全 文 ：园林科技 2013年第 1期 总第 127期
杜鹃花是我国十大传统名花之一，深受人们的
喜爱，也是欧美第二大木本花卉，是著名的盆栽花卉
和庭院绿化美化植物。 我国是杜鹃花的主要分布中
心，也是杜鹃花生物多样性最富集的地区，世界上约
70%的杜鹃花物种资源聚集在我国。 其中大叶常绿
杜鹃是杜鹃花中观赏价值较高的类群，也是备受欧
美国家推崇的类群。 云锦杜鹃 （Rhododendron for-
tunei）是大叶常绿杜鹃花中的优秀代表，花大如碗、
粉红色，花时灿若云霞，有时一棵树开花可达千余
朵，所以有“千花杜鹃”之美称，是一种观赏价值高
开发潜力大的园林树种，具有抗性强、花大有香味、
结实率高等优点，因而成为欧美20世纪杜鹃花育种
最著名的亲本之一 [1]。 它的许多杂交品种获得了
无数奖章，被誉为是当时最好的品种群，至今仍常
见于欧美花园 [2]。 我们的试验材料Rhododendron
‘Scintillation’，是欧美广泛应用的云锦杜鹃杂交品
种之一。
国内外对杜鹃的组培快繁研究较多 [3-4]，实现
了规模化生产，同时在云锦杜鹃 [5]、西洋杜鹃 [6]、桃
叶杜鹃[7]上实现了叶片离体培养诱导出再生植株，但
Rhododendron ‘Scintillation’未见任何离体培养的报
道，本试验以叶片为外植体，对其叶片离体培养和不
定芽再生进行了详细研究，建立了大叶常绿杜鹃的
不定芽再生体系，除了满足繁育良种试管苗外，建立
的叶片培养植株再生体系，可为下一步的体细胞无
性系变异、体细胞融合以及开展基因工程培育新品
种做准备。
1 材料与方法
1.1 试验材料
上海市园林科学研究所盆栽2～4年生大叶常绿
杜鹃 （引自德国），2010年取其带腋芽茎段以直接器
官发生方式建立了离体培养体系，2011年在此基础
上，取无菌苗形态学上端第四对叶片进行不定芽诱导。
1.2 试验方法
1.2.1 不定芽的直接发生
将叶片边缘剪去，以远轴面朝下接种于不定芽
诱导培养基上（图1），以MS为基础培养基，ZT、BA分
别设置0.1、0.5、1.0、2.0mg/L四个梯度，并添加0.1 mg/
L NAA，分别暗培养1天、5天、10天、15天。
1.2.2 愈伤组织途径诱导分化不定芽
1.2.2.1 愈伤组织的诱导
将叶片边缘剪去，以远轴面朝下接种于愈伤组
织诱导培养基MS+2，4-D2.0mg/L+KT0.2mg/L，暗培
大叶常绿杜鹃叶片的离体培养及不定芽再生
吕秀立1 张春英1 魏翔莺2
（1.上海市园林科学研究所， 上海 200232； 2.福建农林大学园艺学院， 福州 350002）
摘 要： 以大叶常绿杜鹃无菌苗的嫩叶为试验起始材料，研究了其离体培养和不定芽再生的过程。结果表明：①叶片
可直接诱导再生出不定芽，其最佳培养基为MS+ZT1.0mg/L+ NAA0.1mg/L，诱导率达 70%；②叶片也可以通过愈伤组织
途径间接诱导出不定芽，愈伤组织诱导培养基为MS+2.0mg/L2,4- D+0.2mg/LKT；愈伤组织增殖的最佳培养基为MS+ZT
0.5 mg/L+IBA0.1 mg/L；愈伤组织分化的最佳培养基为 MS+ZT0.04mg/L+NAA0.01mg/L，分化率最高为 70%，分化苗数为
6～10株。生根培养基为MS+NAA0.2mg/L+IBA0.4mg/L时，生根率达到 90％。腐殖土∶黄沙∶珍珠岩 =4∶1∶1的混合
基质较适合常绿杜鹃试管苗的炼苗移栽，成活率为 90%。
关键词： 大叶常绿杜鹃；叶片；不定芽；再生系统
园林植物
基金项目：国家自然科学基金项目“不同氮源条件下杜鹃花菌根形成及其效应的分子机理研究”（编号：30972409）资助
