全 文 ：LC-MS/MS法测定大鼠口服延胡索提取物后延胡索乙素和
脱氢紫堇碱的药代动力学
林　力 , 刘建勋＊ , 张　颖 , 林成仁 , 段昌令
(中国中医科学院 西苑医院 , 北京 100091)
摘要:建立检测大鼠血浆中延胡索乙素和脱氢紫堇碱分析方法 , 并应用有机溶剂沉淀法提取含药血浆中的生物
碱类成分 , 色谱采用 SB-C18反相柱 ,流动相为乙腈-乙酸铵(0.1%乙酸)梯度洗脱 , 质谱采用多反应监测(MRM)方式
进行正离子检测 ,用于定量分析的例子对分别为 m/z356.2※m/z191.9(延胡索乙素)和 m/z366.2※m/z350.2(脱
氢紫堇碱)。测定血浆中这两种成分的线性范围均为 1.0 ～ 1 000 ng· mL-1 ,定量下限为 1.0 ng· mL-1 ,相关系数分
别为 0.994和 0.992,延胡索乙素的回收率为 71.71% ～ 91.59%, 脱氢紫堇碱的回收率为 83.27% ～ 103.15%, 方法
的精密度 、准确度和稳定性均符合要求。结果显示 ,该法选择性强 、灵敏度高 、操作简便 , 适用于血浆延胡索乙素和
脱氢紫堇碱的药代动力学研究。
关键词:延胡索乙素;脱氢紫堇碱;药代动力学;液质联用
中图分类号:R917　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513-4870(2008)11-1123-05
收稿日期:2008-05-23.
基金项目:国家科技支撑计划(2006BAI08B04-08);国家中医药管理局课题(06-07ZP49);北京市优秀人才(20061D1600100402)资助项
目.
＊通讯作者　Tel/ Fax:86-10-62874049, E-mail:liujx03423@sina.com
Pharmacokineticstudiesoftetrahydropalmatineand
dehydrocorydalineinratafteroraladministration
ofYanhusuoextractionbyLC-MS/MSmethod
LINLi, LIUJian-xun＊ , ZHANGYing, LINCheng-ren, DUANChang-ling
(XiyuanHospital, ChinaAcademyofChineseMedicalSciences, Beijing100091 , China)
Abstract:Asensitiveliquidchromatography-tandemmassspectrometric(LC-MS/MS)methodwas
developedandvalidatedforthequantificationoftetrahydropalmatine(THP)anddehydrocorydaline
(DHC)inratplasma.Thecompoundsweresimplypretreatedbyproteinprecipitationusingacetone.
Chromatographicseparationwasachievedonareversed-phaseSB-C18 columnwiththemobilephaseof
acetonitrile-ammoniumacetate(0.1% aceticacid)andstepgradientelutionresultedataflowrateof
0.80mL·min-1.Atandemmassspectrometerequippedwithelectrosprayionizationsourcewasusedas
detectorandoperatedinthepositiveionmode.Quantificationwasperformedusingmultiplereaction
monitoring(MRM)ofthetransitionsm/z356.2※m/z191.9 andm/z366.2※m/z350.2 forTHPand
DHCrespectively.Themethodshowedexcelentlinearityovertheconcentrationrange1-1 000ng·mL-1
oftwocomponents(r=0.994forTHPandr=0.992forDHC).Thelowlimitsofquantificationwereboth
1 ng· mL-1.Theextractrecoveriesofanalyteswerefrom71.71% to91.59% forTHPandfrom83.27%
to103.15% forDHC.Theprecisions, theaccuracyandthestabilityoftheanalytesmeetthe
requirements.ThemethodwasappliedtoapharmacokineticstudyofTHPandDHC afteroral
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DOI :10.16438/j.0513-4870.2008.11.003
administrationofthetotalalkaloidextractionofRhizomaCorydalis(Yanhusuo).TheAUCwere(1.90±
0.04), (2.58 ±0.08)and(4.34 ±0.19)mg· L-1 hforlow, mediumandhighdosesofTHP,
respectively.WhiletheDHCconcentrationsinplasmaoflowdoseandmediumdoseweretoolowertobe
detected, theAUCofhighdosewas(0.089 6±0.000 2)mg·L-1h.
