全 文 ：胶 东 卫 矛 再 生 体 系 的 建 立
桑新 华1 , 2 ,张秀 海2 ,任桂 芳3 ,黄丛 林2 ,张潞 生1
(1.中国农业大学农学与生物技术学院 ,北京 100089;
2.北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心 , 100094;3.北京市园林科学研究所, 100102)
　　摘　要:通过对胶东卫矛不同外植体来源 、不同激素种类以及激素配比的比较 ,初步建立了胶东卫矛组
织培养及再生体系:胶东卫矛茎段愈伤组织诱导培养基为 MS+6-BA 0.5 mg/ L(毫克/升)+IBA 0.05 mg/
L(毫克/升),分化培养基为 MS+6-BA 0.5 mg/ L(毫克/升)+IBA 0.05 mg/ L(毫克/升),生根培养基为 MS
+NAA 0.4 mg/ L(毫克/升)+IBA 0.1 mg/ L(毫克/升);在此基础上进一步进行了抗生素敏感性实验 , 确定
了胶东卫矛茎段转化的卡那霉素筛选浓度为 50 mg/ L(毫克/升), 羧苄青霉素浓度为 200 mg/ L(毫克/升),
为胶东卫矛的遗传转化奠定了基础。
关键词:胶东卫矛;茎段;组织培养
中图分类号:S687.2　文献标识码:B　文章编号:1001-0009(2005)05-0076-03
　　胶东卫矛(Euonymus kiautschov icus Loes.)是卫矛科半常
绿灌木 , 其叶色碧绿青翠 ,耐修剪 , 是一种优良的绿化观赏树
种;它不仅适用于庭院 、甬道 、建筑物周围 , 而且也已经广泛用
于主干道的绿化。另外 , 由于能净化空气 ,抗烟吸尘 ,又是污
染区理想的绿化树种。然而 ,由于目前水资源愈加缺乏 、冬季
恶劣天气的加剧和城市绿化的迅速发展 , 胶东卫矛抵抗逆境
(干旱 、寒冷 、盐碱等)的能力有待提高。植物分子生物学和基
因工程技术的飞速发展为提高植物的抗性带来了新的思路 ,
通过转化一个与抗性有关的功能基因或调节基因 , 改变植物
在逆境下的生理生化反应 , 可达到提高植物抗性的目的[ 1] 。
此项工作的前提条件是要建立稳定高效的再生体系。本文对
胶东卫矛的组织培养和遗传转化体系进行了系统的研究 , 以
其为胶东卫矛的转化建立一个高效 、实用的技术系统。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料胶东卫矛来源于北京市园林科学研究所。
1.2　方法
1.2.1　外植体的获得　取温室栽培的胶东卫矛幼嫩枝条 ,剪
掉叶片 ,用自来水冲洗干净 , 先用 70%酒精消毒 30 s(秒), 然
后用无菌水冲洗 ,再用 10%次氯酸钠分别消毒 5 min、10 min 、
15 min(分钟), 然后再用无菌水冲洗 6 次 , 最后剪成带腋芽的
茎段[ 2] ,接种在腋芽增殖培养基上(MS +6-BA 2 mg/ L+
NAA0.2 mg/ L(毫克/升)), 4 d(天)后观察消毒的效果。每个
处理 10 瓶 , 每瓶 3个茎段重复。
1.2.2　愈伤组织的诱导及其分化　以 MS 为基本培养基 ,进
行不同浓度 、不同种类的激素的处理(表 1)。
1.2.3　生根培养基　采用 MS 基本培养基 , 分别添加不同浓
度的 IBA 和 NAA ,共计 12 个处理。 每处理 10 瓶 , 每瓶 3 个
重复。
1.2.4　抗生素敏感性试验　根据离体培养结果 , 筛选出适宜
的分化培养基 ,附加不同的抗生素进行敏感性试验。将外植
体置于附加不同浓度的卡那霉素(Km)(0 、30、40 、50、75 、
＊基金项目:北京市科委合同项目(H020620110130)和北京市留学回
国人员项目资助.
