全 文 ：24 林业科技开发 2013 年第 27 卷第 5 期
其是Ⅴ－2 组合亏本最大，亏损达9 800 元 /hm2。因
此，从经济效益上看，10 种措施组合中最好的 3 个组
合分别是Ⅲ－1、Ⅰ、Ⅵ－1，林分 43 个月生时的纯利润
分别达7 300、4 600、3 700 元 /hm2，这与其他同类研
究结果有较大差异，如张友育［7］研究尾巨桉 1 666、
1 350、1 050 株 /hm2密度林分 3． 5 年生纯收入分别是
4 万、6 万、4 万元 /hm2;黄和亮等［8］研究巨尾桉林分
第 7 年主伐利用时的利润为 1 813． 76 元 /hm2;这可
能与栽培措施不同有关外，可能还与不同地区、不同
年代有关，即计算效益各因素所取的参数值不同，会
造成不同研究结果的差异。
参考文献
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( 责任编辑 田亚玲
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
)
doi:10． 3969 / j． issn． 1000－8101． 2013． 05． 006
润楠 ISSＲ－PCＲ优化反应体系建立及引物筛选
刘玉香1，宋晓琛2，江香梅1，2*
(1．江西农业大学园林与艺术学院，南昌 330045;2．江西省林业科学院国家林业局樟树工程技术研究中心)
收稿日期:2013－04－03 修回日期:2013－04－29
基金项目:林业公益性行业科研专项(编号:201004073) ;江西省财政
林业重大科技专项“樟科树种种质基因库营建及产业化利用研究”
(编号:2011510101)。
作者简介:刘玉香(1987 －) ，女，硕士生，研究方向为植物学。通讯作
者:江香梅，女，研究员。E-mail:xiangmeijiang@ yahoo． com． cn。
摘 要:以润楠基因组总 DNA 为材料，利用单因素试验设计方法，对影响 ISSＲ －PCＲ 扩增的模板 DNA、Mg2 +、
dNTPs、引物、Tag DNA聚合酶以及去离子甲酰胺等试验因子进行了优化试验，筛选出 16 条有效引物并确定了它们
的退火温度，并检测了体系的重复性。优化后的反应体系为: 20 μL PCＲ 反应体积中，10 × PCＲ Buffer 2 μL，2． 0
mmol /L Mg2 + 1． 6 μL，0． 2 mmol /L dNTPs 2 μL，0． 4 mmol /L引物 0． 8 μL，0． 5U Taq DNA聚合酶 0． 1 μL，40 ng DNA
模板 1． 0 μL，1． 5%去离子甲酰胺 0． 3 μL，ddH2O 12． 2 μL。扩增程序为: 94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，据不同
引物的退火温度复性 45 s，72℃延伸 90 s，反应 37 个循环，最后在 72℃延伸 7 min。润楠 ISSＲ－PCＲ反应体系的建
立为利用 ISSＲ分子标记技术研究润楠的遗传多样性奠定了良好的基础。
关键词:润楠; ISSＲ; 体系优化;引物筛选
Optimization of ISSＲ －PCＲ reaction system and primers screening in Machilus pingii∥LIU Yu-xiang，
SONG Xiao-chen，JIANG Xiang-mei
Abstract:In this paper，the different levels of concentration of template DNA，Mg2 +，dNTPs，primer，Tag DNA polymer-
ase and formamide deionized were trailed by single factor experiment using Machilus pingii DNA，sixteen ISSＲ primers were
selected out，and their annealing temperatures were also established． Furthermore，the optimized reaction conditions were
examined for its repeatability． The optimal conditions of ISSＲ－PCＲ was established as follows:10 × PCＲ Buffer 2 μL，2． 0
