全 文 ：海南海桑遗传多样性的 ISSR研究
李海生1 , 陈桂珠1 , 施苏华2
(1.中山大学环境科学研究所 , 广东 广州 510275;
2.中山大学生命科学学院∥教育部基因工程重点实验室 , 广东 广州 510275)
摘　要:采用简单序列重复区间扩增 (ISSR)分子标记技术对分布于海南岛的海南海桑 Sonneratia hainanensis 4
个种群共 33个个体进行了遗传变异分析。11 条引物共扩增出 166 条带 , 其中 142条具多态性 , 多态位点百分率
为85.54%。在种群水平上多态位点百分率 14.46%～ 80.12%, 平均为 46.24%。期望杂合度 、 Shannon 信息指数在
物种水平上分别为:0.232 9和 0.361 9;在种群水平上分别为 0.153 8 和 0.231 7。依据 Gst值 , 海南海桑遗传变
异发生在种群内的个体间占 75.89%, 24.11%的遗传变异发生在种群间。 UPGMA 聚类结果为来自文昌的 2 个天
然种群聚为一类 , 东寨港引种栽培的 2个人工种群聚为另一类。Mantel检验表明海南海桑种群间的遗传距离与地
理距离间存在显著的正相关 (P<0.05)。种群遗传多样性与环境因子间的相关性分析表明:海南海桑的遗传多
样性水平与土壤总氮量 、 有机质含量呈显著负相关 (P <0.05)。
关键词:海南海桑 Sonneratia hainanensis;ISSR;遗传多样性;遗传分化;濒危;保护
中图分类号:Q16;Q948.1　　文献标识码:A　　文章编号:0529-6579 (2004)02-0067-05
　　海南海桑 Sonneratia hainanensis KO , E.Y.Chen
et W.Y.Chen 是海桑科海桑属植物 , 仅天然分布
于我国文昌市清澜红树林保护区东阁和头宛两处 ,
分布范围狭窄。据最新调查 , 海南海桑个体数量极
为稀少 , 在东阁有 2株 , 在头宛有 6株 , 在海南东
寨港红树林自然保护区内有引种栽培 , 不足 200株
个体 。目前 , 该物种已濒临灭绝 , 已载入 《中国植
物红皮书》 , 并被列入 《中国生物多样性保护行动
计划》 优先保护植物名录 。海南海桑作为沿海红树
林的组成成分之一 , 对于防风 、防浪 、 固堤 、保护
农田和村庄 、促淤造陆有显著的效果;其树干饱
满 , 材质好 , 生长速度较快 , 亦可作为我国红树林
可用材树种;海南海桑具有适应生理干旱的特殊形
态结构 , 对今后研究盐生植物和红树林的植物区系
有科学意义。因此 , 研究海南海桑濒危机理 , 从而
采取必要的保护措施是十分重要的 。
遗传多样性是生物多样性的重要组成部分 , 其
水平影响物种长期生存和进化潜力 。对稀有濒危植
物遗传样性和遗传结构的研究 , 是探讨其适应性 、
生存力的基础 , 也是分析致濒机理的基础 , 从而帮
助制定科学有效的保护策略和措施 。目前对海南海
桑的形态 、 解剖 、 细胞学 、 生理生态作过一些研
究 , 但在 DNA水平上的遗传多样性研究尚未见报
道 。ISSR (inter_simple sequence repeat)是一种新型
的分子标记 , 是由 Zietkiewicz等[ 1] 创建的一种简单
序列重复区间扩增多态性分子标记 。 ISSR分子标
记技术具有 DNA 样品用量少 , 操作简单 , 无需预
先知道受试基因组 DNA 序列 , 结果记录方便 , 实
验成本低 , 能提供丰富的关于基因组的信息等优
点 , 且比 RAPD 技术更加稳定可靠 , 实验重复性
好 , 因而是非常理想的分子标记 。 ISSR分子标记
已广泛用于遗传多样性分析 、绘制 DNA指纹图谱 、
品种鉴定 、 进化及分子生态学研究中 。因而本文采
用 ISSR分子标记技术来研究海南海桑的遗传变异 ,
以阐明其遗传多样性水平和遗传结构 , 并探讨种群
遗传多样性水平与环境因子间的相关性 , 为保护海
南海桑提供基础资料和科学依据 。
1　材料和方法
1.1　材　料