收稿日期:2005-05-08
　　表 1　不同激素种类和浓度的组合
培养基
编号
2 , 4-D
(mg/ L)
KT
(mg/ L)
6-BA
(mg/ L)
IBA
(mg/ L)
1 2
2 2 1
3 4
4 4 1
5 4 2
6 1
7 1 0.5
8 0.5
9 1.5 0.5
10 1 1
11 1 0.05
12 0.5 0.05
13 0.05
100 mg/ L(毫克/升))的培养基上 , 另取一部分经过农杆菌侵
染后的外植体接种于附加不同浓度的羧苄青霉素(Cb)(0
mg/ L、100 mg/ L、200 mg/ L、300 mg/ L、400 mg/ L、500 mg/ L
(毫克/升))的培养基上 , 定期记录外植体褐变情况。
1.2.5　幼苗的移栽　将长 3 cm ～ 5 cm(厘米)的芽梢转入生
根培养基 , 形成完整的植株后 , 转入蛭石和营养土中生长 , 最
后大田栽培。所有培养基都采用固体培养 ,凝胶浓度为5 g/ L
(克/升),蔗糖浓度为 30 g/ L(克/升), pH 值为 5.8 , 光照
14 h/d(小时/天), 培养温度为 25 ℃。
2　结果与分析
2.1　外植体的来源
分别选择 5%、10%、15%的 NaClO 溶液消毒胶东卫矛带
腋芽的茎段 , 3 d(天)以后经 5%NaClO 处理的外植体开始污
染 ,而经 10%、15%NaClO 处理的外植体则没有发现污染。
考虑到 NaClO 对外植体的副作用 , 试验最终采用 10%NaClO
消毒胶东卫矛茎段。将消毒好的外植体接入腋芽增殖培养
基 , 1 周左右 , 茎段叶腋处出现腋芽突起 , 2 周后芽长大 ,叶展
开 , 30 d(天)苗高 5 cm ～ 6 cm(厘米)。将伸长的腋芽切成短
段移入 MS 培养基继代培养[ 4] 。
2.2　不同激素配比和利用不同外植体诱导胶东卫矛愈伤组
织以及分化苗的比较
分别用茎段和叶片做外植体 ,接种于 1-13 号培养基上 ,
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·生物技术·　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　北方园艺 2005(5):76～ 78
每个组合接种 10 瓶 , 每瓶接种 10 个外植体块。 20 d(天)转
换一下培养基 ,观察实验结果如图。
利用不同外植体胶东卫矛愈伤组织诱导情况图
　　系列 1代表茎段在培养基上培养 15 d(天)以后的生长情况 ,系列
2代表茎段在培养基上培养 40 d(天)以后 ,系列 3代表叶片在培养基
上培养 40 d(天)以后的生长情况
2.2.1　2 , 4-D 和 KT 对叶片和茎段愈伤组织诱导的影响　
根据调查结果 , 15 d(天)以后 , 茎段在 1 号和 3 号培养基上发
生频率为 100%, 继续培养 , 愈伤组织加大 , 疏松 , 柔软 ,
0.5 cm ～ 1 cm(厘米)大小不等 。叶片在 1号培养基上愈伤组
织的诱导率为 80%。 40 d(天)以后 , 茎段在这 5 种培养基上
都诱导出愈伤 , 叶片在 1 和 3 两种培养基上愈伤组织的发生
频率也达到 100%, 但是都没有分化苗出现。
2.2.2　6-BA 和 IBA对叶片和茎段愈伤组织诱导的影响　
根据调查结果 , 15 d(天)后茎段在各培养基上愈伤组织发生
频率分别为 10%, 18%, 23%, 10%, 12%, 27%, 60%, 10%;
叶片在各个培养基上的愈伤组织发生频率均为 0。 继续培
养 ,愈伤量增加 , 40 d(天)之后 , 愈伤组织发生率都可以达到
100%。只有在 11 号培养基上分化出苗。以叶片做为外植
体 ,切口处开始也分化出愈伤 , 但速度较慢 , 平均诱导率为
12%,而且没有分化出苗。由此可见 , 胶东卫矛茎段更适合于