Keywords:dehydrocorydaline;tetrahydropalmatine;pharmacokinetics;LC-MS/MS
　　我国药典(2005年版)收载延胡索为罂粟科紫
堇属植物延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)的
干燥块茎 ,具有活血 、利气 、止痛的功效。现代药理
研究认为延胡索具有抗血栓 、抗心律失常 、改善心肌
供氧和增加心输出量 ,用于治疗冠心病 [ 1] 。化学研
究 [ 2]表明延胡索的主要成分是生物碱类 ,目前已从
延胡索中分得 4种异喹啉型生物碱近 20个 ,其中多
数属原小檗碱型 。
目前国内外关于延胡索的药代动力学研究不多 ,
仅有的文献也多以延胡索乙素(tetrahydropalmatine,
THP)为检测指标 [ 3 ～ 5] ,对于其所含的季胺型生物碱
脱氢紫堇碱(dehydrocorydaline, DHC)的药代动力学
测定未见文献报道。本实验应用 LC-MS/MS方法建
立了同时检测大鼠血浆中延胡索乙素和脱氢紫堇碱
的方法 ,并应用该法研究大鼠口服延胡索总生物碱
后体内指标成分的药代动力学特征 ,为下一步进行
复方配伍对延胡索生物碱在大鼠体内的药代参数影
响奠定了基础。
材料与方法
药品和试剂　延胡索乙素对照品 ,中国药品生
物制品检定所 ,编号为 110726-200409;脱氢紫堇碱
对照品 ,自制 ,纯度大于 98%;胡索总生物碱均由中
国中医科学院西苑医院药学室提供(其中 THP和
DHC的含量分别为 6.11%和 29.65%), 批号为
060927。乙酸 、乙酸铵和乙腈均为色谱纯 ,分别购自
美国 Fisher公司和 J.T.BAKER公司;其他试剂均
为市售分析纯。
实验动物 　SPF级雄性 Wistar大鼠 , 体重为
(220±20)g,中国医学科学院动物实验研究中心提
供 ,许可证号 SCXY(京)2004-0001。
仪器　API4000Q-TRAP型三重四极杆串联质
谱仪 ,配有离子喷雾离子源以及 Analysis1.4数据
处理系统 ,美国 AppliedBiosystem公司;Agilent1200
高效液相色谱输液泵 ,自动进样器 ,美国 Agilent公
司;色谱柱为 AgilentZORBAXSB-C18柱(150 mm×
4.6mmID, 5μm),美国 Agilent公司。 Micro22R台
式高速冷冻离心机 ,德国 Hetich公司;Biomedical
Freezer超低温冰箱 ,日本 Sanyo公司;AG-245分析
天平和 320pH计 ,美国 MetlerToledo公司;M18780
氮吹仪 ,美国 Pierce公司;MS1Minishaker涡流混合
器 ,德国 IKA公司 。
给药与样品采集　大鼠随机分成 3个剂量组 ,
实验前 12 h禁食不禁水 ,实验期间自由饮水 ,实验
12 h后进食。按延胡索总生物碱 125、 250和 500
mg· kg-1的剂量灌胃给药(10 mL· kg-1),分别于
给药后 0.25, 0.50, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0,
8.0, 10.0 , 12和 24 h经大鼠眼球后静脉丛采血约
0.5 mL,置肝素化试管中 , 4 000 r· min-1离心 10
min,分离血浆 ,待测 。
血浆样品的处理　取大鼠血浆样品 200μL, 加
入丙酮 400 μL, 涡流混合 1 min, 离心 (15 000
r·min-1)10 min, 分离上清液 400 μL于 40 ℃氮
气流下吹干 , 残留物用流动相 100 μL溶解 , 涡流 1
min, 15 000 r·min-1离心 10 min, 取上清液待测。
色谱条件 　色谱柱为 AgilentZORBAXSB-C18
柱(150 mm×4.6 mmID, 5 μm),流动相为乙腈 -
0.01 mol· L-1乙酸铵(含 0.1%乙酸), 梯度洗脱
(0 ～ 5 min, 47%乙腈;5.01 ～ 6 min, 60%乙腈;
