全 文 ：Study on the resistance of cephalospor in β-lactam ase-produc ing Enterobacter cloacae
Yu X ian1 , 2 , L ing Baodong1 , Zhou Q ixing2 , Le i Jun1 , X ie Yongen1
(1 Institu te o fM a te riaM edica in North S ichuanM edica lCo llege, Nanchong, 637007;2 Pharm aco logy Departm ent of Chongqing Unive rsity o f
M edica l Science, Chongq ing 400016)
　　ABSTRACT　Object ive:To study the de te ction ra te, the resistance phenotypes and the ampC gene o f cepha lo sporin(Am pC) β-lac-
tam ase-produc ing En te robac te r cloacae iso la tes. M ethods:15 random ly cho sen pipe rac illin-resistan t Enterobacter c loacae w ere iso lated.
AmpC β-lactam ases w ere exam ined by three dimension tes.t Ex tended spec trum β-lac tamases(ESBLs)w ere tested acco rding to NCCLS Tes.t
M IC s o f an tibac te rials w ere de term ined by two-fo ld aga r dilution m ethod. am pC genes w ere amp lified by PCR and PCR products w ere se-
quenced. R esu lts:O f 15 Enterobacter cloacae, 8 (53. 3%) iso lates p roduced Am pC β-lactam ase s and 3 (20. 0%) produced ESBLs.
AmpC β-lactam ase-produc ing isola te s we re suscep tive to im ipenem, w hile they had the differen t resistan t ra te s to the o ther an tibac te rials.
Com pa red w ith En te robacter cloacae ECLC074 am pC gene, the am pC genes o f 5 stra ins had 100% homo logy, and tho se of the rest 3 strains
had 99% hom o logy. AmpC β-lactamases o f 2 stra ins had one am ino acid residue mutagenesis. Conc lu sion:P roduction o fAmpC β-lactam as-
e s is one o f the m ain resistant mechanism s o f Ente robac te r cloacae to β-lactam antibio tics. Enterobac te r c loacae ECLC074 am pC gene is the
m ain gene sty le o fAm pC β-lac tam ases-producing Enterobacte r cloacae. Am pC β-lac tam ase-producing En te robacter c lo acae iso la tes a rem ulti-
drug resistan t frequently. Im ipenem is the appropriate antibio tic fo r the trea tm ent of the in fe ctions caused by th is kind of stra ins.
K ey words　 Enterobac te r c loacae;AmpC β-lactam ase;am pC gene;re sistance
乙酰二脱水卫矛醇对 L1210细胞 Caspase-3活性的影响
邓晓慧 1 , 范文燕 2 , 郑风劲1 , 杨锦南 2 ,刘小康 1*
(1四川大学基础医学与法医学院药理教研室 ,成都　610041;2新乡医学院形态学教研室 ,新乡　453003)
　　摘　要　目的:探讨半胱氨酶-3(Caspase-3)在二乙酰二脱水卫矛醇(diace ty ld ianhydroga lac tito l, DADAG)诱导小鼠白血病
L1210凋亡过程中的作用。方法:MTT法观察 DADAG对 L1210细胞的生长抑制作用;透射电镜检测细胞凋亡;Caspase-3试剂盒测