愈伤组织的诱导以及分化苗的产生。从理论上讲 , 植物细胞
具有全能性 ,所以无论选用植株上哪一部位都能诱导成株 ,但
是研究表明 ,相同植物的不同组织或者部位在器官发生能力
上有相当大的区别 ,这一结果也验证了以往的一些报道[ 5 , 6] 。
2.2.3　愈伤组织的种类与成苗　根据颜色和质地的疏密 ,愈
伤组织大致可以分为黄褐色 、疏松 、透明和碧绿 、致密两种类
型。由 2 , 4-D和 KT 诱导的愈伤组织质地较为疏松 ,由表面
光滑 、呈半透明的球状体组成 , 具有胚性愈伤的外观特征 , 但
不能分化成苗。而由 6-BA 和 IBA 诱导的愈伤组织多为浅
绿色至深绿色 ,质地较为致密 , 表面粗糙 ,呈块状 , 不用更换培
养基 ,这种愈伤组织可直接分化出不定芽 , 逐渐长成小芽丛。
2.3　不同激素种类和浓度配比对生根的影响
胶东卫矛试管苗高达 3 cm ～ 5 cm(厘米)时 , 转接到不同
激素浓度配比的生根培养基上。
　　根据观察:茎段在 10 d(天)后基部出现不定根 ,随着时间
的延长 , 根不断加粗 , 形成带有根毛的辐射根 ,茎段逐渐成为
完整的植株;14 d(天)后 , 生根量达高峰。其中 M12 号培养
基生根率最高 , 达 100%;从根的质量看 , 根较粗壮 、数量也
多 、长势也好。而 M1 、M3 号培养基内的苗虽须根多 、生长也
较好 ,但根细长。其它培养基中根量少 , 愈伤组织多 ,不适合
做生根培养基。而且激素浓度越高 , 植株切口处产生的愈伤
组织块越大 ,反而抑制了生根。
2.4　抗生素敏感性试验
基因转化操作过程中 ,抗生素浓度的筛选是至关重要的
　　表 2　植株在不同激素配比下生根的情况
编号 IBA(mg/ L)
NAA
(mg/ L)
生根率
% 生长势
愈伤组织
状况
M 1 0 0 75 ++++ -
M 2 0 0.5 50 +++ --
M 3 0.1 0 75 ++++ --
M 4 0.1 0.5 40 ++++ ---
M 5 0.1 1 30 ++ ----
M 6 0.5 1 0 ++ ----
M 7 0.5 0.5 0 ++ --
M 8 0.5 0 50 +++ -
M 9 0 1 25 +++ -
M 10 0.3 0.5 0 ++ ----
M 11 0.5 0.75 0 ++ ----
M 12 0.1 0.4 100 ++++ -
　　注:++示生根情况一般 , +++示较好 , ++++示很好;-示
苗基部无愈伤块 , --示愈伤块直径小于 0.4 cm(厘米)。 ---示
愈伤块直径小于 0.8 cm(厘米。.----示愈伤块直径大于或等于
0.8 cm(厘米)。
一环。适合的抗生素浓度既要能有效地抑制非转化细胞生
长 , 又要不影响转化细胞的正常生长。因此建立基因转化受
体系统时测定植物材料对抗生素的敏感性很有必要 , 必须针
对不同的受体材料确定适合的筛选浓度。
表 3　愈伤组织在不同卡那霉素(Km)浓度下分化的情况
卡那霉素浓度(mg/ L) 生长分化情况
30 分化减慢 , 80%持绿 , 20%褐化
40 分化减慢 , 60%持绿 , 40%褐化
50 分化减慢 , 10%持绿 , 90%褐化
75 分化逐步停滞 ,全部褐化
100 分化逐步停滞 ,全部褐化
　　将胶东卫矛愈伤组织接种在不同浓度卡那霉素的选择培
养基上 , 30 d(天)后观察褐变情况。由试验结果看出 ,愈伤组
织受体系统适合在较低浓度的卡那霉素培养 ,当卡那霉素浓度
达到 30 mg/ L(克/升)时, 愈伤组织还可以分化 , 只是生长明显
放慢 ,有部分褐化;当卡那霉素浓度达到 50 mg/ L(克/升)时 ,
褐化明显增加;而浓度至 100 mg/ L(毫克/升)时 , 基本上都死
亡。高浓度的抗生素能迅速杀死细胞, 而死细胞对周围细胞的
生长有强烈的抑制作用 , 不利于转化细胞生长。因此 , 在转化