* 通讯作者：mayzhang55@yahoo.com.cn
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园林科技 2013年第 1期 总第 127期
表1 不同激素及不同激素水平对不定芽发生的影响
培养基（mg·L-1） 接种数 出芽外植体数 诱导率（%）
MS+BA0.1+NAA 0.1 30 4 13.33
MS+BA0.5+NAA 0.1 30 7 23.33
MS+BA1.0+NAA 0.1 30 9 30.00
MS+BA2.0+NAA 0.1 30 10 33.33
MS+ZT0.1+NAA 0.1 30 9 30.00
MS+ZT0.5+NAA 0.1 30 17 56.67
MS+ZT1.0+NAA 0.1 30 18 60.00
MS+ZT2.0+NAA 0.1 30 17 56.67
养（图1）。
1.2.2.2 愈伤组织继代增殖
将形成的愈伤组织从叶片上剥离，接种于愈伤
组织增殖培养基，以MS为基础培养基，ZT、BA分别
设置0.1、0.5、1.0mg/L三个梯度，并添加0.1mg/L IBA，
完全黑暗条件下培养，每四周继代一次。
1.2.2.3 再生芽的诱导
在不定芽诱导阶段，需要将黑暗条件下培养出
的愈伤组织转入光下进行不定芽的诱导，诱导培养
基以MS为基础培养基，ZT、BA分别设置0.01、0.02、
0.04、0.08mg/L四个梯度，并添加0.01mg/L NAA。
以上所有处理每次接种数为30，均做3次重复。
以上各种培养基pH值为5.7～5.8，蔗糖3%，琼脂
0.64%，分装后在高压灭菌锅中121℃条件下保持17min，
放置待用。
1.2.3 生根培养
添加不同生长素种类以及不同生长素浓度的
MS、1/2MS培养基（见表5）。
1.2.4 移栽
将生根试管苗开瓶炼苗3～4d后，洗净培养基，
移栽于不同配比的基质中（表6），注意保湿，20～25d
可以成活，45d后可移植于田间。
2 结果与分析
2.1 不定芽的直接发生
添加BA、ZT的培养基都可诱导出芽，但ZT诱导
效果显著（表1）。 BA浓度小于2.0mg/L时，需要1个月
的时间才能形成不定芽，数量很少，诱导率低。 ZT在
0.5～2.0mg/L的浓度范围内，接种10d即观察到叶片边
缘卷曲，逐渐形成瘤状突起（图2），20d成为可见的不
定芽，诱导率最高达到60%。
将叶片培养于MS+ZT1.0mg/L+NAA 0.1mg/L培
养基上，培养初期分别暗培养1天、5天、10天、15天，
再转至光下培养，结果如表2所示，初期暗培养能显
著提高叶片不定芽的分化率， 随着暗培养时间的延
长，分化率也在逐渐提高，但当暗培养时间超过10天
时，分化率呈现下降趋势，并且分化的不定芽叶色嫩
黄甚至出现白化苗。 综上所述，大叶常绿杜鹃叶片
直接诱导不定芽发生时，培养基以MS+ZT1.0mg/L+
NAA 0.1mg/L，初期暗培养时间以5天为最佳，诱导
率达到76.67%，叶色浓绿，植株生长旺盛（图3～4）。
2.2 愈伤组织途径诱导分化不定芽
2.2.1 愈伤组织的诱导
叶片接种于愈伤组织诱导培养基MS+2，4-D2.0
mg/L+KT0.2mg/L，在培养的第8d时，在边缘切口处开
始产生白色粒状的愈伤组织，随着培养时间的延长，
愈伤组织逐渐增多，培养至30d时，可以切下，进行愈
伤组织的增殖培养。
2.2.2 愈伤组织继代增殖
将初代培养得到的愈伤组织用镊子将其分成
5mm左右大小，接种在新鲜的愈伤组织增殖培养基
上继代培养，在所设计的培养基上，愈伤组织都能够