本研究对海南海桑分布区内的所有天然种群 ,
包括文昌东阁 (DG)、 文昌头宛 (TW)进行了采
样 , 对东寨港红树林保护区种植在林家湾 (LJW)、
三江 (SJ)的海南海桑引种种群亦作了取样分析。
采样时 , 采摘海南海桑的嫩叶 , 置于盛有硅胶的塑
胶袋中干燥保存 。同时采集各种群距地表 0 ～ 20 cm
收稿日期:2003-03-26
基金项目:教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目 (20010558004)
作者简介:李海生 (1971年生), 男 , 博士 , 讲师 , 作者现在广东教育学院生物系工作;
通讯联系人:陈桂珠;E_mail:chenguizhu@yeah.net
　第 43 卷　第 2 期
2004年　3 月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA　SCIENTIARUM　NATURALIUM　UNIVERSITATIS　SUNYATSENI
Vol.43　No.2
Mar.　2004 　
深处的土壤 , 供土壤分析用 。采样时间为 2001 年
12月。各种群的基本情况见表 1。
表 1　海南海桑取样种群的基本情况
Tab.1　The general situation of S.hainanensis
sampling populations
项目 DG TW SJ LJW
取样数 2 6 7 18
经度 110°49′49″110°47′52″110°36′49″110°35′11″
纬度 19°37′37″ 19°37′06″ 19°55′35″ 19°57′11″
降雨量 mm 1974 1974 1676.4 1676.4
w(总氮) 10 -3 1.166 1.142 0.705 0.373
w(总磷) 10 -3 1.035 0.188 0.362 0.384
w(总钾) 10 -3 3.973 1.573 6.396 3.815
w(有效氮) 10-6 238.03 113.06 58.14 44.35
w(有效磷) 10-6 9.15 3.30 3.21 4.63
w(有机质) 10-3 67.550 46.554 19.929 18.322
w(盐) 10-2 1.002 1.881 1.745 1.053
pH 5.93 4.45 5.77 5.18
Ψ (ms·cm-1) 3.3 4.3 5.3 3.2
1.2　DNA 提取
采用 CTAB法[ 2] 提取基因组 DNA。用电泳法测
其含量。
1.3　PCR扩增
对购自于哥伦比亚大学的 100 条 ISSR 引物
(UBC set No.9)进行了筛选 , 从中选取扩增条带清
晰 , 重复性较好的 11条引物(表 2)用于 PCR扩增 。
扩增反应在 PTC100TM Programmable Thermal Controller
(MJ Research Inc., 美国)PCR扩增仪上进行 。经实
验证实较好的扩增条件为每 10μL 反应体积含1 μL
10×buffer , 3.0 mmol L MgCl2 , 300 μmol L dNTPs ,
0.3μmol L 引物 , 1U Taq DNA聚合酶 (加拿大真达
公司), 10 ng 模板 DNA。扩增程序:94 ℃预变性
5 min , 之后进行 45个循环 , 每个循环包括94 ℃变
性45 s 、 52 ～ 53.5 ℃退火 (退火温度随引物而定)
(表 2)45 s 、 72 ℃延伸 1.5 min , 最后于 72 ℃延伸
7 min 。将结果置于 4 ℃冰箱保存 。
1.4　PCR产物鉴定
将PCR 扩增产物在用 0.5×TBE 配制的 w =
1.5%的琼脂糖凝胶中电泳分离。EB 直接加入胶
中 , 终浓度约为 0.5 mg L。以 100 bp DNA ladder
(100 ～ 3 000 bp)(上海生物工程公司)作为相对分
子质量标准 。在 60 mA的恒流下电泳 3 h。电泳结