确定筛选浓度时应略低于全致死浓度。据此结合试验结果确
定愈伤组织受体系统的卡那霉素筛选浓度为 50 mg/ L。
羧苄青霉素敏感性试验抑制农杆菌生长是转化的一个重
要环节 , 本实验选择羧苄青霉素作为抑菌性抗生素 , 设定浓度
梯度为 0 mg/ L 、100 mg/ L、200 mg/ L、300 mg/ L、400 mg/ L、
500 mg/ L(毫克/升)进行敏感性试验 , 结果显示 , 羧苄青霉素
不抑制植物细胞正常生长 , 其选择压在 200 mg/ L(毫克/升)
时即可达到较好抑菌效果 ,低于这个浓度 4 d(天)之后培养基
内就出现菌斑。
2.5　试管苗的移栽
待根长到长于 2 cm(厘米)时[ 7] , 打开瓶口 , 将试管苗在
弱光处放置 3 d(天)后取出 , 用自来水洗去根部培养基 , 直接
移栽到营养土和蛭石(1∶1)的混合基质中 ,浇足水 , 荫处管理。
7 d(天)后浇 1/2MS 营养液;移栽后 1 ～ 3 周 , 每天喷水 5 ～ 6
次 , 这一阶段为生根试管苗移栽后管理的重要时期 , 要保持较
高的空气湿度。
3　讨论
植物遗传转化是定向改良作物品种原有特性的有利途
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几种药剂防治番茄叶霉病田间试验
咸 文 荣
(青海省农科院植保所 ,西宁 810016)
番茄叶霉病病原菌为(Cladosporium fdvum cook)半知菌
亚门 、枝孢属的黄枝孢菌。由于保护地高温 、高湿的环境条
件 ,致使番茄叶霉病成为保护地番茄生产上的主要病害之一 ,
为此选用 6 种高效 、低毒的化学药剂 , 在田间针对番茄叶霉病
进行药剂筛选试验 ,为发展无公害番茄生产提供有效的药剂。
1　材料与方法
1.1　供试药剂
A:50%万霉灵WP 1000×(江苏省新沂农药有限公司)
B:80%新太生 WP 350×(利民化工有限责任公司)
C:60%佛吗.锰锌WP 600×(沈阳化工研究所)
D:50%施美特WP 1000×(山东京博农化有限公司)
E:72%霜疫力克WP 600×(山东京博农化有限公司)
F:77%氢氧化铜WP 600×(浙江禾本农药化工有限公司)
G:50%多菌灵 WP 600×(江苏镇江农药厂出品)
1.2　试验方法
试验选用 50%万霉灵等 6 种药剂 ,以 50%多菌灵为对照
药剂 ,不加药为空白对照 , 共 8 个处理 ,每处理重复 3次 , 小区
面积为 6.8×1.9=13 m2(平方米),小区随机排列 , 每 667 m2
(平方米)药液量为 45 kg(公斤)。选常年发病严重的地区 ,病
害发生初期于 6 月1 3 日第 1 次施药 ,每隔 7 d(天)喷 1 次 ,共
喷 3 次 ,喷药时雾滴分布要均匀 , 叶片正 、反面都要喷。
1.3　调查方法和病害的分级标准
每小区对角线 5 点取样 ,每点选 1 株 , 每株各选 5 片叶片
(既定点 、定株 、定叶)挂牌调查。 第一次施药前调查发病基
数 ,最后一次施药后 7 d(天)(7 月 4 日)调查发病情况 , 并对
调查数据记录。番茄叶霉病的分级标准:以每株每一片叶上
的病斑面积占整个叶面积的百分率来分级。
0级:无病斑;1 级:病斑面积占整个叶面积 5%以上;3
级:病斑面积占整个叶面积 6%～ 10%;5 级:病斑面积占整个
叶面积 11%～ 20%;7 级:病斑面积占整个叶面积 21%～
50%;9级:病斑面积占整个叶面积 50%以上。
1.4　药效计算方法
a:病情指数=∑[(各级病叶数×相对级数值)]调查总叶数×9 ×100
b:防治效果(%)=1-cko 病指数×pt1 病指数
ck1 病指数×pt0 病指数 ×100
2　结果分析
对试验获得的数据进行统计 ,对防效经反正弦转换后进
行 F 测验和 LSR测验 ,以确定其差异显著性 ,结果见表。
药剂防治番茄叶霉病结果统计表