mmol /L Mg2 + 1． 6 μL，0． 2 mmol /L dNTPs 2 μL，0． 4 mmol /L primer 0． 8 μL，0． 5U Taq DNA polymerase 0． 1 μL，40 ng
DNA template 1 μL，1． 5% formamide deionized 0． 3 μL and ddH2O 12． 2 μL in 20 μL reaction system． The augmentation
procedure was:pree-denaturation at 94℃ for 5 min，denaturation at 94℃ for 30 s，annealing of 45 s due to denaturing
temperature of different primer，extension at 72℃ for 90 s，reaction of 37 cycles and extension at 72℃ for 7 min． The es-
tablishment of the ISSＲ －PCＲ reaction conditions could
settle favorable basis for the further study on the genetic
diversity of Machilus pingii by using ISSＲ molecular
marker．
Key words:Machilus pingii;ISSＲ;optimization system;
primers screening
应用研究 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗
林业科技开发 2013 年第 27 卷第 5 期 25
First author’s address:Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China
润楠(Machilus pingii)为樟科润楠属常绿乔木，
产江西、湖南、云南、四川、贵州等长江以南各省区，孤
立木或生于林中，为国家二级保护植物。目前对润楠
的研究较少，主要集中在胚胎学［1－2］及分类学［3］的研
究上，大部分研究集中在润楠属内其他植物中［4－8］，
对润楠遗传学方面的研究目前尚属空白。
ISSＲ是一种在 SSＲ基础上发展起来的新型微卫
星类分子标记技术［9］，具有模板需要量少，遗传多态
性高，重复性好等特点，目前已广泛应用于种属间及
种质资源间分子鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱构
建和基因定位以及系统发育等诸多领域。由于 ISSＲ
扩增反应易受到模板 DNA、Mg2 +、dNTPs、引物、Taq
DNA酶等各种因素的影响且具有物种特异性［10］，因
而建立特定物种 ISSＲ －PCＲ 优化反应体系是进一步
进行分子生物学研究的基础。本试验旨在采用单因
素试验方法，建立润楠的 ISSＲ －PCＲ 优化反应体系，
并在此基础上筛选出一批条带清晰、稳定、多态性丰
富的引物，为润楠分子生物学研究奠定试验基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
所用润楠材料来自江西省林业科学院樟科树种
种质资源收集库，采集润楠植株上幼嫩干净叶片提取
全基因组 DNA。
1． 2 主要仪器和试剂
所用 ISSＲ－PCＲ反应引物、生物和化学试剂均购
于上海生工公司。所用仪器设备主要包括 AllegraTM
21Ｒ台式高速冷冻离心机(Backman公司)、微型高速
离心机(SOＲVAL)、BioSpec-nano 紫外可见分光光度
计、PTC－0220 温度梯度 PCＲ仪(Bio-Ｒad公司)、DYY
－6B型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)、紫外
一次性成像系统(Bio-Ｒad)。
1． 3 润楠基因组 DNA提取
采用改良的 CTAB 法［11］提取润楠基因组 DNA，
用紫外可见分光光度计测量所提 DNA 浓度和纯度，
用 0． 8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量，并将其稀
释至 25 ng /μL，贮存于 － 20℃冰箱中备用。
1． 4 ISSＲ－PCＲ扩增优化反应体系建立
1． 4． 1 影响扩增 6 个因子的单因素试验设计
本试验设计的影响润楠 ISSＲ －PCＲ 扩增的因子