束后在紫外检测仪上观察记录扩增产物的泳带 , 并
在凝胶成像系统中保存图像。
1.5　数据的统计和分析
1.5.1　种群遗传多样性及遗传结构分析　在琼
表 2　ISSR引物 、 序列 、 退火温度和
扩增后产生的带型数
Tab.2　Name of ISSR primers , sequence ,
annealing temperature and bands after amplification
引物 引物序列 退火温度 ℃记录带数多态带数
808 (AG)8C 53.5 11 8
809 (AG)8G 52.0 16 16
835 (AG)8(CT)C 53.5 20 19
836 (AG)8(CT)A 52.0 18 14
840 (GA)8(CT)T 53.0 15 14
842 (GA)8(CT)G 53.0 15 13
847 (CA)8(AG)C 53.5 14 14
857 (AC)8(CT)G 52.0 17 15
864 (ATG)6 53.5 14 8
868 (GAA)6 52.5 14 11
887 (AGT)(ACG)(AGT)(TC)7 52.0 12 10
总和 166 142
脂糖凝胶电泳图谱上同一 ISSR位点上有电泳带记
为 1 , 无电泳带的记为 0 ,作 0 , 1矩阵输入计算机。
应用 POPGENE 1.31程序 ,假定种群在这些 ISSR标
记位点处于 Hardy_Weinberg 平衡状态 ,统计下列参
数 。
(1)多态位点百分数 (P):扩增的 DNA片段
出现频率小于或等于 0.99的位点即为多态位点 ,
　　　　P=具有多态的位点数检测到的位点数 ×100%;
(2)平均每个位点的观察等位基因数 (N a);
(3)平均每个位点的有效等位基因数 (N e);
(4)期望杂合度 (h), 亦称Nei的平均基因多
样性;
(5)Shannon信息指数 (I);
(6)总的基因多样度 (Ht)和种群内的基因多
样度 (Hs);
(7)基因分化系数 (Gst)和基因流 (Nm);
(8)遗传距离 (D)和遗传一致度 (I)。
1.5.2　聚类分析　根据种群间 Nei 的遗传距离[ 3] ,
采用算数平均数的非加权成组配对法 (UPGMA 法)
进行聚类分析。使用软件为 NTSYSpc 2.02。
1.5.3　相关性分析　应用 NTSYSpc 2.02 软件的
Mantel统计学检验 , 进行种群间地理距离和遗传距
离之间的相关性分析 , 并作显著性检测。种群的遗
传多样性水平与环境因子间的关系 , 由 SPSS 11.0
软件得出。
2　实验结果
2.1　ISSR_PCR扩增结果
用 11条 ISSR引物扩增了 4个海南海桑种群共
68 中山大学学报 (自然科学版) 第 43 卷　
33个个体 , 共扩增出 166条带 , 其中 142条具多态
性 , P 为 85.54%。每个引物扩增的条带数为 11 ～
20条 (表 2), 平均每个引物扩增的条带数为 15.1
条 , 扩增的条带在 150 ～ 2 000 bp之间。 ISSR_PCR
扩增结果共检测出 33个基因型 , 即每个样品均有
独立的基因型。
2.2　海南海桑的遗传多样性
由表 3 可知 , 海南海桑在物种水平上 P 为
85.54%, 种群内的 P 在 14.46%～ 80.12%之间 ,
平均值为 (46.24 ±27.83)%。每位点的 N e 为
1.383 0。期望杂合度在物种水平上为 0.232 9 , 在
种群水平上为 0.153 8;Shannon信息指数在种群水
平上为 0.231 7 , 在物种水平上为 0.361 9。4个种
群中 , 来自于东阁(DG)、头宛(TW)的天然小种群
表现出较低的遗传多样性水平 ,东寨港引种栽培的
林家湾种群(LJW)和三江种群(SJ)表现出较高的遗
传多样性水平 ,其中种群个体数最高的林家湾种群
遗传多样性水平最高(P :80.12%, Ne :1.408 3 , h :
0.241 0 , I:0.367 6)。相关分析表明 ,随着种群内取
