全 文 ：西北农业学报　2008 , 17(5):98-102
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
冬青卫矛内生真菌代谢产物农用杀菌活性筛选＊
韩江涛1 ,杨春平1 ,韩小美1 ,刘国强2＊
(1.西北农林科技大学农药研究所,陕西杨凌　712100;2.中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 ,北京　100081)
摘　要:从冬青卫矛(Euonymus j aponicus)中分离到 59株植物内生真菌 , 农用杀菌活性测定表明 , M-1 菌株
发酵液对番茄早疫病菌(Alernaria solani)、西瓜枯萎病菌(F usarium oxy sporium)和苹果炭疽病菌(Colleto-
trichum gloesporioides)菌丝生长抑制率达到 80.3%、78.5%和 87.8%。M-1发酵液对枯草芽孢杆菌 、蜡状芽
孢杆菌 、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为 23.0 mm 、20.0 mm 、16.0 mm 和 20.0 mm。M-1 发
酵液的乙酸乙酯萃取物对苹果炭疽病菌的毒力最高 , IC50为 63.6 μg/ mL 。 Doskochilova 溶剂系统鉴定表明 ,
M-1的发酵液中含有硫藤黄菌素类抗生素。
关键词:冬青卫矛;内生真菌;代谢产物;杀菌活性
中图分类号:Q939.11;S482.2+92　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1004-1389(2008)05-0098-05
Screening of Pesticidal Activities of Plant Endophytic
Fungi from Euonymus j aponicus
HAN Jiang-tao1 , YANG Chun-ping1 , HAN Xiao-mei1 and LIU Guo-qiang2＊
(1.In sti tute of Pes ticide , Northwest A&F Uniuersity , Yangling S haanxi 712100 , C hina;2.In sti tu te of Agricul tu ral
Environment and Sus tainable Development , Chin ese Academy of Agricul tu ral Sciences , Bei jing　100081 , China)
Abstract:59 st rains plant endophy tic fungi w ere separated f rom Euonymus japonicus for ant ifungal
activi ties screening , and go t st rain M-1 w ith st rong antifungal bioactivit ies.The inhibition ra te of me-
tabolites of M-1 st rain against Alternaria solani , Fusarium oxy sporium sp.niveum , Colletotrichum
g loesporioides were 80.3%, 78.5% and 87.8%.The result o f antibacterial bioassay indicated that the
inhabitation zone of M-1 st rain against Baci l lus cereus , Bci l lus subti l ls , S taphyococcus aureus and
Escherichia col i were 23.0 mm , 20.0 mm , 16.0 mm and 20.0 mm 。The ethy l acetate ex t ract of M-1
bro th culture had higher antifungal activi ty ag ainst Colletotrichum gloesporioides , and the IC50 was
63.6 μg/mL.By the Doskochilo va so lvent sy stem , fermentation broth of M-1 may include sulfurlute-
o lin.
Key words:Euonymus japonicus;Endophy tic fungi;Fe rmentation products;Antifungal act ivities
