全 文 ：第 35 卷　第 6 期 西北农林科技大学学报(自然科学版) Vol.35 No.6
2007 年 6 月 Journal of No rthwest A &F Univer sity(Na t.Sci.Ed.) Jun.2007
冬青卫矛内生真菌 2QR1菌株代谢产物的杀菌活性＊
李会玲 ,杨春平 ,武金占 ,邵彦坡 ,姬志勤
(西北农林科技大学 农药研究所 ,陕西 杨凌 712100)
[ 摘　要] 　为寻找天然植物源新的具有农药活性的先导化合物 ,从冬青卫矛根皮中分离到 1 株内生真菌 ,编号
为 2QR1 ,初步鉴定其为半知菌亚门 , 曲霉属(Aspergi llus)。室内活性测定结果表明 , 2QR1 菌株发酵液的杀菌活性远
高于菌丝体的杀菌活性。该菌株发酵液乙酸乙酯萃取物对小麦根腐病菌 、小麦赤霉病菌 、苹果炭疽病菌 、玉米大斑病
菌 、番茄叶霉病菌 、烟草赤星病菌和马铃薯干腐病菌菌丝生长抑制的有效中质量浓度 EC50值分别为 53.6 , 63.1 , 63.3 ,
98.2 , 106.5 , 115.9 和 166.3 μg/ mL;对玉米大斑病菌 、小麦根腐病菌 、烟草赤星病菌和马铃薯干腐病菌抑制孢子萌发
的有效中质量浓度 EC50值分别为 94.8 , 139.1 , 146.6 和 180.1 μg/ mL;在质量浓度为 500 μg/m L 时 , 对枯草芽孢杆
菌 、蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在 16 mm 以上。 盆栽试验结果表明 , 2QR1 菌株发酵液乙酸乙酯
萃取物在质量浓度为 2 000μg/ mL 时 , 对小麦白粉病的保护作用和治疗作用分别为 61.9%和 81.6%。选用硅胶柱层
析 ,以杀菌活性追踪为指导 , 对该菌株发酵液乙酸乙酯萃取物进行了杀菌活性成分的分离 , 得到化合物 B9 。化合物
B9 对玉米大斑病菌 、烟草赤星病菌 、小麦根腐病菌和马铃薯干腐病菌抑制孢子萌发的有效中质量浓度 EC50值分别为
0.8 , 1.4 , 3.3 和 5.0 μg/ m L。
[ 关键词] 　冬青卫矛;内生真菌;代谢产物;杀菌活性
[ 中图分类号] 　S481 +.9;S482.2 +92 [ 文献标识码] 　A [ 文章编号] 　1671-9387(2007)06-0135-06
Antifungal metabolites of endophyt ic fungus of 2QR1 strain
in Euonymus japonicus
LI Hui-ling , YANG Chun-ping ,WU Jin-zhan , SHAO Yan-po , JI Zhi-qin
(Insti tute o f P est icid e S cience , Northwest A &F Univer sity ,Yang lin g , Shaanxi 712100 , Ch ina)
Abstract:A endophyt ic fungi st rain w as isolated f rom Every reen euonymus.The strain numbered
2QR1 w as preliminarily identified as deuteromyco tina Aspergi l lum .The result of fungicidal act ivities of
metabolit ies of 2QR1 strain showed that the EC 50 value of ethy l acetate ex t ract of fermentation broth of
2QR1 strain w as separately 53.6 , 63.1 , 63.3 , 98.2 , 106.5 , 115.9 and 166.3 μg/mL against Bipolaris
sorokiniana ,Fusarium graminearum ,Glomerel la cingulata ,Exserohi lum turcicum ,Fulvia f ulvum , Alternaria