进行增殖生长，经30d培养，愈伤组织体积膨大，重量
增重为原来的1.1～2.5倍（表3），其中在MS+ZT 0.5
mg/L+IBA 0.1mg/L培养基上，愈伤组织增殖速度最快，
呈白绿色，致密（图5），后期培养证明更容易产生不
定芽，因此选作常绿杜鹃愈伤组织的增殖培养基。
表2 不同暗培养时间对不定芽发生的影响
暗培养时间 接种数 出芽外植体 诱导率（%）
1 30 20 66.67
5 30 23 76.67
10 30 21 70.00
15 30 19 63.33
表3 不同激素及不同激素水平对愈伤增殖的影响
培养基（mg·L-1） 接种数 增重倍数 颜色和状态
MS+BA0.1+IBA 0.1 30 1.1 黄绿色 易碎
MS+BA0.5+IBA 0.1 30 1.5 黄绿色 松软
MS+BA1.0+IBA 0.1 30 2.0 白绿色 松软
MS+ZT0.1+IBA 0.1 30 1.3 黄绿色 致密
MS+ZT0.5+IBA 0.1 30 2.5 乳白色 致密
MS+ZT1.0+IBA 0.1 30 2.1 乳白色 致密
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2.2.3 不定芽的诱导
将愈伤组织转入无任何激素的空白MS培养基
上，25～30d后可分化出苗，但分化率仅为6.67％，并
且为单苗。 若将愈伤组织转到含低浓度激素的培养
基上，能不同程度的分化出丛芽，经筛选发现在MS+
ZT0.04mg/L +NAA 0.01mg/L培养基上分化率最高为
70%，出苗数量最多，为6～10株（图6）。
在不定芽诱导阶段，需要将黑暗条件下培养出
的愈伤组织转入光下培养，如果一直处于黑暗状态，
不容易形成芽点更不会形成再生芽，原因是光照通
过调节糖代谢中关键酶的活性来调节糖代谢水平，
使其协同参与对愈伤组织分化的调节 [8]。
2.3 生根培养
大叶常绿杜鹃始发见根时间为25d，在所试验的
培养基中，以MS+NAA0.2mg/L+IBA0.4mg/L为最佳
（表5），40d后生根率达到90％，平均生根数为6.0条，
根细长，根部无愈伤组织产生，有利于移栽（图7～
8）。 当NAA和IBA配合使用时，可以大大提高生根率
和平均根数以及生根质量，两种生长素相互作用产
生的效果比单独使用一种要好，这与众多文献报道
一致。
2.4 移栽
大叶常绿杜鹃幼苗保水力不强 ，1～3d后即萎
蔫，如果经过l～3d不萎蔫，则可继续存活，30d后统计
其存活率。 杜鹃的根系生长需要土壤有良好的通透
性，如果土壤空气含量不足，会影响根的发育和生
长。黄沙、珍珠岩、腐殖土是杜鹃种植中常用的基质，
黄沙具有良好的透气性，珍珠岩能起保温的作用，而
腐殖土则可提供杜鹃生长所需的营养。结果表明（表
6），混合基质比单一基质移栽效果好，存活率也较
高。 试验中腐殖土∶黄沙∶珍珠岩=4∶1∶1存活率最高，
达到90％，黄沙∶珍珠岩=1∶1和纯腐殖土移栽效果不
好，存活率低。黄沙的透气性，腐殖土的营养，加上珍
珠岩的保温作用大大提高了移栽存活率，改善根的
生长环境（图9）。
3 分析与讨论
杜鹃是喜酸性土壤植物，上海地下水位高，土壤
盐碱化程度高，严重限制了杜鹃优良品种的应用，采
用基因工程手段，转入耐盐基因，提高耐盐能力，是
其推广的前提。在基因工程育种过程中，不论是用基
因枪，还是通过农杆菌介导的转基因，都需良好的受
体，良好受体的建立是遗传转化的关键。 通过叶盘
法、愈伤组织再分化建立的受体系统，易接受外源基
因，转化率较高，是本试验的重要意义所在。
选择合适的起始材料，是植物组织培养过程中
能否快速顺利进行的关键步骤之一。 本试验取无菌
