全 文 : ·436· Chin JMAP, 2010 May, Vol.27 No.5 中国现代应用药学 2010 年 5 月第 27 卷第 5 期
验,最后确定为乙腈-甲醇-水-异丙醇=60∶10∶
29∶1(原方法为乙腈-甲醇-水=72∶6∶22),流动相
中加入 1%的异丙醇[3],有效的改善了峰形,解决
了基线不稳定的问题。调低乙腈的比例,增加水
的比例,大大的降低了成本和减少了系统对环境
的污染。流动相采用梯度洗脱[4],当样品及内标出
峰后,以 100%的有机相(甲醇)及较快的流速将内
源性的强保留杂质较快的洗脱出来,有效的缩短
了样品进样分析的时间。柱温对 CsA 测定影响较
大,实验中笔者发现,随着柱温升高,保留时间
相对缩短,峰形和分离效果都有较大改善,为此
笔者分别对柱温 60,65,70,75 ℃作对比实验,
结果 60 ℃与 65 ℃时 CsA、CsD 及杂峰分离不完
全,峰宽大,70 ℃时 CsA、CsD 及杂峰完全分离,
且峰宽窄,峰形好,柱效高。但温度继续增加到
75 ℃时,峰形改善不明显,考虑到柱温太高会影响
色谱柱寿命,故最终确定柱温为 70 ℃。选用 Agilent
zorbax SB-C18 柱(4.6 mm×150 mm,3.5 µm)最大耐
受温度高达 90 ℃,有利于延长色谱柱的寿命。
3.2 样品提取方法的优化
采用甲醇-50 mmol·L−1HCl (1∶1)为重组液
(原方法为甲醇-25 mmol·L−1HCl (1∶1)),加大重组
液的酸度有效的增强了正己烷的脱脂去除杂质能
力。本实验曾分别对流动相乙腈-甲醇-水-异丙醇
(60∶10∶29∶1)、乙腈-50 mmol·L−1HCl(1∶1) 、
甲醇-25 mmol·L−1HCl(1∶1) 、甲醇-50 mmol·L−1
HCl (1∶1)为重组液进行对比实验研究,结果发现
在用正己烷脱脂前,以流动相为重组液溶解残渣
时,两相液面模糊,乳化现象严重,呈凝胶状。
以乙腈-50 mmol·L−1HCl (1∶1) 为重组液溶解残
渣时,虽然无乳化现象,但进样后色谱图中有很
多杂峰干扰。以甲醇-HCl(1∶1) 为重组液溶解残
渣时,既无乳化现象,进样后的色谱图杂质少。
但随着重组液中盐酸浓度的增大,正己烷的脱脂
去除杂质能力增强,两相液面更清晰,更便于分
离,进样后的色谱图杂质更少,在该色谱条件下,
CsA 与内标有足够的分离度,且血液中内源性杂
质对测定无干扰,故最后确定用甲醇-50 mmol·L−1
盐酸(1∶1)做为重组液。随着方法灵敏度的提高,
进样量减少为原来的一半,进样量为 25 µL,原方
法 50 µL,最低定量浓度为 25 ng·mL−1,原方法 50
ng ·mL−1,最低检测限为 5 ng ·mL−1,原方法
10 ng·mL−1。
改进后的 RP-HPLC 法,灵敏度提高了一倍,
基线更稳定,线性范围更宽,重复性好,柱效高,
峰形对称尖锐,结果准确可靠。是一种优良的环
孢素 A 血药浓度监测的反相高效液相色谱法,适
合于临床治疗药物监测和药动学研究。
REFERENCES
[1] REN B, LI S X, CHEN X, et al. Determination of cyclosporin
A in human whole blood by RP-HPLC [J]. Chin J Hosp Pharm
(中国医院药学杂志), 2001, 21(8): 470-472.
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cyclosporin A in human whole blood by RP-HPLC [J]. China
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cyclosporin A in human whole blood by reversed phase liquid
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(中国药房), 2005, 16(22): 1723-1725.