longipe andFusarium solani .The EC50 value of acetate e xt ract of fermentat ion bro th of 2QR1 to inhibit the
spore germinat ions o f Exserohilum turcicum , Alternaria longipes ,Bipolaris sorokiniana and Fusarium
solani was separately 94.8 , 139.1 , 146.6 and 180.1 μg/mL.The inhabit ion zone diameter of ethy l acetate
e xt ract o f fermentation bro th o f 2Q R1 strain w as more than 16mm at the concentrat ion of 500 μg/mL a-
gainst Baci l lus subti li s , Baci l lus cereus and S taphy lococcu aureus.The results o f po t test indicated that
e thyl acetate ex t ract of fermentation bro th o f 2QR1 strain show ed 61.9% of protected eff icacy and 81.6%
of therapeutic ef ficacy at 2 000 μg/mL .Compound B9 was separated f rom the ethy l acetate ex t ract o f fer-
＊[收稿日期] 　2006-11-17
[基金项目] 　国家“ 863”高技术计划项目(2002AA245121)
[作者简介] 　李会玲(1979-),女 ,陕西蒲城人 ,在读硕士 ,主要从事天然产物农药研究。
[通讯作者] 　姬志勤(1971-),男 ,山西永济人 ,讲师,主要从事天然产物农药研究。 E-mai l:jizhijun@163.com
DOI :10.13207/j.cnki.jnwafu.2007.06.028
mentation broth by p-T LC.The resul t of spo re germinat ion pro ved that the EC 50 value of compound B9 was
separately 0.8 , 1.4 , 3.3 和 5.0 μg/mL , against Exserohi lum turcicum , Alternaria long ipes ,Bipolaris
sorokiniana and Fusarium solani .
Key words:Euonymus japonicus;endophy tic fungi;fermentation products;fungicidal activi ties
　　冬青卫矛(Euonymus japonicus)又名正木 、大
叶黄杨 ,为卫矛科卫矛属常绿直立灌木 ,在我国南北
方各省区均有栽培 ,目前多作为园艺观赏植物[ 1] 。
卫矛科植物中的许多化合物具有药用活性 ,如细胞
毒性 、抗癌活性 、逆转多重药物抗性(MDR)、免疫抑
制活性 、抗艾滋病等已有许多研究报道;另外 ,许多
卫矛科植物在中国传统农业中用以保护农作物免受
危害[ 2] 。根据《新华本草纲要》记载 ,卫矛科有 11种
植物具有农药活性 ,主要集中在雷公藤属 、卫矛属 、
南蛇藤属[ 3] 。目前 ,在国外 ,仅 Han 等[ 4] 报道从冬
青卫矛根皮中分离鉴定出 6个 β-二氢沉香呋喃多元
醇酯类生物碱化合物。在国内 ,西北农林科技大学
农药研究所自 2000年以来 ,从卫矛科杀虫植物苦皮
藤的内生真菌中分离出 2株产生杀虫活性和 3株产
生杀菌活性的内生真菌 ,并从编号为 2B 的活性菌
株内分离到 3 个环肽类抗菌化合物[ 5-6] 。黄军海
等[ 7]对 13种卫矛科植物杀虫活性的研究发现 ,冬青
