全 文 ：MS) ，是目前最有效进行无机元素含量测定技术之一，
采用微波消解进行样品的前处理，具有快速、简便，消
解完全的特点;而 ICP － MS 法，因具有可对无机元素
进行同时分析，又干扰少、精密度高、分析速度快、线性
范围宽等优点。因此，已多用于动物药材中有害元素
分析［2 － 6］。土鳖虫中有害元素的分析尚未见报道。本
实验结合微波消解技术，利用 ICP － MS 法对土地鳖商
品药材中的 5 种有害元素的含量进行了测定，为土鳖
收稿日期:2010 － 01 － 07
基金项目:国家自然科学基金资助课题(30571315)
作者简介:王建娜(1962 －) ，女，河南南阳人，副主任医师，学士，主要从
事中西医结合防治肿瘤研究。
虫商品药材的相关研究提供了基础参考数据。
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狗舌草总黄酮对 L1210细胞的体外作用研究
王建娜1，司红丽2
(1. 西北农林科技大学医院，陕西 杨凌 712100;2．山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250014)
摘 要:目的:研究狗舌草总黄酮对 L1210细胞体外生长和细胞周期的影响。方法:用细胞计数法绘制细胞生长曲线，
用细胞平均倍增时间(mPDT)检测 L1210细胞增殖速度，台盼蓝拒染率测定细胞存活率，流式细胞术分析细胞周期。结果:
狗舌草总黄酮能抑制 L1210细胞生长且呈浓度依赖性，对 L1210细胞的增殖具有显著抑制作用。S期细胞数目显著增加，并
引起 S － G2 阻滞，从而阻断细胞周期的正常发展。结论:狗舌草总黄酮对 L1210细胞体外生长、增殖有抑制作用，对细胞周
期有阻滞作用，显示一定的抗肿瘤活性。
关键词:淋巴性白血病 L1210细胞;细胞增殖;流式细胞术;总黄酮;狗舌草
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1000 － 1719(2010)09 － 1788 － 03
Effects of the Total Flavonoids from Tephroseris kirilowii Turcz． Holub On the L1210 cells in vitro
WANG Jian-na1，SI Hong-li2
(1． The Hospital of Northwest A and F University，Yangling 712100，Shaanxi，China;
2． College of Life Sciences，Shandong Normal University，Jinan 250014，Shandong，China)
Abstract:The Effects of the total flavonoids(TF)from Tephroseris kirilowii Turcz． Holub on the growth of L1210 cells in vitro
were studied through the methods of growth curve drawed by the cell caculating，the growing rate of the L1210 cells examinited by
mPDT，the rate of the cell life detected by the resist － dye rate of trypan blue，and the cell cycle analysed by the flow cytometry．
The results showed that the TF inhibit the growing activity of L1210 cells and the inhibition rate had a positive interrelationship with
TF concentration，and the cell proliferation was inhibited significantly． The TF can increases the amount of S phase L1210 cell great-
ly and blockes the cell of S phase to the G2 phase so that it hindered the evolution of cell cycle． It concluded that the TF from Te-