样个体数的增加 ,种群遗传多样性水平也相应增加 ,
但未达到显著性相关水平(P >0.05)。
表 3　海南海桑种群间遗传变异统计
Tab.3　The genetic variation statistics among populations of S.hainanensis ( x±SD)
种群 观察等位基因数 Na 有效等位基因数 Ne 期望杂合度 h Shannon 信息指数 I 多态位点百分数 P
DG 1.1446±0.3527 1.1022±0.2494 0.0599±0.1461 0.0874.±0.2133 14.46
TW 1.3614±0.4819 1.2052±0.3346 0.1208±0.1811 0.1828±0.2623 36.14
SJ 1.5422±0.4997 1.3305±0.3719 0.1934±0.2005 0.2891±0.2875 54.22
LJW 1.8012±0.4003 1.4083±0.3708 0.2410±0.1894 0.3676±0.2587 80.12
平均 1.4624±0.2783 1.2612±0.1352 0.1538±0.0797 0.2317±0.1224 46.24
总群体 1.8554±0.3527 1.3830±0.3479 0.2329±0.1786 0.3619±0.2425 85.54
2.3　海南海桑的遗传分化
由POPGENE分析 , 海南海桑所有群体总的基
因多样度为0.202 6 , 种群内基因多样度为 0.153 8 ,
种群间基因多样度为 0.048 8 , Gst为 0.241 1。换言
之 , 海南海桑种群间发生了一定的遗传分化 , 种群
间的遗传变异占总遗传变异的 24.11%, 75.89%的
遗传变异分布在种群内的个体间。种群间的遗传距
离(D)和遗传一致度(I)见表4。由表 4可见林家湾
种群和东阁种群的遗传距离最大(0.109 5),林家湾
种群和三江种群的遗传距离最小(0.050 1),遗传一
致度 I 值变化范围为 0.896 3 ～ 0.951 2 , 所有群体间
的平均遗传一致度为 0.925 3。根据Nei的遗传距离
将所有群体进行 UPGMA聚类 , 聚类结果将分布于
文昌的两个天然种群聚在一起 , 引种栽培的两个迁
地保护种群聚为一类 (图 1)。种群间基因流 (Nm)
的估测值为每代群体间平均为 0.787 0个个体 。对
海南海桑种群间的地理距离和 Nei的遗传距离作
Mantel统计检验 , 进行随机性检测 1 000 次 , 检验
结果表明遗传距离与地理距离之间的相关性较高
(r=0.880 4 , P <0.05), 达到了显著性相关。
2.4　海南海桑种群的遗传多样性与环境因子间的
相关性分析
　　利用 SPSS 11.0软件将海南海桑 4个种群的遗
传多样性指标 , 包括 N a , N e , h , I 和P 与各环境
因子间作相关性分析 , 结果见表 5。结果表明海南
海桑的种群遗传多样性水平与土壤总氮量 、土壤有
机质含量呈显著负相关 , 与其它各环境因子的相关
性均不显著 。　
表4　海南海桑种群间Nei的遗传一致度
(右上角)和遗传距离 (左下角)
Tab.4　Neis genetic identity(above diagonal)and
genetic distance(below diagonal)of S.hainanensis
种群 DG TW LJW SJ
DG ＊ 0.9443 0.8963 0.9154
TW 0.0573 ＊ 0.9145 0.9303
LJW 0.1095 0.0893 ＊ 0.9512
SJ 0.0884 0.0722 0.0501 ＊
图 1　海南海桑各种群基于Nei的
遗传距离 UPGMA 聚类图
Fig.1　Dendrogram of UPGMA cluster analysis based on
Neis genetic distance among populations of S.hainanensis