卫矛(Euonymus japonicus)根皮的石油醚和乙酸乙
酯提取物的毒杀活性分别为 20%和 60%。张启
东[ 8]从冬青卫矛中分离出的 4个大环生物碱具有显
著杀虫活性。基于某些植物内生真菌能产生与宿主
相同或相似的活性成分[ 9] ,本研究从采自陕西杨凌
的冬青卫矛根皮中分离到 1 株内生真菌 2QR1 ,对
2QR1菌株代谢产物的杀菌作用进行了探讨 ,以期
从天然植物源寻找新的具有农药活性的先导化合
物。
1　材料与方法
1.1　材　料
1.1.1　供试菌株　从采自陕西杨凌的冬青卫矛
(Euonymus japonicus)根皮中分离到 1 株内生真
菌 ,命名为 2QR1。
1.1.2　供试病原菌 　番茄叶霉病菌(Fulv ia f ul-
vum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、玉
米大斑病菌(Exserohi lum turcicum)、烟草赤星病菌
(Alternaria longipes)、小麦根腐病菌(Bipolaris
sorokiniana)、苹果炭疽病菌(Glomerel la cingula-
ta)、马铃薯干腐病菌(Fusarium solani)、番茄早疫
病菌(Alternaria solani)、西瓜枯萎病菌(Fusarium
oxy sporium f .sp.niveum)、棉花枯萎病菌(Vertiv-
i ll ium dah liae)、小麦白粉病菌(B lumeria grami-
nis),及蜡状芽孢杆菌(Baci l lus cereus)、枯草芽孢
杆菌(Baci llus subt i ll s)、金黄色葡萄球菌(S taphy-
lococcus aureus)、链球菌(Streptococcus),均由西北
农林科技大学农药研究所提供 。
1.1.3　供试植物　将已萌发的小麦种子(小麦品种
辉县红)播在装有土壤的纸杯中 ,每纸杯播 7 ～ 8粒 ,
在 18 ～ 20 ℃培养 7 d左右。
1.1.4　培养基　固体培养基:PDA 培养基 ,牛肉膏
蛋白胨培养基。
液体培养基:土豆 200 g ,蔗糖 10 g ,葡萄糖 10
g ,乙酸钠 1.66 g ,硫酸镁 1.02 g ,蛋白胨0.5 g ,蒸馏
水 1 000 mL ,0.1 MPa 灭菌 30 min 。
1.2　2Q R1菌株发酵产物的制备
1.2.1　2Q R1菌株的液体培养　在 250 mL 三角瓶
中装入 100 ～ 125 mL 马铃薯液体培养基 ,封口 ,灭
菌。待冷却后用接种针挑取少量 2Q R1菌落接种于
培养瓶中 ,置摇床上 ,在 180 ～ 200 r/min 、26 ～ 30 ℃
条件下培养 6 ～ 7 d。
1.2.2　2Q R1菌株发酵产物的提取　发酵终止后 ,
将 3 800 mL 2Q R1菌株发酵产物用 4层纱布过滤 ,
菌丝体在通风橱中吹干 ,获得干菌丝体 41.501 g 。
菌丝体分别用甲醇 、乙酸乙酯和石油醚水浴回流提
取各 3次 ,每次 2 h ,合并滤液 ,过滤 ,用旋转蒸发器
浓缩得菌丝体甲醇 、乙酸乙酯和石油醚粗提物分别
为 1.007 ,0.887和 0.178 g 。发酵液用等体积乙酸
乙酯萃取 4次 ,合并乙酸乙酯相 ,减压浓缩得乙酸乙
酯萃取物 1.262 g 。
1.3　2Q R1菌株发酵产物对病原菌的抑制作用
1.3.1　对菌丝生长的抑制作用　将一定浓度待测
样品的丙酮溶液 1 mL 与 9 mL 融化的 PDA培养基
混匀 ,倒入无菌培养皿中制成带药培养基平面。待
培养基凝固后 ,在每个培养基平面放入 1个供试菌
菌饼(直径为 4 mm), 使菌饼带菌丝的一面贴在培
养基表面 ,以加入 10 mL DNA 培养基为对照 ,每处
理 3次重复 。培养 72 ～ 96 h后 ,用十字交叉法测量
供试菌菌落直径 ,用下述公式计算抑制率[ 10] :
菌丝生长抑制率/ %=(对照菌落直径-
136 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 35 卷
处理菌落直径)/对照菌落直径×100% 。
1.3.2　对病原细菌的抑制作用　采用滤纸片扩散