收稿日期:2009-06-30
HPLC 测定雪胆胃肠丸中的延胡索乙素
许琼明 1,郭兆荣 1,2,杨世林 1,2,3,李笑然 1*,高红伟 1,董更婷 1,王佳露 4(1.苏州大学药学院,江苏 苏州 215123;
2.江西中医学院,南昌 330004;3.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心,南昌 330006;4.中国药科大学药学院,南京 210009)
摘要:目的 建立雪胆胃肠丸中延胡索乙素含量测定的方法。方法 采用 Hypersil ODS2柱 (250 mm×4.6 mm,5 µm),乙
腈-0.1%磷酸溶液(三乙胺调 pH至 6.0)(40∶60)为流动相;流速 1.0 mL·min−1;检测波长 225 nm;柱温:25 ℃。 结果 延胡
索乙素在 4.8~48.0 µg·mL−1内与其峰面积有良好的线性关系,其平均回收率为 99.82%,RSD为 1.00% (n=6)。结论 所建方
基金项目:国家“十一五”科技支撑计划重点项目子课题(2006BA108B03-05)
作者简介:许琼明,男,博士,副教授 Tel: (0512)69561421 E-mail: xuqiongming@suda.edu.cn *通信作者:李笑然,男,教授 Tel:
(0512)65880301 E-mail: lixiaoran@suda.edu.cn
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2010.05.013
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法简便易行、准确可靠,可用于雪胆胃肠丸中延胡索乙素的含量测定。
关键词: 雪胆胃肠丸;延胡索乙素;高效液相色谱法;含量测定
中图分类号:R917.101 文献标志码:B 文章编号:1007-7693(2010)05-0436-04
Determination of Trahydorpalmatine in Xuedan Weichang Pill by HPLC
XU Qiongming1, GUO Zhaorong1,2, YANG Shilin1,2,3, LI Xiaoran1*, GAO Hongwei1, DONG Gengting1, WANG
Jialu4(1.College of Pharmacy, Soochow University, Suzhou 215123, China; 2.College of Jiangxi Traditional Chinese Medicine,
Nanchang 330004, China; 3.National Pharmaceutical Engineering Center for Solid Preparation in Chinese Herbal Medicine,
Nanchang 330006, China; 4.College of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)
ABSTRACT: OBJECTIVE To establish an HPLC method for determination of contents of trahydorpalmatine in Xuedan
Weichang pill. METHODS To utilize RP-HPLC, the Hypersil ODS2 column (250 mm×4.6 mm, 5 µm) was used with the mobile
phase of acetonitrile-0.1% phosphate acid (adjustd to pH 6.0 by triethylamine) (60∶40). The flow rate was 1.0 mL·min−1. The
detection wavelength was 225 nm. The column temperature was 25 ℃. RESULTS The linear range of trahydorpalmatine was
4.8-48.0 µg·mL−1. The average recoveries was 99.82% with RSD of 1.00% (n=6). CONCLUSION The method established is
sensitive, accurate and can be used for quality control of Xuedan Weichang pill.
KEY WORDS: Xuedan Weichang pill; trahydorpalmatine; HPLC; determination
雪胆胃肠丸是从苗族民间传统秘方中开发出
来的中药复方,含有雪胆、延胡索、吴茱萸、木香、
白及、黄芪等十多味中药材。经临床研究表明,雪
胆胃肠丸对胃炎、萎缩性胃炎、十二指肠溃疡等疾
病有独特的疗效。延胡索是雪胆胃肠丸中一味重要
的药材,它具有活血散瘀、理气止痛的功效,对实
验性胃溃疡有保护作用[1]。延胡索药材中的主要活
性成分是延胡索乙素,它具有很显著的镇痛作用,
可以相当程度地缓解胃痛;另外,药理试验表明延
胡索乙素对在体大鼠胃基础酸和组胺刺激泌酸有
抑制作用,并具有明显抑制离体大鼠胃黏膜和壁细
胞泌酸功能[2]。目前,雪胆胃肠丸的质量标准中还
没有对延胡索的成分进行检测控制。为了给雪胆胃
肠丸生产检验提供检测指标和进一步完善其质量
标准,笔者采用 HPLC 测定雪胆胃肠丸中延胡索乙
素的含量。
1 仪器与试药
日本 SHIMADZU LC-20A 高效液相色谱仪,
SPD-M20A 二极管阵列检测器,LC Solution 化学工
作站;N-1001 旋转蒸发仪(日本东京理化器械株式
会社);EL-204 万分之一分析天平(梅特勒-托利多仪
器有限公司);SE-93 自动双重蒸馏水蒸馏器(上海
亚荣生化仪器厂);KQ-100DE 数控超声仪(昆山市
超声仪器有限公司)。
延胡索乙素对照品(中国药品生物制品检定所,
批号:0726-200508,供含量测定用),使用前置硅
胶干燥器中干燥至恒重。甲醇、乙腈为色谱纯,氯
仿、乙醚为分析纯,水为双重蒸馏水。雪胆胃肠丸
(昆明生达制药有限公司,批号:070401,070402,
070403)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm,
5 µm);柱温:25 ℃;流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液