6.01 min, 47%乙腈)。流速为 0.80 mL· min-1 ,柱
温为 5 ℃。
质谱条件　离子喷射电压(IS)5.5 kV,源内气
体 1(GS1)为 41.4 kPa, 源内气体 2(GS2)310.5
kPa,气帘气体 103.5kPa,碰撞气(CAD)High,源内
温度 600℃。检测方式为正离子检测 ,扫描方式为
选择反应监测(MRM)方式 ,用于定量分析的离子对
(m/z):356.2 /191.9(THP), 366.2 /350.2(DHC),
相应的二级全扫描质谱如图 1所示 。
数据处理　采用 DAS1.0药动学软件处理数
据统计矩方法计算大鼠给药后药动学参数。由于实
验采用非连续取样 ,因此 AUC的方差按文献 [ 6]计
算。
结果
1　LC-MS-MS方法学确证
1.1　方法的专属性　取大鼠空白血浆 , 按 “血浆样
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Figure1　ESI-MS2 productionspectraofdehydrocorydaline(DHC, A)andtetrahydropalmatine(THP, B)
Figure2　RepresentativeMRMchromatogramsofTHPandDHCinratplasma.A:Blankplasmasample;B:THP
standardsolution;C:DHCstandardsolution;D:Yanhusuoextractioninplasma
品处理 ”项下方法操作 ,获得大鼠空白血浆样品的
色谱图(图 2A);将 THP和 DHC对照品系列溶液加
入大鼠空白血浆中 ,依同法进行样品处理 ,获得相应
的色谱图(图 2B和 2C);取大鼠给药后收集的血浆
样品同法处理 ,得色谱图(图 2D)。由上面结果可
以说明大鼠血浆中内源性物质均不干扰 THP和
DHC的测定。
1.2　线性范围和定量下限　取大鼠空白血浆 160
μL, 依次加入 THP和 DHC对照品系列溶液 40μL,
每个浓度 3份 , 按 “血浆样品处理 ”项下操作 , 建立
工作曲线。以待测物浓度为横坐标 , 峰面积为纵坐
标 , 用加权最小二乘法进行回归运算 , 求得直线回
归方程 , 其中 THP的标准曲线 Y=137 874.958 +
49 134.926X, r=0.994(权重 W=1 /C), 线性范围
1.0 ～ 1 000 ng·mL-1;DHC的标准曲线 Y=
223 189.399+54 325.796X, r=0.992(权重 W=
1/CC), 线性范围 1.0 ～ 1 000 ng· mL-1。
配制 THP和 DHC的血浆样品质量浓度均为
1.0 ng·mL-1 ,并根据当日标准曲线求得每一样本
测定浓度 ,求得 THP和 DHC的精密度(RSD)分别
为 6.04%和 2.11%,准确度分别为 100% ～ 118%和
84% ～ 94%之间 ,该结果表明此方法下 THP和 DHC
的定量下限可达到 1.0ng· mL-1。
1.3　回收率 、精密度 、准确度和稳定性　选择低 、
中 、高 3种浓度(分别为 5、100和 1 000ng· mL-1),
以空白血浆配制 QC样品 ,每个浓度点 5份样品 ,将
·1125·林　力等:LC-MS/MS法测定大鼠口服延胡索提取物后延胡索乙素和脱氢紫堇碱的药代动力学
相同浓度的样品按照样品处理方法于处理后分析 ,
分别计算其回收率 、精密度和准确度实验。 3种浓
度下大鼠血浆 THP的回收率分别为 71.73% ～
91.59%,精密度分别为 1.35% ～ 9.54%,准确度的
RSD分别为 2.05% ～ 7.43%;DHC的回收率分别为
83.27% ～ 93.15%,精密度为 2.06% ～ 4.06%,准
确度为 83% ～ 115%。 THP和 DHC在室温 24 h空
白血浆中样品稳定性均符合相关要求 。
本方法生物样品中 THP和 DHC的测定方法表
明血浆内源性杂质不干扰样品的测定 ,血浆中药物
平均回收率均在 71%以上 ,变异系数小于 10%;最