法测定病原细菌对 2QR1菌株发酵产物的敏感性。
将融化的牛肉膏蛋白胨培养基冷却至 45 ～ 50 ℃,加
入体积分数 1.5%的供试病原细菌摇匀 ,每皿 5 L
制成培养基平板 。将 2QR1菌株代谢产物配成质量
浓度为 500 μg/mL 的丙酮溶液 ,取 10 μL 点滴于滤
纸片(直径 4 mm)上 ,使其充分吸收 ,挥去溶剂后 ,
平放于培养基平板上 ,以丙酮为对照 ,每处理重复 3
次 ,置于 37 ℃恒温箱中培养 , 24 h 后测量抑菌圈大
小[ 11] 。
1.3.3　对敏感真菌的毒力测定　(1)抑制菌丝生长
的毒力 。将 2QR1菌株发酵液乙酸乙酯萃取物配成
5 000 ,2 500 , 1 250 , 625 , 312.5 μg/mL 5个不同质
量浓度 ,每质量浓度为一个处理 ,每处理设 3个重
复。其他方法同 1.3.1 ,最后根据不同质量浓度的
菌丝生长抑制率计算毒力[ 10] 。
(2)抑制孢子萌发的毒力。取供试病原菌的孢
子配成适当浓度的孢子悬浮液(在 10 ×10 低倍镜
下 ,每个视野有 30 ～ 40 个孢子)。将 2Q R1菌株发
酵液乙酸乙酯萃取物配成 500 ,250 , 125 ,62.5 , 31.25
μg/mL 5个不同质量浓度。把一定浓度待测样品的
丙酮溶液分别与孢子悬浮液混合 ,取 1滴滴加在凹
玻片上 ,将凹玻片迅速翻转使液滴倒悬在凹玻片下
表面 ,小心将凹玻片放在保湿器架上 ,使液滴倒悬在
保湿的小环境中 ,每质量浓度为一个处理 ,以加入孢
子悬浮液为对照 ,每处理 3 次重复 。在适当温度下
培养 6 h后检查对照孢子的萌发情况 。当对照孢子
萌发率达到 85%后 ,检查所有处理孢子的萌发率。
以孢子芽管长度大于孢子短半径者为萌发。按下式
计算孢子萌发抑制率 。最后根据不同质量浓度的抑
制率计算毒力[ 12] 。
萌发抑制率/ %=(对照萌发率-处理萌发率)/
对照萌发率×100% 。
1.4　2Q R1菌株发酵产物对小麦白粉病的盆栽防
效试验
(1)保护作用测定:先在盆栽小麦植株上喷洒
1 000 ,2 000 μg/mL 2QR1 菌株发酵液乙酸乙酯萃
取物 ,24 h后在保湿条件下接种小麦白粉病菌。每
处理 4次重复 ,每重复1盆 ,设清水对照 , 7 d后按照
小麦白粉病的分级标准进行病情调查[ 13] 。
(2)治疗作用测定:先在保湿条件下接种(喷雾
法)小麦白粉病菌 , 24 h 后再在小麦植株上喷施
1 000 ,2 000 μg/mL 2QR1菌株发酵液乙酸乙酯萃
取物。每处理 4次重复 ,每重复 1盆 ,设清水对照 ,7
d后按小麦白粉病的分级标准进行病情调查[ 13] 。
病情指数=∑(各级发病数×该级代表数)总株数×最高级代表数 ,
防治效果/ %=(对照病情指数-处理病情指数)/
对照病情指数×100% 。
1.5　2Q R1菌株的初步分类鉴定
根据真菌的分类鉴定方法 ,通过观察菌落特征
及菌丝 、分生孢子 、产孢结构等的形态 ,对比相关分
类系统 ,确定 2Q R1菌株的种属地位[ 14-15] 。
1.6　2Q R1菌株发酵产物有效成分的分离
取浓缩挥发干后的 2Q R1菌株发酵液乙酸乙酯
萃取物 8.4 g 上硅胶柱 ,采用干法装柱 。以石油
醚∶乙酸乙酯体积比 98∶2 ～ 25∶75;乙酸乙酯∶甲
醇体积比 99∶1 ～ 50∶50淋柱 ,流速为 6 mL/min ,每
200 mL 收集1份 ,收集 9份后以500 mL 甲醇清柱。
浓缩得 10个馏分(记为 A 1 ～ A 10),以枯草芽孢杆菌
为指示菌 ,采用滤纸片法对每份样品进行杀菌活性
测定。
将 A 1 ～ A 10馏分中杀菌活性最好的馏分 A 4 放
在通风橱中挥发干 ,取2.5 g 上硅胶柱 ,用石油醚∶乙
酸乙酯体积比 16∶6 装柱 ,湿法上样 。采用石油
醚∶乙酸乙酯∶甲醇体积比 16∶6∶0.4进行洗脱 ,
每 20 mL 收集 1份 ,收集 10 份后 ,用 200 mL 甲醇
清柱。浓缩得 11个馏分(记为 B1 ～ B11)。其中 , B9
是一个淡黄色结晶 。经 T LC 和 HPLC 检测分析 ,
确定其为纯化合物。
2　结果与分析
2.1　2Q R1菌株发酵产物对病原菌菌丝生长的抑