为 6 个，其优化反应体系建立采用单因素试验设计方
法［12－13］，各因子的优化试验设计见表 1。本试验先根
据原初 PCＲ反应条件进行引物初筛，选择有清晰条
带的引物，再对该引物进行退火温度的优化来确定其
最佳退火温度，然后按照表 1 进行 PCＲ 扩增反应体
系的优化。
表 1 影响 ISSＲ－PCＲ扩增反应因子的单因素试验设计
影响因子
试验水平
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Mg2 + /(mmol·L －1) 0． 25 0． 5 1． 0 1． 5 2． 0 2． 5 3． 0 3． 5 4． 0
dNTPs /(mmol·L －1) 0． 025 0． 05 0． 1 0． 15 0． 2 0． 25 0． 3 0． 35 0． 4
Primer /(μmol·L －1) 0． 1 0． 2 0． 4 0． 5 0． 75 1． 0 1． 25 1． 5 2． 0
Taq酶 /U 0． 5 1． 0 1． 5 2． 0 2． 5 3． 0 3． 5 4． 0 4． 5
模板 DNA /ng 2． 5 5． 0 10． 0 20． 0 40． 0 60． 0 80． 0 120． 0 160． 0
甲酰胺 /% 0 0． 5 1． 0 1． 5 2． 0 3． 0 4． 0 5． 0 6． 0
1． 4． 2 ISSＲ－PCＲ原初扩增反应条件及程序
本试验原初扩增反应条件为:20 μL PCＲ反应体
积，10 × PCＲ Buffer 2． 0 μL，40 ng DNA 模板 1 μL，
2． 5 mmol /L Mg2 + 2 μL，0． 2 mmol /L dNTPs 2 μL，0． 5
mmol /L引物 1 μL，1U Taq DNA 聚合酶 0． 2 μL，2%
去离子甲酰胺 0． 4 μL，ddH2O 11． 4 μL。参考有关文
献［14－15］，本研究确定的扩增程序为:94℃预变性 5
min，94℃变性 30 s，特定温度下退火 45 s，72℃延伸
90 s，反应 37 个循环，72℃延伸 7 min，扩增后 PCＲ 产
物于 8℃保存。此外，退火温度［16］摸索采用梯度 PCＲ
模式，自动设置梯度范围为 48 ～ 59℃，梯度为 1℃，以
确定每条引物的最适退火温度。
1． 4． 3 引物筛选
将单因素试验获得的优化反应体系对 ISSＲ 系列
引物进行初筛和复筛，并确定其适宜退火温度;将能扩
增出清晰条带且多态性丰富的引物用于进一步试验。
2 结果与分析
2． 1 基因组总 DNA提取
采用本试验室改良的 CTAB 法提取的润楠基因
组总 DNA(图 1) ，主带清晰，经紫外分光光度计检
测，OD260 /280在 1． 8 ～ 1． 9 之间，说明所提 DNA 较完
整，提纯效果较好，符合 ISSＲ扩增要求。
图 1 润楠基因组总 DNA电泳图
欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗 应用研究
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2． 2 ISSＲ－PCＲ优化反应体系建立
2． 2． 1 退火温度对 ISSＲ扩增反应的影响
退火温度与物种、引物序列密切相关。本试验先
根据引物 UBC840 的理论退火温度 50℃和初始 PCＲ
反应条件及程序，进行退火温度的初筛，以能扩增出
清晰条带的退火温度为适宜退火温度。试验结果
(图 2)表明:当退火温度为 52℃时，扩增出的谱带多
且清晰明亮。退火温度过低，扩增条带弥散，亮度减
弱，非特异性扩增增强;退火温度过高，引物与模板结
合差，PCＲ产物少甚至没有。
注:M为marker;1 ～12依次为48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59℃
图 2 退火温度对 ISSＲ扩增的影响
试验结果还表明，试验筛选出的适宜退火温度
(52℃)与理论退火温度(50℃)［17］存在一定的差异。
由此可见，实际退火温度与理论退火温度之间存在一
定差异，实际操作中，不同引物的退火温度宜以试验
结果为准。
2． 2． 2 Mg2 +浓度对 ISSＲ扩增的影响
Mg2 +浓度作为 Taq 酶的辅助因子，是 PCＲ 成功
与否的关键因素，它不仅影响 Taq酶活性及合成的忠
实性，还能与反应液中的 dNTPs、模板 DNA及引物结
合，影响引物与模板的结合效率、模板与 PCＲ产物的
解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形
