脉酸模悬浮细胞培养系，并
探讨了各种不同培养条件对悬浮细胞生长的影响，成功的
建立了毛脉酸模悬浮细胞系。为进一步研究毛脉酸模悬浮
细胞有效成分提供了材料，扩大了研究范围。同时，为细胞
大规模悬浮培养生产天然活性成分奠定了基础，为毛脉酸
模次生代谢产物物质的生物开发利用提供依据。
参 考 文 献
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Establishment and Optimization of Suspension Cell System of Ｒumex
Gmelini
YUE Sai-nan，WANG Qian-bo，LIU Huan，GUO Mei，WANG Zhen-yue*
(1． School of Pharmaceutical Science，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Haerbin 15000，China;2． Hei-
longjiang Institute for Food and Drug Control，Haerbin 15000，China)
Abstract To establish the suspension culture system of Ｒumex gmelini，effects of ratios of different plant hormones influence on
Ｒumex gmelini callus traits，effects of various factors on cell growth were studied and the optimal growing conditions of cell suspen-
sion culture were investigated by orthogonal design． Through the orthogonal test，the results indicated that optimum conditions for sus-
pension culture of Ｒumex gmelini cell were as follows:the concentration of inoculation amount was 1 g，2，4-D was 0． 5 mg /L，6-BA
was 2． 5 mg /L，sucrose was 30 g /L，culture temperature was (25 ± 2)℃，rotational speed was 120 r /min，and the best culture time
was 20 ～ 25 d． Under optimal culture conditions，the fresh weight cells reached the maximum amount of growth when cultured for
25 d． Fresh weight growth rate is 1 g． The higher concentration of Ｒumex gmelini suspension cell could be obtained by using the opti-
mal growing conditions of cell suspension culture.
Key words Ｒumex gmelini，Callus，Plant hormones，Suspension culture，Suspension Cell，
櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗
Optimization
·信 息·
2014 －41 欧盟积极探索无细胞壁细菌的繁殖机理 细菌细胞壁是细菌细胞膜外部至关重要的最外保护层，由特殊
细菌肽相互交织的多聚糖链组成。被称之为 L 类型(L-Forms)的抗生素耐药性细菌细胞，几乎不存在最外层的细胞壁保
护;而绝大多数细菌均可被改变成 L类型细菌或具有细胞壁缺陷(CWD)的 L类型细菌，同广泛系列的传染性疾病和抗生素
耐药性密切相关。欧盟第七研发框架计划(FP7)提供全额资助，由英国纽卡斯尔大学领导的欧洲 CFILP 研发团队，旨在深
入探索和理解 L类型细菌的繁殖机理。细菌细胞的增殖分裂，通常情况下需要细菌细胞壁和细胞骨架组成部分的共同作
用，但典型的 L类型细菌细胞为球状形，具有在细胞壁或细胞骨架缺失情况下繁殖与生长的能力，有可能揭示世界早期生
命的起源。CFILP研发团队选择 L类型枯草芽孢杆菌作为研究对象，其增殖分裂关键因素的特征定性成为研发创新活动的
主要目标任务。研究发现:(1)通过细胞壁缺失情况下促进细胞增殖分裂的基因突变隔离分析研究，发现了 L 类型细菌细
胞增殖分裂的关键基因变异，被激活的细胞脂肪酸合成系统引发过多细胞膜的产生;(2)进一步的研究发现，人为增加野生
L类型细菌细胞的表面积 /体积之比，将自发形成 L类型子代细胞;(3)利用基因失活的方式，发现了可保持 L 类型细菌的
细胞增殖，但可有效阻止细胞分裂的基因变异; (4)L 类型细菌细胞脂肪酸成分合成的隔离与突变，可降低细胞膜流体
(Fluidity) ，从而阻止 L类型细菌繁殖过程中的细胞分裂;(5)L类型细菌细胞的增殖分裂，意味着不平衡的细胞繁殖与生
长导致子代细胞持续增加细胞表面积;(6)L类型细菌自发形状变形的子代细胞，可通过细胞膜进行人工修正。
2014 －42 美国麻省理工学院开发出基于狂犬病毒的顺行性神经示踪剂 为了研究神经回路，需要确定与相关细胞
突触联系的神经元，也需要明确这个神经元轴突末梢信号的去向。对于前者，目前可以利用逆行运输的病毒示踪剂，对从
一个靶细胞的突触到突触前“伙伴”神经元进行示踪。狂犬病病毒表现出这方面的特征，而且已经成为普遍的神经元示踪
剂。美国麻省理工学院研究人员等设计了反向运行的狂犬病病毒:从靶细胞的胞体到它的轴突末梢，或者顺行跟踪。研究
人员通过用水疱性口炎病毒的包膜糖蛋白将狂犬病病毒进行包裹，通过结合逆行和顺行的狂犬病病毒展示了神经纤维示
踪的几种新功能，例如可以同时对大脑输入和输出信号进行标记。
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