制作用
从表 1可以看出 , 2QR1 菌株菌丝体乙酸乙酯
提取物在质量浓度为 500 μg/mL 时 ,对病原菌菌丝
生长的抑制作用较强 ,其中对玉米大斑病菌和苹果
炭疽病菌的菌丝生长抑制率在 80%以上 ,而菌丝体
石油醚提取物和甲醇提取物对病原菌菌丝生长的抑
制作用较弱 。2QR1菌株发酵液乙酸乙酯萃取物在
质量浓度为 500 μg/mL 时对苹果炭疽病菌 、小麦赤
霉病菌 、小麦根腐病菌 、烟草赤星病菌 、棉花枯萎病
菌 、玉米大斑病菌和番茄叶霉病菌的菌丝生长抑制
率均大于 90%。
137第 6 期 李会玲等:冬青卫矛内生真菌 2QR1 菌株代谢产物的杀菌活性
表 1　2QR1菌株发酵产物对病原菌菌丝生长的抑制作用
Table 1　Effects o f fermentation products of 2QR1 strain on mycelium g row th %
供试病原菌
Tested fu ngus
菌丝生长抑制率 Inhibi ti on rate of mycelium grow th
菌丝体甲醇提取物
Methanol ext ract s
of m ycelium
菌丝体乙酸乙酯提取物
Ethyl acetate ext ract s
of mycelium
菌丝体石油醚提取物
Pet roleum ether ext ract s
of m ycelium
发酵液乙酸乙酯萃取物
Ethylacetate ex t racts
of ferm entation b roth
小麦赤霉病菌
Fusa rium gram inearum 47.7 65.6 6.7 100
西瓜枯萎病菌
F.oxyspor iumf.sp.
niveum
4.7 25.0 3.3 88.3
番茄早疫病菌
Al ternaria solan i
31.3 27.8 13.1 87.1
马铃薯干腐病菌
Fusa rium solan i
32.2 50.0 12.2 83.3
玉米大斑病菌
Exseroh i lum turcicum
58.1 91.3 16.8 97.8
烟草赤星病菌
Al ternaria longip es
56.7 56.3 17.8 90.8
苹果炭疽病菌
Glomerel la cin gu lata 35.6 81.7 5.3 100
小麦根腐病菌
Bip olar is sorokiniana 40.3 55.7 7.1 98.1
棉花枯萎病菌
Vert ivi ll ium dahl iae 22.2 40.6 0.1 90.6
番茄叶霉病菌
Fulvia fu lvum 1.2 61.9 12.2 94.7
2.2　2Q R1菌株发酵产物对病原细菌的抑制作用
从表 2可以看出 , 2QR1 菌株发酵液乙酸乙酯
萃取物在质量浓度为 500 μg/mL 时 ,对枯草芽孢杆
菌 、蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径
分别为23.0 , 18.5和 16.0 mm ,且抑菌圈突出 ,而对
链球菌的抑菌活性相对较差 , 抑菌圈直径为 14.0
mm 。在质量浓度为 500 μg/mL 时 , 2Q R1 菌株菌
丝体甲醇和乙酸乙酯提取物对供试细菌的抑菌活性
较弱 ,而石油醚提取物未表现出抑菌活性 。
表 2　2QR1 菌株发酵产物对病原细菌的抑制作用
Table 2　Inhibition effects of fermenation products of 2QR1 st rain on bacteria
供试细菌
Tested bacteria
抑菌圈直径/mm Inhibit ion zone diameter
发酵液乙酸乙酯萃取物
Ethyl acetate of
ferm entation b roth
菌丝体甲醇提取物
Methanol ext racts
of mycelium
菌丝体乙酸乙酯提取物
Ethyl acetate ex t ract s
of m ycelium
菌丝体石油醚提取物
Pet roleum eth er
of mycelium
枯草芽孢杆菌