　　植物内生真菌(Plant endophyt ic fungi)是指
生活在健康植物组织内部但不引起植物体病害的
真菌[ 1] 。这类真菌资源十分丰富 ,它们可能产生
在微生物-宿主关系中发挥作用的生理活性物质 ,
其次生代谢产物在生物制药 、农业生产 、工业发酵
等领域越来越受到人们的关注[ 2] 。目前 ,微生物
源生物化学农药的研究和开发在我国十分活跃 ,
但微生物资源及其应用潜力尚没有得到充分的发
挥 ,而植物内生真菌即是这样一类有待开发的新
兴微生物资源 ,本文对冬青内生真菌进行分离并
对其次生代谢产物进行了农用活性筛选 ,为进一
步研究冬青内生真菌的活性物质及生物学特性提
供依据。
＊　收稿日期:2007-12-13　　修回日期:2008-04-20
基金项目:国家 973 项目(No.2003CB114404)
作者简介:韩江涛(1980-),男 ,硕士研究生。主要从事农药毒理及植物内生菌研究。
＊通讯作者:刘国强。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　供试植物材料　采自陕西杨凌西北农林
科技大学校园内冬青卫矛(Euonymus japonicus
)新鲜的植物根 、茎 、叶和果实。
1.1.2　供试病原菌　小麦赤霉病菌(Fusarium
gramiearum) 、玉米大斑病菌 (Exserohi lum
turcicum)、烟草赤星病菌(A lternari alongipes )
、小麦根腐病菌(B iolarissorok i niana)、苹果炭
疽病菌(Colletotrichum g loesporioides)、马铃薯
干腐病菌(Fusarium solani)、番茄早疫病菌(
A lernaria solani ) 、西瓜枯萎病菌(Fusarium
oxy sporium )、番茄灰霉菌(Botryt is cirerea)及
蜡状芽孢杆菌(Baci l lus cereus )、枯草芽孢杆菌
(B ci llus subti l ls)、金黄色葡萄球菌(Staphyo-
coccus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli),均
由西北农林科技大学农药研究所提供。
1.1.3　培养基　固体培养基:PDA 培养基 ,牛
肉膏蛋白胨培养基。液体培养基:土豆 200 g ,蔗
糖 10 g ,葡萄糖 10 g , 乙酸钠 1.66 g , 硫酸镁
1.02 g , 蛋白胨 0.5 g ,蒸馏水 1 000 mL , 0.1
MPa 灭菌 30 min 。
1.1.4　供试植物　未成熟的番茄果实(茸粉一
号)。
1.2　方法
1.2.1　内生真菌的分离　先用自来水冲洗新鲜
植物组织表面 ,晾干后将根 、茎切成 2 cm 左右的
小段 ,用 75 %酒精漂洗 1 ～ 2 min ,无菌水冲洗 3
～ 4 次 ,再用 0.2 %升汞浸泡 2 ～ 3 min ,无菌水
冲洗 3 ～ 4 次取表面消毒处理后的冬青茎 、叶 、果
实和根 , 无菌条件下切割成长宽约为 0.5 cm 的
组织块 , 将其放在 PDA 平板培养基上 , 28 ℃下
培养 3 ～ 7 d , 待组织块断面边缘有菌丝生长后 ,
挑取前端菌丝转入 PDA 平板培养基 , 经纯化 ,
得到单一菌落 , 斜面保存备用 。为检查材料表面
的消毒效果 ,进行对照试验。将表面消毒过的一
部分材料不做剪切 ,直接种植于 PDA 平板上作
对照培养处理 ,对照材料周围均无任何菌长出 ,证
明表面消毒彻底 ,从而保证分离得到的真菌是植
株内生真菌 ,而不是表面的附生菌[ 3-5]
1.2.2　菌株发酵产物的制备　发酵:在 250 mL
三角瓶中装入 100 ～ 125 mL 马铃薯液体培养基 ,
封口 , 灭菌。待冷却后用接种针挑取少量菌落接
种于培养瓶中 , 置摇床上 , 在 170 r/ min 、28℃条
件下培养 6 ～ 7 d。
提取:发酵终止后 , 将发酵产物用 4层纱布
过滤 ,菌丝体在通风橱中吹干 ,获得干菌丝体 。菌
丝体用乙酸乙酯回流提取 3 次 ,每次 2 h ,合并滤
液 ,过滤 ,用旋转蒸发器浓缩得到菌丝体粗提物。
发酵液用等体积乙酸乙酯萃取 4 次 ,合并乙酸乙
酯相 ,减压浓缩得到菌丝体萃取物 。
1.2.3 　抑菌活性测定 　初步筛选:参照对峙
法[ 6-8]测定上述分离得到的内生真菌的抑菌活性。
将供试植物病原菌和内生真菌用 0.4 cm 打孔器
制成菌饼 。取 2块病原菌菌饼 , 相距约 3 cm 放
在 PDA 平板上 , 在其中间放置一块待测内生真
菌的菌饼 。28℃下培养 ,分别于 3d 、5 d记录病原
菌与待测菌株的拮抗带宽度。设置 3次重复 ,以
拮抗带宽度稳定时的平均值作为抑菌活性强弱的