成［18］。本试验结果表明，当 Mg2 +浓度为 2． 0 mmol /L
注:M为 marker;1 ～ 9 依次为 0． 25、0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0、3． 5、
4． 0 mmol /L
图 3 不同 Mg2 +浓度对 PCＲ反应的影响
时，扩增出的条带明亮清晰，且稳定性好;浓度低于 1． 0
mmol /L时，无扩增条带;浓度为 1． 0 ～ 1． 5 mmol /L，扩
增的条带少且弱;浓度高于 2． 5 mmol /L时，条带数量
变化不大，但扩增背景明显增加，条带变得不清晰，这
可能是 Mg2 +浓度偏高带来的非特异性扩增引起的
(图 3)。因此认为，本试验 Mg2 +的适宜浓度为 2． 0
mmol /L。
2． 2． 3 dNTPs浓度对 ISSＲ扩增的影响
dNTPs作为 PCＲ 反应的底物，浓度过高会导致
聚合酶错误渗入，过低又影响合成效率，甚至影响扩
增效果。本试验结果表明，当 dNTPs 浓度为 0． 15
mmol /L时，条带清晰，且多态性好;当浓度低于 0． 1
mmol /L时条带模糊，大片段条带缺失;当浓度大于
0． 3 mmol /L时，扩增条带减少且变暗(图 4)。从试
验效果和经济两方面因素考虑，认为本试验 dNTP 的
浓度以 0． 2 mmol /L为宜。
注:M为 marker;1 ～ 9 依次为 0． 025、0． 05、0． 10、0． 15、0． 20、0． 25、
0． 30、0． 35、0． 40mmol /L
图 4 不同 dNTPs浓度对 PCＲ反应的影响
2． 2． 4 引物浓度对 ISSＲ扩增的影响
引物浓度会对 ISSＲ －PCＲ 扩增的带型产生明显
的影响，浓度过低不能扩增条带或条带缺少、较弱，浓
度太高又会产生非特异性条带［19］。当引物 UBC840
浓度为0 ． 40 ～ 0 ． 50μmol / L时，扩增出较清晰、稳定
注:M为 marker;1 ～ 9 依次为 0． 10、0． 20、0． 40、0． 50、0． 75、1． 00、
1． 25、1． 50、2． 00 μmol /L
图 5 引物浓度对 PCＲ反应的影响
应用研究 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗
林业科技开发 2013 年第 27 卷第 5 期 27
的条带。当浓度低于 0． 40 μmol /L时，条带减少;当浓
度高于 0． 50 μmol /L时，大片段条带亮度降低，而某些
小片段条带增加并出现灯泡型，且背景加深，非特异性
扩增明显增强(图 5)。从试验效果和经济两方面因素
考虑，认为本试验引物浓度以 0． 40 mmol /L为宜。
2． 2． 5 Taq聚合酶用量对 ISSＲ扩增的影响
Taq酶用量是 PCＲ过程中的一个重要因素，浓度
过低不能扩增或产物不稳定;浓度过高，不仅增加试
验成本，而且容易产生非特异性扩增，使电泳图背景
呈弥散状。由图 6 可见，当 Taq酶用量为 0． 5 ～ 1． 0 U
时，扩增条带数丰富、清晰;当 Taq 酶用量大于 1． 0 U
时，背景逐渐呈弥散状，非特异性扩增逐渐增强。因
此认为，在 20 μL的反应体积中适宜的 Taq酶用量为
0． 5 U。
注:M为 marker;1 ～ 9 依次为 0． 5、1． 0、1． 5、2． 00、2． 5、3． 0、3． 5、4． 0、
4． 5U Taq DNA polymerase
图 6 Taq酶对 PCＲ反应的影响
2． 2． 6 去离子甲酰胺对 ISSＲ扩增的影响
ISSＲ引物中包含有一定长度的重复序列，与它
结合的目标序列在 DNA复制过程中存在滑动和不均
等交换现象，常会导致扩增条带背景模糊［20］。在反
应体系中加入一定量的去离子甲酰胺能使背景颜色
减弱，条带清晰。本试验结果(图 7)表明，加入1． 5%
注:M为 marker;1 ～ 9 依次为 0、0． 5%、1． 0%、1． 5%、2． 0%、3． 0%、
4． 0%、5． 0%、6． 0%去离子甲酰胺
图 7 去离子甲酰胺浓度对 ISSＲ扩增结果的影响
的去离子甲酰胺，扩增条带最清晰(见图 7 中 5) ;加
入量过多则会明显减少扩增条带的数量。
2． 2． 7 模板 DNA用量对 ISSＲ扩增的影响
模板 DNA 用量设置了 9 个梯度:2． 5、5、10、20、
40、60、80、120 和 160 ng(图 8)。试验结果表明，模板
DNA用量大于 20 ng 均能扩增出清晰、稳定、带型一