定细胞内 Caspase-3的酶活性。结果:DADAG对 L1210细胞有较强的体外增殖抑制作用 , 其 IC50值为 24. 6 m g /L;DADAG可诱导
L1210细胞发生凋亡及时间依赖性地升高 Caspase-3酶活性。结论:Caspase-3在 DADAG诱导的细胞凋亡中可能起重要作用。
　　关键词　二乙酰二脱水卫矛醇;L1210细胞;凋亡;半胱氨酶-3
　　90年代初 , 人们发现有一类细胞凋亡 , 存在着细胞周期的
特异性 , 表现为不同因素诱导的细胞凋亡发生在细胞周期不同
的时相 , 有的发生在 G1期 , 有的发生在 G 2期 , 还有的仅仅发生
于 S期 [ 1] 。这类细胞凋亡的发生 , 往往是细胞先被阻滞在细胞
周期的某一时相 , 然后发生细胞凋亡 , 许许多多的肿瘤化疗药
物正是通过诱导这类细胞周期特异性细胞凋亡 , 达到治疗肿瘤
的目的。我们的前期研究表明:二乙酰二脱水卫矛醇(diacety l-
dianhyd rogalac tito l, DADAG)不可逆地抑制 L1210细胞内 DNA
的生物合成 , 并使细胞发生 G2 M/ 周期阻滞 [ 2] , 但其是否诱导
L1210发生凋亡 , 尚不清楚。为此 ,我们探讨了 DADAG对 L1210
细胞的促凋亡效应 , 并进一步探讨该效应过程与 Caspase-3的关
系 , 期望为其今后的临床应用提供新的治疗靶点。
1　材料与方法
1. 1 　材料
1. 1. 1　二乙酰二脱水卫矛醇由广西中医药研究所周瑛教授
赠予 , 临用前用生理盐水溶解并配成所需浓度。
1. 1. 2　主要化学试剂:RPM IM edium 1640(RPM I-1640)培养
基:GiB co产品。甲基偶氮唑盐(噻唑蓝)[ 3-(4, 5-D im e thy-2-th i-
azo ly l)-2, 5 -d ipheny l-2H-te trazo lium-brom id, MTT] :Sigm a产品 ,
使用时用生理盐水配成 5 mg /m L的溶液 , 蔽光保存。 C aspase-3
活性检测试剂盒:CLINTECH 公司产品。
1. 1. 3 　 L1210细胞(ATTC CCL219)系小鼠淋巴细胞白血病细
胞 ,购自中国医学科学院肿瘤研究所。
1. 2　方法
1. 2. 1 　细胞培养:将 L1210细胞接种于 DAB /2小鼠腹腔内 ,
传代保种 ,临用时处死小鼠吸取腹水 ,离心收集细胞 , 经洗涤后
用含 10 % FCS的 RPM I 1640进行培养。在含 5% CO2的 37℃
温箱中培养 ,每 3d传代一次。
1. 2. 2　 细胞增殖抑制试验 (M TT法)[ 3]:取对数生长期的
L1210细胞 , 稀释成 0. 5×105个 /mL,加入 96孔培养板中 , 每孔
100μL。设生理盐水溶剂对照组和 DADAG处理组 , 每组设 4个
平行孔 ,置 37℃培养 72h, 实验终止前 4 h加入 10μL的 5 g /L
的 MTT溶液(调零组除外),再培养 4h, 测试前弃去培养液 , 加
二甲基亚砜(DM SO)100μL /孔 , 待 MTT完全溶解后 , 用酶联免
疫检测仪于 570nm波长下调零效正后测每孔的 OD值。实验重
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* 通讯作者
复 3次。抑制率 =(1-用药组平均 OD值 /对照组平均 OD值)×
100%, 并求其 IC50值。
1. 2. 3 　 透射电镜观察细胞凋亡形态 [ 4] :取对数生长期的
L1210细胞 , 用含 10%小牛血清 、100 U /m L青霉素 、100g /L链
霉素的 RPM I-1640培养液稀释成 1×106细胞 /m L, 2 mL种植于
25 mL培养瓶中 ,设溶剂对照组和 DADAG处理组 , 在 5% CO 2、
37℃条件下培养 , 于培养的 24 h收集细胞 , 磷酸缓冲液(PBS)
洗涤一次 , 将固定液加入离心后形成细胞团的离心管中 , 4℃过
夜 , 吸去固定液 , PBS冲洗一次 , 1 %锇酸固定 60 m in, 常规电镜
样品制备程序脱水 、渗透 、 LR Wh ite树酯包埋 、超薄切片 , 醋酸
铀枸橼酸铅双重染色 , JEM-1200透射电镜观察并摄片。
1. 2. 4　Caspase-3酶活性检测:取对数生长期的 L1210细胞 , 稀
释成 1×106细胞 /m L的细胞悬液 , 接种 2 mL细胞悬液于 25 mL
培养瓶中 , 加 DADAG至终浓度 50 mg /L,分别在 12 h、24 h、48 h
和 72 h收集细胞 , PBS洗涤一次 ,加 50μl细胞裂解液(4℃),置
冰上 10 m in,离心(12, 000 rpm , 5 m in),取上清加 50μl 2×反应
缓冲液和 5μl 1mmo l /L DEVD-pNA偶联底物 , 37℃水浴 2 h, 加
样至 96孔培养板 , 置酶联免疫检测仪下测 A值 , 405 nm 为波
长 , 以 A405为最终计算 A值。
1. 2. 5　统计学处理:采用 SPSS医学统计软件进行统计学处
理 , 结果均以( ±s)表示。用各组平均值行多样本间方差分析 ,
p值小于 0. 05被认为有统计学意义。
2 　结果
2. 1 　 DADAG对 L1210细胞的增殖抑制作用　DADAG对
L1210细胞有很强的抗增殖作用 , 呈浓度依赖性。在 10. 2、 12.