指标 。
复筛:采用生长速率法对初筛得到的具有抑
菌活性的菌株做进一步筛选。
1.2.4　对病原细菌的抑制作用　采用管碟法[ 9]
检测菌株发酵产物的敏感性。将融化的牛肉膏蛋
白胨培养基冷却至 45 ～ 50℃,加入体积分数 1.5
%的供试病原细菌摇匀 , 24 h 后测量抑菌圈大
小。
1.2.5　对几种敏感农用真菌的毒力测定　抑制
菌丝生长:用丙酮溶解将菌株发酵液乙酸乙酯萃
取物配成 5 000 、2 500 、1 250 、625 、312.5μg/ mL
5个不同质量浓度 ,每质量浓度为一个处理 ,每处
理设 3个重复 。采用生长速率法 ,根据不同质量
浓度的菌丝生长抑制率计算毒力[ 9] 。
抑制孢子萌发:取供试病原菌的孢子配成适
当浓度的孢子悬浮液(在 10 ×10 低倍镜下 ,每个
视野有 30 ～ 40 个孢子)。将菌株发酵液乙酸乙
酯萃取物经丙酮溶解配成 500 μg/ mL 、250 μg/
mL 、125 μg/ mL 、62.5 μg/ mL 、31.25μg/ mL 5
个不同质量浓度。把一定浓度待测样品的丙酮溶
液分别与孢子悬浮液混合 ,取 1 滴滴加在凹玻片
上 ,将凹玻片迅速翻转使液滴倒悬在凹玻片下表
面 ,小心将凹玻片放在保湿器架上 ,使液滴倒悬在
保湿的小环境中 ,每质量浓度为一个处理 ,以加入
孢子悬浮液为对照 ,每处理 3 次重复 。在适当温
度下培养 6 h 后检查对照孢子的萌发情况 。当对
照孢子萌发率达到 85 %后 ,检查所有处理孢子的
萌发率。以孢子芽管长度大于孢子短半径者为萌
·99·5 期　　　　　　　　　　韩江涛等:冬青卫矛内生真菌代谢产物农用杀菌活性筛选
发。最后根据不同质量浓度的抑制率计算毒
力[ 10] 。
1.2.6　离体果实针刺法测定发酵液乙酸乙酯萃
取物对番茄灰霉的抑制作用　取长势一致的未成
熟果实 ,直径为 6 cm ,置 15 cm 的培养皿中备用。
把发酵液稀释 0 倍 、10倍 、50倍均匀喷施离体果
实 ,待果实干燥后 ,用接种针轻轻将果实刺破然后
将 3%的蔗糖溶液制备的浓度为 4.5×105个/mL
的番茄灰霉病原孢子悬浮液用微量移液器接种一
滴在每个果实上 ,每处理 6个重复。以嘧霉胺稀
释 1 000倍做药剂对照 ,以丙酮做空白对照。接
种后置于 25℃恒温光照的培养箱中保湿培养 ,5 d
后观察记录试验结果
参考方中达《植病研究方法》[ 11] ,番茄灰霉病
标准分级如下。0 级:无病斑;1 级:病斑面积占
整个叶面积的 10 %以下;2级:病斑面积占整个
叶面积的 10 %～ 25 %;3 级:病斑面积占整个叶
面积的 26 % ～ 50 %;4 级:病斑面积占整个叶
面积的 51 %～ 75 %;5 级:病斑面积占整个叶面
积的 75 %以上 。
发病率=发病面积数/接种总面积×100 %;
病情指数=΢(各级发病数×该级代表数)/总株
数×最高级代表数;防治效果=(对照区病情指数
-处理区病情指数)/对照区病情指数×100 %。
1.2.7　发酵液中活性物质的 Doskochilo va 溶剂
系统鉴定　采用 Doskochilo va 溶剂系统[ 12] 对发
酵液进行纸层析预试 ,结合生物自显影 ,绘出其展
开曲线 ,比较抗生素经典图谱[ 13] ,对活性成分进
行初步定性。
2　结果与分析
2.1　59 株内生真菌的抑菌活性筛选结果
采用对峙法对分离得到的 59 株内生真菌的
抑菌活性进行初步筛选(表 1)。以拮抗带宽度大
于 0.5 mm 以上为标准 ,结果表明 ,冬青中分离
出来的 10株对 4 种供试菌株均有一定的抑制作
用 ,10株菌株分别为:F-2 、F-1 、D-2 、D-1 、D-3 、F-
5 、D-5 、Y-1 、M-1和 M-2 。
表 1　59 株冬青内生菌对 4 种植物病原真菌的拮抗效果
Table 1　Antifungal activities of 59 strains from in Euonymus ja ponicus against 4 spcies of plant pathogens
病原菌
Pathogens
抑菌活性菌株/株
Amoun t of st rains wi th ant ifungal activity
+++ ++ +
活性菌株比例/ %
Proportion of is olates w i th act ivi ty
小麦赤霉病菌 F.g raminearum 18 3 4 42.3
番茄早疫菌 Al ternaria solani 5 8 7 33.9
西瓜枯萎病 F.O xyspor ium f.sp.niveum 6 10 6 42.3
苹果炭疽病菌 G.g loeospor ioides 9 13 8 45.7
注:拮抗带宽度:+, 0～ 0.5 mm;+ +, 0.5～ 2 mm;++ +, ≥2 mm.