(三乙胺调 pH 至 6.0)(40∶60);流速:1.0 mL·min−1;
检测波长:225 nm。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取延胡索乙素对照品 2.40 mg,置于
50 mL 量瓶中,加甲醇溶解并定容,制成浓度为
48 µg·mL−1 的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品 100 丸,切碎,取粉末约 5.0 g,精密称
定,精密加入等量的硅藻土,研匀,精密称取 10 g,
置圆底烧瓶中,精密加入氨水-甲醇(1∶20)混合溶
液 50 mL,密塞,称定重量,冷浸 1 h 后加热回流
1 h,取出,放冷,再称定重量,用氨水-甲醇(1∶
20)混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,精密吸
取续滤液 25 mL,减压蒸干,取 pH1.5 的硫酸水溶
液 20 mL,分 3 次将残渣转移至分液漏斗,再分别
加入 30,30,20 mL 乙醚萃取 3 次,弃去乙醚层;
用浓氨水调 pH 至 10.0,分别加入 30,30,20 mL
氯仿萃取 3 次,合并氯仿层,置圆底烧瓶中减压浓
缩至干,加适量甲醇溶解,转移至 5 mL 量瓶中,
加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。
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按处方比例称取不含延胡索的阴性样品,按上
述方法制备阴性样品溶液。
2.4 系统适用性试验
分别取对照品溶液,供试品溶液及阴性对照
溶液各 20 µL 进样测定。在选定色谱条件下,延
胡索乙素与样品中其他组分色谱峰可基线分离,
分离度大于 1.5,按延胡索乙素峰计算,理论板数
在 8 000 以上,拖尾因子为 1.04;阴性对照溶液
在延胡索乙素色谱峰位置处无相应色谱峰出现。
见图 1。
图 1 高效液相色谱图
A−对照品;B−供试品;C−阴性样品;1−延胡索乙素
Fig 1 HPLC chromatogram
A−control; B−sample; C−negative sample; 1−trahydorpalmatine
2.5 线性关系考察
分别精密量取“2.2”项下对照品溶液 1,2,4,
6,8,10 mL 置于 10 mL 量瓶中,用甲醇稀释至刻
度,摇匀,分别吸取上述溶液 20 µL 注入高效液相
色谱仪,记录色谱图,测定其峰面积,以浓度(C)
为横坐标,峰面积值(A)为纵坐标,进行线性回归,
得延胡索乙素的回归方程为:A=61 401.6C+540.7,
r=0.999 9。结果表明:延胡索乙素在 4.8~48 µg·mL−1
内线性关系良好。
2.6 仪器精密度试验
精密吸取上述对照品溶液,重复进样 6 次,每
次 20 µL,结果峰面积 RSD 为 1.04%。
2.7 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液,分别于 0,3,6,
12,24 h 进样,每次 20 µL,结果峰面积 RSD 为
1.46%。
2.8 重复性试验
取同一批(批号:070401) 样品 6 份,分别精密
称定,制备供试品溶液,20 µL 进样测定,按延胡
索乙素的含量计算,结果 RSD 为 1.35%。
2.9 加样回收试验
取已知含量的样品(每克含延胡索乙素 0.036 mg)
约 5.0 g 共 6 份,精密称定,置圆底烧瓶中,每份
分别加入延胡索乙素对照品适量,按“2.3”项下方
法制备,进样测定,记录峰面积,计算延胡索乙素
的回收率。结果延胡索乙素的平均回收率为
99.82%,RSD 为 1.00%。
2.10 样品测定
分别精密吸取延胡索乙素对照品溶液及供试
品溶液各 20 µL,注入高效液相色谱仪,按外标法
计算延胡索乙素的含量,分别测定了 3 个批次的样
品中延胡索乙素的含量,按每袋(标示重量 4.5 g)计
算,结果见表 1。
表 1 样品测定结果 (n=5)
Tab 1 Results of sample determination (n=5)
批号 含量/mg·袋−1 RSD/%
070401 0.162 8 1.21
070402 0.168 1 0.99
070403 0.160 3 1.34
3 讨论
雪胆胃肠丸目前是执行国家药品监督管理局
颁布的 WS-10312(ZD-0312)-2002 试行标准。在该
标准方案中,以阿魏酸为对照品,选择当归作为含
量测定项目。由于当归对胃肠道疾病方面目前尚无
相关药理作用方面的文献资料,以其为质控指标难
以反映该制剂的内在质量。而延胡索在该复方中是
一味重要的药材,其主要成分在对胃肠道疾病方面
有较显著的疗效。因此,以延胡索乙素为对照品,
选择延胡索作为含量测定项目更为合适。
雪胆胃肠丸是含有十多味中药的复方,所以在
液相的图谱中干扰杂质成分很多。延胡索乙素为叔
胺类生物碱,在氯仿中易溶,在乙醚中微溶,在
pH 7.0左右的水中几乎不溶。本试验利用这一性质,
采用以下样品前处理方法:样品经氨水-甲醇(1∶20)
提取后,挥干溶剂,残渣用 pH 1.5 的硫酸水溶液溶
解,乙醚萃取除去脂溶性杂质,然后调 pH 10.0,
用氯仿把延胡索乙素萃取出来,水溶性杂质留在碱
水层,氯仿液蒸干,再用甲醇溶解,制备样品溶液。
中国现代应用药学 2010 年 5 月第 27 卷第 5 期 Chin JMAP, 2010 May, Vol.27 No.5 ·439·
通过上述样品前处理方法,很好的除去了杂质,使
分离度和峰形都得到了改善。
本试验采用二极管阵列检测器对延胡索乙素
对照品在 190~800 nm 波长内进行扫描,结果在
225 nm 和 281 nm 波长处有较明显的吸收峰。实验
表明,在 225 nm 和 281 nm 波长处杂质吸收峰均
很少,干扰较小,其中以 225 nm 吸收波长作为检
测波长时,分析方法的灵敏度高,峰形良好。故
本实验选定 225 nm 为检测波长。
本法以延胡索乙素为指标成分,测定雪胆胃
肠丸中延胡索的含量,重复性好,无杂质峰干扰,
简便易行,准确可靠,因此可作为质量标准的控
制指标。
REFERENCES
[1] Jiangsu New Medical College. Traditional Chinese Medicine
Dictionary (中药大辞典) [M]. Shanghai: Shanghai Science
and Technology Publisher, 1986: 920.