8、16. 0、20. 0、25. 0 m g /L浓度下 , DADAG对 L1210细胞增殖抑
制率分别为 22. 5%、27. 4%、33. 0%、36 . 9 %和 52. 7 %, IC50
值为 24. 6 mg /L(表 1)。
　　表 1　 DADAG对 L1210细胞的增殖抑制率
药物浓度(mg /L) OD值 抑制率(%)
0 1. 31 ± 0. 02 -
10. 2 1. 01 ± 0. 05 22. 5
12. 8 0. 95 ± 0. 02 27. 4
16. 0 0. 88 ± 0. 01 33. 0
20. 0 0. 82 ± 0. 04 36. 9
25. 0 0. 62 ± 0. 01 52. 7
2. 2 　透射电镜观察细胞的凋亡形态　电镜下可见:未处理的
L1210细胞核染色质均匀 , 核膜完整。 DADAG 50. 0 m g / L处理
L1210细胞 24 h后 , 细胞开始出现凋亡的特征形态学改变:细胞
固缩 , 体积变小 ,染色质浓缩 , 聚集于核膜下 , 呈境界分明的块状
或新月形小体(见图 1)。
图 1　 DADAG处理 L1210细胞 24h后的超微结构变化。
1a:对照组 ,核染色质分布均匀;1b:DADAG 50. 0mg /L处理组 ,细胞变
小 ,核染色质浓缩 、边集。放大倍数 ×5000
2. 3 　 DADAG对 L1210细胞内 Caspase-3酶活性的作用　对照
组的 Caspase-3酶活性在各时间点均无显著性差异 (P > 0.
05)。同对照组相比 , DADAG 50. 0m g /L处理 L1210细胞 12 h
后酶活性显著上升(P < 0. 01), 呈时间依赖性 , 48 h后达最高
峰 ,随后下降(见表 2)。
　　表 2　 DADAG 50. 0m g /L对 L1210细胞内 Caspase-3酶活性的影响
分组 Caspa se-3酶活性(A值)
12 h 24 h 48 h 72 h
对照组 0. 09 ±0. 03　 0. 12 ±0. 06　 0. 15 ±0. 08　 0. 16 ±0. 07　
DADAG组 6. 16 ±0. 15△ 12. 30 ±0. 26△16. 89 ±0. 43 △14. 29 ±0. 30 △
　　与对照组比较 △ P <0. 01
3　讨 论
　　Caspase是一组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 , 能特异识
别底物的 N-末端天冬氨酸酶解部位 ,并进行酶解 , 目前共发现
有 14个家族成员 [ 5] 。根据 ca spase在凋亡中的作用和 N-末端
的长度可以将其分为两大类 , 一类为起始型 caspase, 包括
caspase-8, ca spase-9, ca spase-10等 , 具有长的 N-末端 , 能启动凋
亡和调节效应型 caspase的活性。另一类为效应型 caspase, 包
括 caspase-3, caspase-6, caspase-7等 , 有短的 N-末端 , 是凋亡的
终结者 [ 6] 。 ca spase-3是凋亡途径下游操作底物酶解的关键蛋
白酶 ,是凋亡的执行器。 C aspa se-3在活细胞中以酶原的形式存
在 ,一旦被激活 ,即可以形成以 2个大亚基和 2个小亚基组成的
有活性的 caspase-3, 荧光 FAM 标记的 caspase-3特异性的抑制
剂 DEVD-FMK(FAM-DEVD-FMK)可以与 caspa se-3的活性中心
相结合 ,通过检测荧光强度 , 可以证明 ca spase-3是否被激活。
通过体外抗增殖实验结果证实 DADAG对 L1210增殖有显著的
抑制作用且具有明显的剂量依赖性。与此同时 , 透射电镜结果
发现靶细胞出现了细胞固缩 、核染色质边集成新月形小体等凋
亡的形态学特征 , 表明 DADAG可诱导小鼠白血病 L1210细胞
凋亡。 Caspase-3酶活性试剂盒检测结果显示 DADAG可以诱导