Note :Width of inhibi ting band :+, 0～ 0.5 mm;++, 0.5～ 2 mm;+ ++, ≥2 mm.
表 2　10株内生真菌发酵液对菌丝生长抑制作用
Table 2　Inhibition effects of fermenation products of 10 strain on mycelial growth
菌株
S t rain s
抑制率/ % Inh abi tation rates
番茄早疫病菌
A lternar ia solan i
西瓜枯萎病菌
F.oxy sporium f.sp.niveum 苹果炭疽病菌G.g loeosporioides 小麦赤霉病菌F.gram inearum
F-1 43.2 20.3 42.6 36.5
F-2 26.3 55.9 8.7 65.4
D-2 52.3 45.6 33.6 28.3
D-1 33.9 32.6 27.8 63.8
D-3 58.7 9.5 36.8 41.2
F-5 18.4 22.3 45.2 33.8
D-5 25.8 33.6 44.8 84.7
Y-1 68.9 36.3 22.1 15.8
M-1 80.3 78.5 87.8 21.2
M-2 43.5 42.6 23.1 33.2
　　对初筛的 10株内生真菌进行发酵 ,发酵液和
菌丝体乙酸乙酯萃取物经丙酮溶解配成1 000
μg/ mL分别进行生测 ,结果表明 M-1 对番茄早
疫病菌病菌 ,西瓜枯萎病菌 ,苹果炭疽病菌 ,都有
·100· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　17 卷
很好的抑制效果 ,抑制率分别达到了 76.3%, 78.
5%和 77.8%。而发酵液的乙酸乙酯萃取物也对
以上 3 种病菌有抑制作用 , 其抑制率达到了
99.8%、98.3%和 99.2%。
表 3　菌丝体的乙酸乙酯萃取物对菌丝生长的抑制作用
Table 3　Inhibition ef fects of fermentation products of strain on mycelium growth
菌株
S t rain s
抑制率/ % Inh abi tation rates
番茄早疫病菌
A lternar ia solan i
西瓜枯萎病菌
F.oxy sporium f.sp.niveum 苹果炭疽病菌G.g loeosporioides 小麦赤霉病菌F.gram inearum
F-1 63.2 35.6 16.8 56.8
F-2 56.3 63.5 68.3 60.5
D-2 56.2 65.5 54.3 66.7
D-1 56.8 32.5 37.5 65.7
D-3 62.3 21.5 36.9 45.8
F-5 26.9 77.6 48.9 36.6
D-5 29.6 34.5 47.3 77.1
Y-1 77.8 65.3 22.8 17.1
M-1 99.8 98.3 99.2 13.5
M-2 22.3 35.5 66.9 56.1
表 4　M-1 菌株发酵液对病原细菌的抑制作用
Table 4　Inhibition effects of fermenation
products of M-1 strain on bacteria
供试病原菌
Tested path ogens
抑菌圈直径/ mm
Diameter of inhibi tion zone
枯草芽孢杆菌 Baci llus subti l ls 23.0
蜡状芽孢杆菌 Baci llus cereus 20.0
金黄色葡萄球菌 S ta ph ylococcus aureus 16.0
大肠杆菌 E.coli 20.0
2.2　M-1菌株发酵液对病原细菌的抑制作用
M-1菌株发酵液对枯草芽孢杆菌 、蜡状芽孢
杆菌 、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径
分别为 23.0 mm 、20.0 mm 、16.0 mm 和 20.0
mm ,且抑菌圈清晰度高 , 表明对供试细菌有较好
的抑制效果。
2.3　M-1菌株发酵产物对几种敏感农用真菌的
毒力
乙酸乙酯萃取物的生测(表 5)结果表明 ,M-1
发酵液对苹果炭疽病菌 、马铃薯干腐病菌 、棉花枯
萎病菌的 IC50分别为 63.6 μg/ mL 、334.4 μg/
mL 、268.6 μg/ mL。M-1 的乙酸乙酯萃取物抑
制苹果炭疽菌丝生长的毒力最高