[2] LI Y, WANG J H, LAO S X, et al. Tetrahydropalmatine
inhibit gastric acid secretion in isolated rat [J]. Chin Pharm
Bull (中国药理学通报), 1993, 9(1): 44-47.
收稿日期:2009-03-14
HPLC 测定烫伤合剂中盐酸小檗碱的含量
肖萍 1,李文仕 2 (1.广西医科大学第四附属医院,广西 柳州 545005;2.广西百色食品药品检验所,广西 百色 533000)
摘要:目的 建立烫伤合剂中盐酸小檗碱的含量测定方法。方法 色谱柱为 Inertsil C8-3柱(4.6 mm×250 mm,5 µm),流
动相为 0.05 mol·L−1磷酸二氢钠溶液-乙腈-磷酸(70∶30∶0.08 );流速为 1 mL·min−1,柱温:35 ℃,检测波长为 260 nm。
结果 盐酸小檗碱在 5.28~52.8 mg·L−1内峰面积与浓度呈良好的线性关系,Y=2.45×104X+4.91×103(r=0.999 4),平均回收
率为 100.30%,RSD为 1.24% (n=6)。结论 方法简便、准确、重复性好,可作为控制产品质量的定量依据。
关键词:烫伤合剂;盐酸小檗碱;高效液相色谱法
中图分类号:R917.101;R943.3 文献标志码:B 文章编号:1007-7693(2010)05-0439-03
Determination of Berberine Hydrochloride in Mixture for Burn and Scald by HPLC
XIAO Ping1, LI Wenshi2(1.The Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Liuzhou 545005, China; 2.Institute
for Drug Control of Baise, Baise 533000, China)
ABSTRACT: OBJECTIVE To determine the content of berberine hydrochloride in mixture for burn and scald. METHODS
The content of berberine hydrochloride in mixture for burn and scald was determined by HPLC with Inertsil C8-3 (4.6 mm×
250 mm, 5 µm) column. The mobile phase was 0.05 mol·L−1 sodium dihydrogen phosphate solution-acetonitrile-phosphoric
(70 30 0.08) with a flow rate of 1 mL∶ ∶ ·min−1, the columm temperature was set at 35 and the wavelength of the detector was ℃
set at 260 nm. RESULTS The linear range was 5.28−52.8 mg·L−1 and the correlation cofficient was 0.999 4. The average
recovery and the RSD were 100.30% and 1.24%(n=6). CONCLUSION The method is simple, accurate and repeatable. It is
proved to be suitable for the quality control of mixture for burn and scald.
KEY WORDS: mixture for burn and scald; berberine hydrochloride; HPLC
烫伤合剂是我院自制的治疗烧烫伤的良药
(批准文号:桂药制字 Z02060134),处方由虎杖、
地榆、功劳木、两面针等数味中药组成,具有收
敛止痛,抑菌,减少渗出,促进伤口愈合等功效,
临床用于治疗Ⅰ至Ⅱ度烧烫伤,疗效显著,其中
功劳木具有清热燥湿,泻火解毒的药理作用[1]。为
达到更有效控制该制剂内在质量的目的,笔者采
用高效液相色谱法测定制剂中功劳木活性成分之
一盐酸小檗碱的含量,该方法快捷、灵敏、准确,
适用于该制剂的快速含量分析。
1 仪器与试药
日 本 岛 津 LC-10Avp 高 效 液 相 色 谱 仪
(LC-10AT 泵,SPD-10Avp 检测器,CBM-102 数据
处理机,CS-Light 色谱数据工作站);BP211D 电
作者简介:肖萍,女,副主任药师 Tel: (0772)3815091 E-mail: lzxp01@sina.com