低定量限均为 1.0 ng· mL-1 , 相关系数超过了
0.992,日内精密度和稳定性符合相关要求。
2　DHC和 THP的药代动力学
应用 LC-MS/MS的方法 ,以延胡索总生物碱给
药 ,研究其主要有效成分 DHC和 THP在大鼠体内
的药代动力学 ,其药代参数见表 1,药时曲线分别见
图 3A和图 3B。对于 DHC,由于中 、低剂量组所能
定量的数据点太少而无法绘制药时曲线 ,因此实验
结果只得到了高剂量组的药代动力学曲线 ,其 AUC
值为 0.089 6 mg·L-1· h,药代参数显示该成分在
体内达峰较快 ,在体内表观分布容积较大 ,但 AUC
值和 Cmax较低;3个剂量组 THP在大鼠体内的 AUC
值分别为 1.896、 2.583和 4.344mg·L-1· h,该值
与给药剂量呈正相关 , r为 0.977。低 、中剂量组的
达峰时间均为 3h,高剂量组为 6h,表观分布容积与
给药剂量成反比。
讨论
生物碱是一大类含氮的有机化合物 , 具有较强
的生物活性。自从 1806年德国学者 F.W.Sertirner
从鸦片中分离出吗啡碱以后 , 迄今为止已从自然界
分出 10 000多种生物碱 [ 1] 。植物体内生物碱含量
虽少 ,但与人类关系密切 。许多生物碱具药理活性 ,
如小檗碱 、利血平 、加兰他敏 、吗啡碱 、奎宁碱 , 三
尖杉碱和长春花碱等。目前对于生物碱类成分药代
动力学的研究很多 , 近年来也逐渐采用 LC-MS/MS
的方法进行定量。实验中发现 , 当流动相采用灵敏
度较高的 0.1%甲酸溶液测定时在 THP的前面出现
一个保留时间接近 、母离子和子离子完全相同的色
谱峰 , 由于前面的峰在体外测定时并未出峰 , 因此
判断其可能为延胡索总碱在体内生成的代谢产物 ,
为延胡索乙素的同分异构体 。由于两者分离度太
小 , 严重干扰定量测定 , 因此必须调整色谱条件将
Table1　PharmacokineticparametersofTHPandDHCafteroraladministrationinrat(n=6)
Parameter THP-lowdose THP-mediumdose THP-highdose DHC-highdose
AUC0-t/μg· L-1· h 1 895.898 2 568.107 4 286.196 89.557
AUC0-∞ /μg· L-1· h 1 900.963 2 583.457 4 349.126 277.146
MRT0-t/h 4.799 5.63 7.172 3.355
MRT0-∞ /h 4.851 5.767 7.49 18.892
T1/2 /h 2.748 3.358 3.56 21.238
Tmax/h 3 3 6 0.5
CL/L· h-1· kg-1 0.011 0.008 0.005 0.072
Vd/L· kg-1 0.042 0.038 0.024 2.212
Cmax/μg· L-1 364.210 336.057 407.628 62.527
Figure3　Meanplasmaconcentration-timecurveofDHC(A)andTHP(B)
·1126· 药学学报 ActaPharmaceuticaSinica2008, 43(11):1123-1127
其分开 。通过不断调整色谱条件 , 发现只有将水相
转换为酸性乙酸铵溶液并将色谱柱温调至 5℃才能
将两峰完全分开 , 使其分离度达到定量标准 。
在体内血药浓度的测定时进行了延胡索乙素和
脱氢紫堇碱的研究 ,结果显示对于 3个剂量组的
THP体内均可以完整描绘其药时曲线 ,但对于 DHC
只有高剂量组才能得到药时曲线 ,中低剂量组均无
法测定 ,这说明 DHC的吸收很差(体外的吸收实验
也证明了这一点 ,具体结果另文发表),这可能与其
为季胺碱极性太大有关 。文献 [ 7, 8]中对 DHC的体
内研究仅见用同位素标记的分布研究 ,血药浓度的
测定尚未见报道 ,这可能与给药剂量和体内难于吸
收有关 。
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