phroseris kirilowii Turcz． Holub has certain effects to the growing and proliferation of L1210 cells in vitro，also inhibits the cell cy-
cle． These results indicted that TF has the antitumor activity． Objective:Methods:Results:Conclusion:
Key words:L1210 cells;cell proliferation;flow cytometry，total flavonoids;Tephroseris kirilowii (Turcz．)Holub;．
狗舌草(Senecions Kirilowii Herba)为菊科狗舌草
属植物，主要分布于我国东北、华北和西北地区。全草
入药，味苦，性微甘、寒，有清热解毒、利水之功效;用于
治疗发热、贫血、出血、肝脾和淋巴结肿大等［1］。狗舌
草的主要有效成分是生物碱和黄酮类化合物［2 － 4］，具
有解痉抗溃疡作用，对白血病细胞、恶性网状细胞肉瘤
及皮肤癌有较强的抑制作用［5］。狗舌草 60%乙醇提
取物无长期毒性，无蓄积毒性，无致突变性和致畸胎
性［6］;狗舌草总黄酮对三种肿瘤细胞(Hep － G2，HCC
和 L1210细胞)的生长抑制率均随浓度升高而增高
［7］。
本文旨在提取分离狗舌草总黄酮，深入研究其抑制淋
巴白血病 L1210细胞体外生长和增殖的作用，为深入研
究其抗肿瘤机理提供科学依据。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 狗舌草 狗舌草采自陕西省陇县关山牧场，经
·8871· 辽宁中医杂志 2010 年第 37 卷第 9 期
DOI：10.13192/j.ljtcm.2010.09.160.wangjn.070
中科院西北植物研究所杨金祥研究员鉴定。全草经除
杂、阴干、粉碎，贮存于干燥阴凉处备用。
1. 1. 2 狗舌草总黄酮 取狗舌草粉末，用适量工业甲
醇浸泡得甲醇浸出液，回收甲醇得总浸膏。浸膏用适
量热水溶解，过滤除不溶物后得水溶液;水溶液用适量
石油醚萃取，弃去石油醚萃取液，即除去叶绿素等脂溶
性杂质;水相再用适量乙酸乙酯萃取，回收萃取液中的
乙酸乙酯，得狗舌草总黄酮(TF)［3 － 4］。
1. 1. 3 试验溶液配制 用生理盐水将 TF 配成 0. 1、
1. 0、10. 0、100. 0 和 1000. 0μg · mL －1 五个浓度，
0. 22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
1. 1. 4 淋巴性白血病 L1210细胞 淋巴性白血病 L1210
细胞由第四军医大学实验动物中心细胞室提供。经复
苏，给 BALB /C小鼠腹腔注射，7 天后抽取腹水，洗除
红细胞，台盼蓝染色计数，加适量 RPMI － 1640 完全培
养液，备用［9］。
1. 2 主要试剂及仪器
RPMI －1640(美国 Hyclone 公司) ;胎牛血清(伯安
生物工程有限公司) ;胰蛋白酶(伯奥生物科技公司) ;
台盼蓝(Trypan blue，中国医药集团上海化学试剂公
司) ;碘化丙啶(propidium iodide，PI，Sigma 公司) ;Triton
X － 100(Biomol 公司) ;TRIS 碱(Promega 公司) ;DNA
prep kit染色剂，其余试剂为国产分析纯。96 孔培养板
(美国 Corning公司) ;SW － CJ －1F型净化工作台(苏州
净化设备厂) ;CO2 培养箱(日本 Sanyo 公司) ;COIC 倒
置显微镜(重庆光学仪器厂) ;80 － 2 型台式离心机(上
海手术器械厂) ;EPICS ELITE ESP型流式细胞仪(Flow
Cytometer，FCM，美国 COULTER公司)。
1. 3 方法
1. 3. 1 细胞生长曲线测定 用含 10%胎牛血清的
RPMI － 1640 培养基，将 L1210细胞浓度调至 1 × 10
4 个 /
mL，每瓶 1mL。置于 5% CO2、37℃、饱和湿度培养
［8］;
24h后，将制备的 5 种 TF溶液各 0. 1mL分别加入 L1210
细胞培养物中，使终浓度分别为 0. 01，0. 1，1. 0，10. 0
和 100. 0μg·mL －1，每一浓度设 5 个重复，生理盐水做