苗同一部位的叶片做为起始材料，生理状态一致的
前提下，不同的培养处理，得到不同的结果，试验误
差小，结果真实可靠，重复性强。
表4 不同激素及不同激素水平对不定芽再生的影响
培养基（mg·L-1） 接种数
出芽外
植体
MS0 30 2
MS+BA0.01+NAA 0.01 30 4
MS+BA0.02+NAA 0.01 30 7
MS+BA0.04+NAA 0.01 30 11
MS+BA0.08+NAA 0.01 30 9
MS+ZT0.01+NAA 0.01 30 9
MS+ZT0.02+NAA 0.01 30 15
MS+ZT0.04+NAA 0.01 30 21
MS+ZT0.08+NAA 0.01 30 19
诱导率
（%）
6.67
13.33
23.33
36.67
30.00
30.00
50.00
70.00
63.33
平均
出苗数
1
2
3
3
3
3
4
6
5
表5 不同激素及不同激素水平对生根的影响
培养基（mg·L-1） 接种数
生根率
（％）
平均
生根数
愈伤
程度
1/2MS+NAA 0.2 30 16.70 4.0 --
1/2MS+NAA 0.4 30 40.0 6.0 +
MS+NAA 0.2 30 6.70 2.3 --
MS+NAA 0.4 30 46.00 6.5 +
MS+NAA 0.6 30 38.00 6.0 ++
MS+NAA 0.8 30 13.30 3.0 +++
MS+IAA 0.4 30 25.00 2.5 +
MS+IBA 0.2 30 0.00 0.0 --
MS+IBA 0.6 30 10.00 1.7 ++
MS+NAA 0.2+IBA 0.4 30 90.00 6.0 --
MS+NAA 0.4+IBA 0.2 30 78.00 5.7 +
注: -- 无愈伤；+ 少量愈伤；++ 中量愈伤；+++ 大量愈伤
Note: -- no callus + a little callus ++ middling callus
+++ mass callus
表6 不同基质及不同基质配比对移栽成活率的影响
培养基（mg·L-1） 移栽数 成活数 成活率（%）
腐殖土∶黄沙∶珍珠岩=1∶1∶1 30 20 66.67
腐殖土∶黄沙∶珍珠岩=4∶1∶1 30 27 90.00
黄沙∶珍珠岩=1∶1 30 10 33.33
纯腐殖土 30 9 30.00
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本研究表明，以大叶常绿杜鹃幼嫩叶片为外植
体，即可以直接诱导成苗，也可以通过愈伤组织途
径成苗。 MS培养基为基本培养基，添加ZT 1.0mg/
L+NAA 0.1mg/L，暗培养5天，叶片可直接诱导再生
出不定芽；培养基MS+2，4-D 2.0mg/L+KT 0.2mg/L诱
导愈伤组织效果较好，增殖培养基与初代诱导不同，
最佳培养基为MS+ZT 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L；诱导成
苗时，添加的激素浓度大大降低，最佳培养基为MS+
ZT 0.04mg/L+NAA 0.01mg/L，分化率最高达到70%。
生根培养基为MS+NAA 0.2mg/L+IBA 0.4mg/L时，生
根率达到90％，平均生根数为6.0条，根长。腐殖土∶黄
沙∶珍珠岩=4∶1∶1的混合基质较适合常绿杜鹃试管
苗的炼苗移栽，存活率可达到90％。
参考文献
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