caspase-3活性的增强 , 因此可以推测在 DADAG 诱导的小鼠
L1210细胞的凋亡过程中 , caspase-3起到了重要作用 , DADAG
可能是通过对细胞内存在的多种不同的激活和失活 ca spase的
途径产生影响而发挥作用的。
参考文献
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160 四川生理科学杂志 2005;27(4)
Effecct of d iacetyld ianhydrogalactitol on the activity ofCaspase-3 in L1210 cells
Deng X iaohui1 , FanW enyan2 , Zheng Feng jin1 , Yang JinNa2 , L iu X iaokang1
(1 Departm ent of Pha rm aco logy, schoo l of P reclinica l and Forensicm edicine, S ichuan University, Chengdu 610041;2 Depa rtm ent ofM orpho lo-
gy, Xinx iangM edical Co llege, X inx iang 453003 China)
　　Abstrac t　 Object ive:To inve stig ate the ro le o f C aspa se-3 in DADAG-induced apoptosis of m ouse L1210 leukem ia. M ethods:The
g row th inhibiton was analysed byMTT assay. DADAG-induced apoptosis in L1210 cellsw as iden tified by e lec tron m ic roscopy;Caspase-3 ac-
tiv ity wa sm easured byApoA lert CPP32 colorime tric assay ki.t Resu lts:DADAG showed po tent an tipro life ra tion on L1210 ce lls w ith the IC
50
o f 24. 6 m g /L in vitro. M eanwh ile apop to sis w as induced in targe ted cells. DADAG tim e-dependently increa sed the activ ity of Caspase-3.
Conc lu sion:Caspase-3 m ight play an im po rtan t ro le in DADAG-induced apoptosis o f L1210 ce lls.
K ey words　diace ty ldianhydroga lactitol caspase - 3 apop to sis L1210 ce lls
医院感染革兰阴性杆菌的耐药性监测
康梅 ,郑沁 ,陈慧莉 ,过孝静 ,陈知行 ,杜晓青 ,陈文昭 ,吕晓菊
(四川大学华西医院实验医学科临床微生物室 ,四川 成都　610041)
　　摘　要　目的:监测我院病房分离的 100株革兰阴性杆菌对 12种抗生素的耐药率 ,以指导临床用药。方法:采用 E test药敏
试验测定我院分离的 100株革兰阴性杆菌对 12种抗生素的最低抑菌浓度(M IC)。结果:这 12种抗生素中总耐药率最低的是亚胺培
南(7%), 头孢吡肟(13%), 舒普深(14%), 阿米卡星(14%);49株大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌中 , 超广普 β -内酰胺酶的发生率为
43%;大肠杆菌对环丙沙星的耐药率高达 76. 5%;大肠埃希菌 , 肠杆菌属 , 不动杆菌 , 克雷伯菌属对亚胺培南的耐药率小于等于 5.