空白对照组，置培养箱内继续培养 8 天。
将加 TF溶液当天记为第 0 天，用白细胞计数法每
天测定各培养液中的细胞浓度并计算平均值。以培养
天数为横坐标，细胞浓度为纵坐标，将每天所得的细胞
浓度填写在坐标纸上，连各点成曲线，即得细胞生长曲
线。
1. 3. 2 细胞平均倍增时间(mPDT)测定 在 L1210细胞
对数生长期，每 2h 计数各组细胞一次。用下式计算
L1210细胞平均倍增时间(mean population doubling time，
mPDT) :
mPDT =(ΔT × log2)/ log(Ct /C0)
(其中，C0:为对数生长期初时的细胞浓度;Ct:为
细胞生长到 t时的细胞浓度;ΔT:为 t时和初时之小时
差。)差异显著性用 t检验进行分析。
1. 3. 3 台盼蓝拒染率 测定活细胞率将 1 × 104 个 /
mL L1210细胞培养液接种于培养板中，每孔 1mL;在
37℃、5%CO2 培养 24h后，加入制备的 5 种 TF溶液各
0. 1mL，各设 5 个重复;生理盐水做空白对照孔，继续
培养 2 天。将 L1210细胞摇匀后，各取细胞悬液 0. 2mL，
加 0. 4%台盼蓝液 0. 1mL，Hank s 平衡盐水 0. 3mL。
充分混合后室温放置 10min。用毛细滴管将台盼蓝 －
L1210细胞悬液滴在血细胞计数板上，按计数白细胞的
方法观察、计数 200 个细胞，凡折光性强而不着色者为
活细胞，染上蓝色者为死细胞。按下式求出活细胞率，
即 L1210细胞台盼蓝拒染率
［10］。
活细胞率 =(未染色细胞数 /细胞总数)× 100%
1. 3. 4 流式细胞仪检测 L1210细胞 周期将 5. 0 × 10
5
个 /mLL1210细胞浓度接种于 100mL培养瓶内，培养 24h
后，加入 TF溶液，使浓度最终为 10μg·mL －1 TF，生理
盐水做空白对照组。继续培养 24h 后，用 PBS 吹打细
胞成单细胞悬液，离心，冷 PBS 洗 2 遍，70%乙醇固定
24h，经碘化丙啶染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。每
样品测定 20000 个细胞。对细胞中的 DNA 含量做单
参数测定，经 PHOENIX Multicycle 3. 11 软件处理，计
算出各细胞周期时相百分比。
2 结 果
2. 1 狗舌草总黄酮对 L1210细胞生长的影响(图 1)
图 1 表示不同 TF 浓度对 L1210细胞的生长影响的
变化曲线。当 TF 浓度在 0. 01μg·mL －1时，L1210细胞
的生长基本未受到影响。浓度为 0. 1μg·mL －1时，细
胞数量明显减少，聚集现象加剧，有大量的细胞碎片出
现。浓度为 1. 0μg·mL －1时，细胞数量骤减，呈团块形
式出现，碎片较多，生长速度减慢。浓度为 10. 0μg·
mL －1时，可见大量的细胞碎片，存活的细胞数量较少，
细胞的生长速度骤减，约相当于对照组的二分之一。
浓度为 100. 0μg·mL －1时，表现出较强的细胞中毒现
象，细胞生长基本停滞，全部培养液变混浊，仅有零星
活细胞存在。
图 1 狗舌草总黄酮(TF)对 L1210细胞生长曲线变化(n = 5，珋x ± s)
2. 2 狗舌草总黄酮对 L1210细胞增殖速度的影响
见表 1。
表 1 加 TF后 L1210细胞倍增时间(mPDT)的变化(n = 5，珋x ± s)
对照
(h)
(0. 01μg·mL － 1
TF) (h)
(0. 1μg·mL － 1
TF) (h)
(1μg·mL － 1
TF) (h)
(10μg·mL － 1
TF) (h)
(100bμg·mL － 1
TF) (h)
11. 14 ± 0. 23 11. 44 ± 0. 24 12. 20 ± 0. 20# 12. 37 ± 1. 39# 13. 04 ± 2. 18※ 13. 47 ± 0. 79※
注:#P ＜ 0. 05，※P ＜ 0. 01。
表 1 所示不同 TF 浓度对 L1210细胞的增殖速度的
影响。TF浓度在 0. 01μg·mL －1时，L1210细胞的增殖基
本未受到影响，mPDT 基本没有增加(P ＞ 0. 05)。在
0. 1 和 1μg·mL －1时，L1210细胞的生长速度明显减慢，
mPDT明显增加(P ＜ 0. 05)。浓度为 10μg·mL －1时，
L1210细胞的生长缓慢，mPDT 极显著增加(P ＜ 0. 01)。
浓度为 100μg· mL －1 时，mPDT 极显著增加(P ＜