Baci llus subt i ll s 23.0(+++) 8.0(++) 14.0(+++) -
蜡状芽孢杆菌
Baci llus cereus
18.5(+++) 7.5(+) 11.5(+++) -
金黄色葡萄球菌
S.aureus 16.0(+++) 5.0(+) 7.5(++) -
链球菌
Strep tococcus
14.0(++) - 8.5(+) -
　　注:数据为 3次重复的平均值;“ +”表示抑菌圈可见;“ ++”表示抑菌圈清晰;“ +++”表示抑菌圈突出;“ -”表示无抑制作用。表 6同。
Note:All values are means of th ree replicates;“ +”means eyeab le;“ ++”mean s clear;“ +++” means prot ru dent;“ -”mean s no inhibitory
ef fect。
2.3　2Q R1菌株发酵产物对敏感真菌的毒力测定
结果
2.3.1　抑制菌丝生长的毒力测定结果　在2.1试验
结果的基础上 ,进一步测定了 2QR1菌株发酵液乙
酸乙酯萃取物对 7种供试病原菌菌丝生长的毒力 ,
结果见表 3。从表 3可以看出 ,2QR1菌株发酵液乙
酸乙酯萃取物对小麦根腐病菌 、苹果炭疽病菌和小
麦赤霉病菌菌丝生长的毒力较高 , EC50值分别为
53.6 , 63.3和 63.1 μg/mL ;对马铃薯干腐病菌菌丝
生长的毒力较低 ,EC50值为 166.3 μg/mL。
2.3.2　抑制孢子萌发的毒力测定结果　孢子萌发
的毒力测定结果(表 4)表明 ,2Q R1菌株发酵液乙酸
乙酯萃提物对玉米大斑病菌的毒力较高 , EC50值为
94.8 μg/mL ,对其他 3种病原菌孢子萌发的毒力较
低 ,EC50值为 139.1 ～ 180.1μg/mL。
138 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 35 卷
表 3　2QR1 菌株发酵液乙酸乙酯萃取物抑制菌丝生长的毒力测定结果
Table 3　Toxicity o f ethy l aceta te o f fermenation bro th o f 2QR1 strain on mycelium g row th of plant pathogenic
供试病原菌
Tested fungu s
毒力方程
T oxicity equation
相关系数 r
Correlat ion coef fi cen t
EC50 /
(μg·mL-1)
烟草赤星病菌 Alternar ia lon gipes Y = 1.777 4+1.561 3 x 0.982 2 115.9
玉米大斑病菌 Exserohi lum turcicum Y = 2.724 0+1.142 5 x 0.953 8 98.2
番茄叶霉病菌Fu lvia f ulvum Y = 1.733 2+1.6113x 0.993 4 106.5
马铃薯干腐病菌 Fusar ium solani Y = 2.037 4+1.333 9 x 0.986 0 166.3
小麦根腐病菌 Bipo lari s sorokin iana Y = 1.690 7+1.913 8 x 0.968 1 53.6
苹果炭疽病菌Glomerella cing ulata Y = 0.220 7+2.652 6 x 0.918 8 63.3
小麦赤霉病菌Fusar ium g raminearum Y = 0.838 7+2.312 1 x 0.917 1 63.1
表 4　2QR1 菌株发酵液乙酸乙酯萃提物对病菌孢子萌发的毒力测定结果
Table 4　Tox icity of ethy l acetate of fermentation br oth of 2QR1 str ain on spo re ge rmination o f plant pathogenic
供试病原菌
Tested fungu s
毒力方程
T oxicity equation
相关系数 r
Correlat ion coef fi cen t
EC50 /
(μg·mL-1)
烟草赤星病菌 Alternar ia lon gipes Y = 0.039 6+2.290 0 x 0.974 7 146.6