　　　处理 药前病情指数 药后病情指数
1 2 3 1 2 3
防治效果
(%)
显著性
0.05 0.01
A:万霉灵 17.78 15.11 24 20.3 18.7 25.56 74.5 a A
B:新太生 16.22 19.7 28 24 26.5 33.3 70.4 b A
C:佛吗锰锌 18.44 29.78 18.89 29.78 43 25.44 67.4 c B
D:施美特 20 14.78 20.44 28.22 16.5 23.0 73 ab A
E:霜疫力克 17.78 25.33 30.67 25.7 30.67 37.2 71.4 b A
F:氢氧化铜 19.77 14.22 18.89 33.78 21.33 25.78 66.2 c BC
G:多菌灵 16.44 22.22 20.44 31.89 35.7 31.11 62.6 d C
H:空白对照 10.67 17.5 15 50.32 60.44 50.56
　　从表 1可知 , 在发生番茄叶霉病的田间每隔 7 d(天)喷一
次 ,连续喷 3 次药 , 其防效分别为万霉灵 74.5%、施美特
73%、72%霜疫力克 71.4%、新太生 70.4%、60%佛吗锰锌
67.4%、氢氧化铜 66.2%、多菌灵 62.6%;50%万霉灵和 50%
施美特防效最好 , 其次为 72%霜疫力克 、80%新太生 、60%佛
吗锰锌。对防治效果进行差异显著性比较 , 试验选择的 5 种
药剂与对照药剂有极显著性差异 , 77%氢氧化铜与对照药剂
差异显著;50%万霉灵与 50%施美特间差异不显著 , 而与其
它药剂间差异显著;50%施美特 、72%霜疫力克和 80%新太
生与 60%佛吗锰锌 、77%氢氧化铜 、50%多菌灵间有极显著
差异 , 60%佛吗锰锌与对照药剂间有极显著差异。
3　结论
通过田间防治番茄叶霉病试验 , 50%万霉灵WP和 50%
施美特WP是防治叶霉病的最好药剂(防效为 73%以上), 其
次为 72%霜疫力克WP 和80%新太生效果较好 ,而 60%佛吗
锰锌 WP和 77%氢氧化铜WP 效果较差 , 50%多菌灵最差。
防治番茄叶霉病 , 50%万霉灵和 50%施美特 WP 为
1 000倍 , 72%霜疫力克WP 为 600 倍 , 80%新太生为 350 倍 ,
连续喷 3 次 , 间隔 7 d ～ 10 d(天), 注意药剂要交替使用 , 以免
产生抗药性。
径 ,在这个操作过程中 , 植物细胞组织培养技术是其重要的技
术基础 ,往往起到“瓶颈”作用 。一个好的组织培养体系必须
是再生频率高 ,易于重复 , 简单快速 ,适应性广 , 以及没有基因
型的依赖。胶东卫矛作为木本植物 ,分化率较低 , 还远远没有
达到这个要求 ,因此限制了其基因工程改良 , 因此这一方面的
研究还急需突破。
本研究结果初步建立了一个实用的胶东卫矛离体培养和
植株再生技术体系 ,其离体培养操作程序为:带腋芽的茎段接
种在腋芽增殖培养基上(MS+6-BA2 mg/ L+IBA 0.2 mg/ L
(毫克/升)), 10 d(天)后 , 腋芽开始萌动 , 待芽长到 2 cm ～
3 cm(厘米)时剪下来转接到 MS 快繁培养基上 , 培养一段时
间以后 ,取上部幼嫩的茎段截成 0.1 cm ～ 0.2 cm(厘米)的小
段 ,接种在分化培养基上 , 30 d(天)后部分可以直接出苗。待
苗长到 3 cm ～ 5 cm(厘米)的时候转移到生根培养基上 , 10 d
(天)就有不定根的发生 ,待根生长良好时 , 即可以移栽。
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注:本文作者还有:吴忠义2 、田路明1、古润泽3 , 联系作者:黄
丛生 、张潞生
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