致的条带，低于 20 ng则有部分大片段条带较弱。从
节约模板 DNA 用量、减少非特异性条带扩增的角度
考虑，模板 DNA用量以 20 ～ 40 ng为宜。
注:M为 marker;1 ～9依次为 2． 5、5、10、20、40、60、80、120、160ng DNA
图 8 模板 DNA用量对 PCＲ反应的影响
2． 3 润楠 ISSＲ－PCＲ反应体系优化检测及引物退火
温度确定
综上可知，润楠 ISSＲ－PCＲ扩增 20 μL反应体系
的优化条件为:10 × PCＲ Buffer 2 μL，Mg2 +的适宜浓
度为 2． 0 mmol /L，dNTP 的适宜浓度为 0． 2 mmol /L，
引物的适宜浓度为 0． 4 mmol /L，Taq酶的适宜用量为
0． 5 U，去离子甲酰胺的适宜浓度为 1． 5%，模板 DNA
适宜用量为 20 ～ 40 ng。利用上述优化条件扩增出的
条带丰富、清晰、稳定，且多态性丰富(图 9)。这表
明，经过优化后建立的 ISSＲ－PCＲ反应体系具有较好
的稳定性，可以满足润楠用于遗传多样性的研究。
图 9 引物 UBC840 对润楠 9 个个体扩增的 ISSＲ带型
利用本试验筛选出的优化反应体系对 100 条 IS-
SＲ UBC系列引物进行筛选，共筛选出 16 条能扩增出
欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗 应用研究
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条带清晰、重复性好、稳定性高的引物作为复筛引物，
同时确定了这 16 条引物的最适退火温度(表 2) ，为
进一步开展润楠遗传多样性研究奠定了良好的试验
基础。
表 2 筛选出的多态引物及其适宜退火温度
引物 序列 退火温度 /℃ 引物 序列 退火温度 /℃
UBC811 (GA)8 C 52 UBC843 (CT)8 ＲA 52
UBC815 (CT)8 G 52 UBC844 (CT)8 ＲC 54
UBC834 (AG)8 YT 54 UBC848 (CA)8 ＲG 52
UBC835 (AG)8 YC 54 UBC849 (GT)8 YA 52
UBC836 (AG)8 YA 54 UBC853 (TC)8 ＲT 54
UBC840 (GA)8 YT 52 UBC856 (AC)8 YA 56
UBC841 (GA)8 YC 54 UBC857 (AC)8 YG 52
UBC842 (GA)8 YG 58 UBC878 (GGAT)4 52
3 讨 论
3． 1 反应条件的优化及引物筛选
ISSＲ－PCＲ扩增受诸多因素影响，且物种的特异
性极其显著，获得 ISSＲ－PCＲ扩增优化条件是进一步
进行试验研究的基础。本研究采用单因素试验方法
对影响润楠 ISSＲ －PCＲ 扩增的 7 个影响因素进行了
优化试验，结果为:20 μL PCＲ 反应体积中，10 × PCＲ
Buffer 2μL，2． 0 mmol /L Mg2 + 1． 6 μL，0． 2 mmol /L
dNTPs 2μL，0． 4 mmol /L引物 0． 8 μL，0． 5U Taq DNA
聚合酶 0． 1 μL，40 ng DNA 模板 1． 0 μL，1． 5%去离
子甲酰胺 0． 3 μL，ddH2O 12． 2 μL;扩增程序为:94℃
预变性 5 min，94℃变性 30 s，据不同引物退火温度复
性 45 s，72℃延伸 90 s，反应 37 个循环，72℃延伸 7
min。试验共筛选出 16 条条带清晰、多态性丰富、重
复性好的 ISSＲ引物。
3． 2 模板 DNA质量
模板 DNA质量是整个试验成败的关键。本试验
采用改良的 CTAB 法提取润楠的基因组 DNA，且关
键之处还在于用润楠嫩叶为材料，并且用液氮研磨嫩
叶时要研磨充分，样品研磨的充分程度不同，DNA 质
量可以相差几倍，本试验用液氮研磨的次数均在 6 次
以上。其次是胶的制备，胶从第一次溶解沸腾后应立
即拿出摇匀，放置片刻后重复沸腾 3 ～ 4 次，每次沸腾
后均需摇匀，以确保胶完全溶解，即可制成高质量
的胶。
本试验稳定的 ISSＲ 反应体系可以为润楠 ISSＲ
试验的后续工作提供参考，特别是可为运用 ISSＲ 技
术进行润楠遗传多样性研究奠定一定的基础。
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( 责任编辑 史 洁)
应用研究 欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