马铃薯干腐病菌 Fusar ium solani Y =-0.929 2+2.628 6 x 0.960 5 180.1
小麦根腐病菌 Bipo lari s sorokin iana Y =-0.374 0+2.507 2 x 0.978 3 139.1
玉米大斑病菌 Exserohi lum turcicum Y = 1.650 0+1.694 6 x 0.994 8 94.8
2.4　2Q R1菌株代谢产物对小麦白粉病的盆栽试
验结果
从表 5可见 ,2QR1 菌株发酵液乙酸乙酯萃取
物在 1 000和 2 000 μg/mL 时 ,对小麦白粉病均有
不同程度的保护和治疗作用 ,且治疗作用优于保护
作用 ,其中在质量浓度为 2 000 μg/mL 时对小麦白
粉病的保护效果达到 61.9%, 治疗效果也达到
81.6%。
表 5　2QR1 菌株发酵液乙酸乙酯萃取物对小麦白粉病的盆栽试验结果
Table 5　Contro l effect of Ethy l acetate of fermentation broth of 2QR1 st rain on Blumeria guaminis
乙酸乙酯萃取物
质量浓度/(μg·mL-1)
Ethyl acetate of fermen tation b roth
quality concent rat ion
病情指数
Disease index
防治效果/ %C on t rol effect
保护
Protected eff icacy
治疗
Therapeut ic ef fi cacy
保护
Protected eff icacy
治疗
Therapeut ic ef fi cacy
1 000 49.6 31.5 22.5 48.4
2 000 24.4 11.2 61.9 81.6
CK 64.0 61.0
2.5　2Q R1菌株初步分类鉴定结果
2.5.1　形态特征　2Q R1 菌株菌丝较细 ,有隔 ,分
生孢子头球形 ,直径 10.5 μm ,分生孢子梗直立 ,生
自气生菌丝 ,孢子梗径光滑 ,顶囊近球形 ,全部表面
可育 ,偶有小顶囊存在 ,仅顶部可育;产孢结构双层;
分生孢子球形或近球形 ,壁光滑。
2.5.2　培养特征　2QR1菌株在 PDA 培养基上 25
℃培养 7 d时 ,菌落直径为 22 ～ 26 mm;2 d 后产生
大量产孢结构 ,颜色黄褐色;有大量无色或黄色的渗
出液;菌落反面黄褐色 ,分泌大量黄褐色可溶性色
素。
2QR1菌株在查氏琼脂培养基上 25 ℃培养 7 d
时 ,菌落直径为 20 ～ 25 mm;菌落质地絮状 ,厚度中
等 ,中央稍隆起;分生孢子结构中部较密 ,边缘较稀;
颜色为橘黄色 ,后变为黄褐色 ,中央颜色较深 ,分泌
浅黄色可溶性色素。
根据文献[ 13-14]和 2Q R1菌株菌落的以上特
征初步鉴定 2QR1菌株为半知菌亚门 ,曲霉属(As-
pergi l lus)。
2.6　2Q R1菌株发酵产物有效成分的分离结果
2.6.1　杀菌活性成分的分离结果　杀菌活性成分
分离得到 10个馏分 ,其对枯草芽孢杆菌的抑制作用
见表 6。从表 6可见 ,A 3 ～ A 6 、A 8均有杀菌活性 ,但
以馏分 A 4 的杀菌活性最强 ,对枯草芽孢杆菌的抑
菌圈突出 ,且直径为 17 mm 。
2.6.2　化合物 B9 对病原真菌孢子萌发的毒力测定
结果　从表 7 可以看出 ,化合物 B9对玉米大斑病
菌 、烟草赤星病菌 、小麦根腐病菌和马铃薯干腐病菌
抑制孢子萌发的有效中质量浓度 EC50值分别为
0.8 ,1.4 , 3.3和 5.0 μg/mL。因此 ,初步断定 B9 为
2Q R1菌株发酵液乙酸乙酯萃取物部分的主要活性
物质。
139第 6 期 李会玲等:冬青卫矛内生真菌 2QR1 菌株代谢产物的杀菌活性
表 6　2QR1 菌株发酵产物各馏分对枯草芽孢杆菌的抑制作用
Table 6　Inhibition effects of fe rmena tion produc ts o f 2QR1 strain on Bacillus subtills
馏分编号
Fract ion No.