表 6表明 ,M-1菌株发酵液乙酸乙酯萃取物
对棉花枯萎病菌的毒力较高 , IC50值为 69.6μg/
mL ,对其他 2种病原菌孢子萌发的毒力较低 。
表 5　M-1 菌株发酵液乙酸乙酯萃取物抑制菌丝生长的毒力
Table 5　Toxicity of fermenation broth of M-1 strain on mycelium growth of plant pathogenic
供试病原菌
Tested fu ngus
毒力方程
T oxicity equation
相关系数 r
Correlat ion coef fi cent
IC50/(μg·mL -1)
棉花枯萎病菌 F usarium oxysporum y= 1.8389+0.5332 x 0.9763 268.6
苹果炭疽病菌 G.g loeospor ioides y = 1.1790+2.8738 x 0.9713 63.6
马铃薯干腐病菌 F usarium so lani y= 1.7873+0.4873 x 0.9674 334.4
表 6　M-1 菌株发酵液乙酸乙酯萃取物对病菌孢子萌发的毒力
Table 6　Toxicity of of fermentation broth of M-1 strain on spore germination of plant pathogenic
供试病原菌
Tested fu ngus
毒力方程
T oxicity equation
相关系数 r
Correlat ion coef fi cent
IC50/(μg·mL -1)
马铃薯干腐病菌 F.solani y= 2.1029+0.3153 x 0.9855 336.9
苹果炭疽病菌 G.g loeosporioid es y= 1.9607+0.5322 x 0.9816 189.9
棉花枯萎病菌 F.oxy sporum y=1.3327+2.547 x 0.9692 69.6
2.4　离体果实法生测结果
由表 7可以看出 ,发酵液原液的防治效果达
到了 71.4%,稀释到 50 倍时防治效果为25.1%,
而对照药剂嘧霉胺的防治效果达到了 100%。说
·101·5 期　　　　　　　　　　韩江涛等:冬青卫矛内生真菌代谢产物农用杀菌活性筛选
明 M-1发酵液在较高浓度下对番茄灰霉病菌防
治效果较为理想 。
表 7　M-1 发酵液离体果实生测结果
Table 7　Bioassay results of M-1 strain broth fruit in vitro
项目
Item
发病率/ %
Morbidi ty
级数
S eries
防治效果/ %
Cont roled ef fects
0倍 12.3 1 71.4
10倍 21.6 2 50.2
50倍 33.7 4 25.1
清水对照 42.6 4 -
嘧霉胺 0 0 100
2.5　M-1 菌株发酵液中活性物质的 Doskochilo-
va溶剂体系
由图 1可知 ,该有效成分在 1 、2 、3 、4 、7 、8溶
剂体系中 RF 值较大 ,在 5 、6 中 RF 值为 0 ,参照
经典的各类抗生素纸色谱图可以发现 M-1与硫
藤黄菌素的展开曲线类似 ,表明 M-1菌株发酵产
物中可能含有硫藤黄菌素类抗生素 。
图 1　M-1 菌株发酵液中活性物质的 Doskochilova溶剂体系
Fig.1　Broth active substances of M-1 Strain in the results
of Doskochilova curve solvent system
3　讨论
笔者进行了大量的分离试验 ,从冬青卫矛中
的根 、茎和叶中均分离得到了内生真菌 ,但数量却
很少 ,这可能与采样时间以及当年的气候有关。
由于采样时间较早 ,树体刚处于萌动期 ,而当年春
天气温回升较慢 ,气温低造成树体返青延迟 ,组织
尚处于生长初期 。从分离得到的内生真菌中筛选
出 10株对不同供试病原菌具有体外拮抗活性的
菌株 ,而只有一株经过复筛杀菌活性最好 ,并且通
过 Doskochilova 溶剂体系发现发酵液中含有与
硫藤黄菌素相似物质 ,可以通过活性追踪方法对
活性物质进行分离。
本试验对 M-1 菌株代谢产物只进行了室内
杀菌活性测定 ,对 M-1菌株代谢产物在大田试验
中能否防治植物病害 ,有待进一步探讨 ,并且对菌
丝体的杀菌活性也要进一步研究。
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