9%。结论:亚胺培南 , 头孢吡肟 ,舒普深 , 阿米卡星对革兰阴性杆菌的耐药率最低。
　　关键词　耐药性;革兰阴性杆菌;医院感染
　　革兰阴性杆菌是医院感染的主要病原菌 , 是导致感染性休
克的重要原因。其中一部分患者因严重感染 , 引起各种并发症
或多器官功能衰竭 , 最终导致死亡。随着广谱抗生素的广泛应
用 , 抗生素的耐药问题日趋严重 ,因此 , 监测常见革兰阴性杆菌
对常用抗生素的耐药情况是十分必要的。为了探讨我院住院
病人中常见革兰阴性杆菌的分布及耐药情况 , 用 E-test方法对
2003年 9月 ～ 10月连续分离到的 100株非重复革兰阴性杆菌
对于 12种常用抗生素的最低抑菌浓度(M IC)进行了监测 ,并对
其耐药性进行了分析 ,现将结果报告如下。
1　材料和方法
1. 1　材料
1. 1. 1　菌株来源
1. 1. 1. 1　临床菌株　100株细菌(其中包括大肠埃希菌 34株 ,
阴沟肠杆菌 16株 , 肺炎克雷伯菌 15株 ,鲍曼不动杆菌 14株 ,铜
绿假单胞菌 12株 , 洛菲不动杆菌 3株 , 产气肠杆菌 2株 ,产酸克
雷伯菌 2株 , 嗜麦芽窄食假单胞菌 2株)分离自痰 , 胆汁 , 尿 ,血
液 , 胸腹腔引流物等临床标本(2003年 9月 ～ 10月)。
1. 1. 1. 2　质控菌株　大肠埃希菌 ATCC25922, 铜绿假单胞菌
ATCC27853均由美国默克公司提供。
1. 1. 2　抗生素来源　 E-test条为 AB B iodisc公司提供;抗生素
为亚胺培南( IPM), 头孢他啶(CAZ), 氧哌嗪青霉素 /他唑巴坦
(TZP),环丙沙星(C IP ), 庆大霉素(GEN),头孢曲松(CRO), 呃
他培南 (ETP), 阿米卡星 (AMK), 头孢吡肟 (FEP), 舒普深
(CSL),头孢噻肟 (CTX), 替卡西林 /克拉维酸(TCC), 头孢他
啶 /克拉维酸(TZL), 头孢噻肟 /克拉维酸(CTL)。 E te st条浓度
范围为 0. 016 ～ 256ug /m l, 但亚胺培南 、环丙沙星为 0. 002 ～
32ug /m l。
1. 1. 3　药敏培养基为 AB B iodisc公司提供的 MH药敏培养基
(150mm , 4mm)。
1. 2　方法
1. 2. 1　病例收集及确认　分析选中的 100株菌的病人信息 , 根
据卫生部医院感染判定标准 [ 1] , 确定筛选纳入的此 100株菌均
为院内感染菌 ,并确定此 100株菌株来自 100名非重复临床住
院病人 ,然后详细记录此 100名病人的样本送检日期 ,送检号 ,
病历号 ,所在病房 , 姓名 ,标本类型 , 以及在送检前 2天内该病人
的抗生素使用情况。
1. 2. 2　药敏试验　采用 2003年美国临床实验室标准化委员会
(NCCLS)推荐使用的琼脂扩散法 [ 2] 。将相当于 0. 5个麦氏单
位浓度的纯菌悬液用无菌棉拭子均匀涂布在 4mm厚 150mm 直
径的药敏平板上 , 贴 Etest条 6条。 35℃孵育 16 ～ 18小时后读
结果。从椭圆形的抑菌环与 E试纸条的交界处上的刻度读出
M IC, 单位为 ug /m l。 结果可按美国临床试验室标准委员会
(NCCLS)规定将 M IC值判定为敏感 , 中敏或耐药。同时用大
肠埃希菌 ATCC25922, 绿脓假单胞菌 ATCC 27853作质控监测。
如果克雷伯菌属和大肠杆菌对于头孢他啶或者头孢噻肟的 M IC
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