·9871·辽宁中医杂志 2010 年第 37 卷第 9 期
0. 01) ，表现出较强的细胞毒性，使 L1210细胞生长基本
停滞。
2. 3 狗舌草总黄酮对 L1210细胞的活性影响
见表 2。
表 2 不同 TF浓度对 L1210细胞存活率影响(%，n = 5，珋x ± s)
TF浓度 0μg·mL －1 0. 01μg·mL －1 0. 1μg·mL －1 1. 0μg·mL －1 10. 0μg·mL －1 100. 0μg·mL －1
活细胞率(%) 94. 67 ± 3. 15 83. 85 ± 4. 73# 82. 6 ± 2. 08# 80. 32 ± 0. 07# 76. 7 ± 4. 1※ 34. 62 ± 1. 35※
注:#P ＜ 0. 05，※P ＜ 0. 01。
表 2 所示不同 TF浓度对 L1210细胞的存活率影响。
不同浓度 TF均可显著抑制 L1210细胞的活性，且随着剂
量的增加活细胞率减少。其中 0. 01、0. 1 和 1. 0μg·
mL －1的狗舌草总黄酮作用 48h后可显著抑制 L1210细胞
活性(P ＜ 0. 05) ;10. 0 和 100. 0μg·mL －1的狗舌草总
黄酮作用更明显，活细胞率分别为(76. 7 ± 4. 1)%和
(34. 62 ± 1. 35)%，与空白对照组为(94. 67 ± 3. 15)%
相比差异极显著(P ＜ 0. 01)。说明狗舌草总黄酮能够
抑制 L1210细胞活性，且该作用具有剂量依赖性。
2. 4 狗舌草总黄酮对 L1210细胞周期的影响
图 2、图 3分别表示对照组和 TF组 L1210细胞的细胞
周期。10μg·mL －1TF作用 L1210细胞 24h后，S期细胞数
目显著增加，而 G0 － G1期(P ＜0. 01)和 G2 － M期细胞
减少，引起 S － G2阻滞，出现 S期的细胞不能正常向 G2
期发展，从而阻断了细胞周期的正常进行。
图 2 对照组 L1210细胞的细胞周期
图 3 TF组 L1210细胞的细胞周期
3 讨 论
3. 1 TF对 L1210细胞生长的影响
淋巴性白血病 L1210细胞在体外悬浮培养系统中，
呈指数式生长和函数生长两种方式。因此，培养第 1
天，细胞增加很慢，以后则迅速增殖，第 5 天进入高坪
期，随后逐渐下降。
本试验结果表明，低浓度 TF与淋巴性白血病 L1210
细胞共培养时，有抑制细胞活性的作用，随着 TF 浓度
的增加，其细胞毒性越来越强;当 TF浓度为在 10μg·
mL －1时具有较强的抗癌活性，且细胞毒性相对较小。
3. 2 TF对 L1210细胞周期的影响
细胞周期是单个细胞分裂为两个细胞的过程，本
研究中，流式细胞术检测表明，10. 0μg·mL －1 TF 引起
S期 L1210细胞数目显著增加，而 G0 － G1 期和 G2 － M
期细胞减少。该结果与已报道的狗舌草 60%乙醇提
取物(1. 0μg·mL －1)及槲皮素(1. 0μg·mL －1)与 L1210
细胞作用 24h 后，G0 － G1 期细胞的百分比较对照组
明显升高相反。其原因可能是 TF 具有促进 L1210细胞
DNA损伤、导致细胞死亡的作用，从而细胞未能通过
chk，使细胞停止下来进行修复，引起 S － G2 阻滞，则 S
期的细胞不能正常向 G2 期发展，使 S 期的细胞相对
较多，从而阻断了细胞周期的正常发展，细胞增殖受
阻，表现出杀伤肿瘤细胞的作用。试验证明，一定剂量
的 TF具有明显的体外抑制淋巴性白血病 L1210细胞的
作用，且具有明显的剂量依赖性。这与临床上应用狗
舌草对白血病细胞抑制作用、体外美蓝法筛选狗舌草
对白血病 L615 细胞有抑制作用、细胞呼吸器法筛选证
明狗舌草对白血病有较为明显的抑制作用相符合。
3. 3 TF的抗肿瘤作用
近年来，随着对黄酮类化合物的抗肿瘤活性研究
逐步深入，表明它不仅有抗癌作用，而且是一些致癌
剂、促癌物的抑制物，特别是含有多羟基或多烷基取代
的黄酮类化合物具有细胞毒和抗肿瘤活性［9］。本试验
表明，狗舌草总黄酮能抑制白血病 L1210细胞生长，具有
一定细胞毒作用，其抑制作用与浓度呈相关，且能阻断
细胞周期的正常发展，使细胞增殖受阻，有一定杀伤肿
瘤细胞的作用。因此，狗舌草可以作为一种抗癌中草
药物进行研究和开发利用。
致谢:衷心感谢第四军医大学实验动物中心提供
淋巴性白血病 L1210细胞和在试验过程中给予的指导和
帮助。
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