抑菌圈直径/mm
Inhibi tion zone diameter
馏分编号
Fraction No.
抑菌圈直径/mm
Inhibit ion zone diameter
A1 - A 6 7(+)
A2 - A 7 -
A3 11.5(++) A 8 6.5(+)
A4 17(+++) A 9 -
A5 12(+++) A 10 -
表 7　化合物 B9 对植物病原真菌孢子萌发的毒力测定结果
Table 7　Toxicity o f Ethy l acetate o f compound B9 on spore germination of plant pathogenic
供试病原菌
Tested fungu s
毒力方程
T oxicity equation
相关系数 r
C orrelat ion coef fi cen t
EC50 /(μg·mL-1)
烟草赤星病菌 Alternar ia long ipes Y = 4.927 1+0.456 0 x 0.906 3 1.4
马铃薯干腐病菌 Fusarium so lani Y = 4.558 7+0.629 5 x 0.978 8 5.0
小麦根腐病菌 Bipolari s sorokiniana Y = 4.727 9+0.524 5 x 0.943 7 3.3
玉米大斑病菌 E xserohi lum turcicum Y = 5.348 1+0.316 9 x 0.979 5 0.8
3　小结与讨论
本试验结果表明 , 2QR1 菌株发酵液的杀菌活
性远高于菌丝体的杀菌活性。说明该菌株代谢产物
主要集中在发酵液中 ,初步推测内生真菌在宿主体
内生活时可能主要是通过分泌其代谢产物发挥其生
物学效应的。植物内生真菌通过分泌代谢产物来抗
菌 ,这些抗菌物质可以扩散到周围 ,甚至通过植物体
内的运输系统运送到其他组织 ,这样可以扩大宿主
抵抗外源侵染的范围 。
本试验在离体条件下测定了 2Q R1菌株发酵液
乙酸乙酯萃取物对病原真菌的毒力 ,结果表明 ,
2QR1菌株发酵液乙酸乙酯萃取物既能抑制菌丝生
长 ,又能抑制孢子萌发 ,说明该菌株发酵液乙酸乙酯
萃取物对病原真菌有抗侵染和抗扩展的作用 。在测
试的病原菌中 ,2QR1 菌株发酵液乙酸乙酯萃取物
对小麦根腐病菌 、苹果炭疽病菌和小麦赤霉病菌菌
丝生长的抑制作用较强 ,而对小麦根腐病菌的孢子
萌发抑制作用不明显 。
本研究对 2Q R1菌株代谢产物只进行了室内杀
菌活性测定 ,对 2Q R1 菌株代谢产物在大田试验中
能否防治植物病害 ,有待进一步研究 。而且试验对
2QR1菌株只进行了形态学方面的鉴定 ,未进一步观
察其有性世代的产孢结构及孢子形态 。因此 ,要确定
2QR1菌株的准确归属地位 ,还应从生物学特征和分
子生物学特征两方面进行更深入的研究。此外 ,对菌
丝体及发酵液中的杀菌活性成分也需进一步研究 。
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140 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 35 卷