69　第 2 期 李海生等:海南海桑遗传多样性的 ISSR研究
表 5　海南海桑种群遗传多样性与
环境因子的相关性
Tab.5　Correlation between population genetic diversity of
S.hainanensis and environmental factors
环境因子 Na N e h I P
总氮 -0.9551) -0.9521) -0.9531) -0.9531) -0.9551)
总磷 -0.607 -0.624 -0.623 -0.626 -0.607
总钾 0.232 0.349 0.342 0.325 0.232
有效氮 -0.915 -0.944 -0.943 -0.942 -0.915
有效磷 -0.607 -0.656 -0.653 -0.651 -0.607
有机质 -0.935 -0.9771) -0.9751) -0.9711) -0.935
含盐量 -0.032 0.049 0.045 0.039 -0.032
pH -0.210 -0.138 -0.143 -0.157 -0.210
电导率 0.030 0.167 0.159 0.144 0.030
降雨量 -0.869 -0.921 -0.918 -0.911 -0.869
1)表示在 P <0.05水平上有显著意义
3　讨　论
3.1　海南海桑的遗传多样性
海南海桑尽管目前分布范围和个体数量非常有
限 , 但从实验结果来看 , 多态位点百分率 、 期望杂
合度在物种水平和种群水平均高于 Hamrick等[ 4] 对
165个属 449种植物的统计平均值 。这与一般认为
濒危物种的遗传多样性水平较低的观点并不吻合 。
原因可能在于本次研究采用 ISSR分子标记技术 ,
较等位酶 、 RFLP 、 RAPD技术可检测到更多的基因
位点 , 发现更加丰富的遗传信息[ 5 , 6] ;另外 , 同样
采用 ISSR分子标记技术 , Jian等[ 7] 研究了银叶树
Heritiera littoralis的遗传多样性 , 发现银叶树亦具有
较高的遗传多样性水平 , 在物种水平上 P 和 Ht分
别为 83.19%和 0.232。不过 , Ge 等[ 8] 应用 ISSR标
记研究了来自中国和泰国的角果木 Ceriops tagal 的
遗传多样性 , 发现 P 和 Ht 分别只有 8.96%和
0.016 , 对桐花树 Aegiceras corniculatum 的研究也得
出类似的结果(P:16.18%, Ht :0.039)[ 9] 。海南海
桑为多年生长命木本植物 , 以异交为主 , 这样的生
活史特征使海南海桑拥有较高的遗传多样性水平 。
另外 , 海南海桑较高的遗传多样性与它可能为杂种
起源有关[ 10] 。有研究表明 , 杂交能提高物种内的
遗传多样性水平[ 11] 。在种群水平上 , 在东寨港迁
地保护的两个种群中 , 遗传多样性高于分布于文昌
的两个天然种群 , 显然 , 海南海桑种群的遗传多样
性与种群大小紧密相关。一方面因为天然种群中个
体数少 , 所能检查到的变异自然偏低 , 另一方面虽
然东寨港的海南海桑实为文昌的海南海桑的后代 ,
但并未出现预期的奠基者效应事件 , 这可能是育苗
过程乃至定植于林地的幼树均受到较强的人工和自
然选择的影响而带来的遗传突变所致。赖焕林
等[ 12] 在研究马尾松种子园附近人工林的亲子代群
体遗传结构时 , 亦得出类似的结果。林家湾的海南
海桑种群内较高的遗传多样性可能跟该林分组成有
关 , 该林分的海南海桑包括几个龄级 , 不同龄级在
建立时都会遇到当时的选择压力 , 适宜的基因就保
留下来 , 因此积累了较多的基因 , 形成了较广的遗
传基础 。另外 , 本研究表明海南海桑种群的遗传多
样性与样地土壤的总氮量和有机质含量呈显著负相
关 , 即土壤总氮量越高 、有机质含量越高 , 种群遗
传多样性越低 , 表明氮 、有机质在维持海南海桑种
群遗传多样性方面可能起着较为重要的作用。在较
低的土壤营养情况下 , 较高的种群遗传多样性有利
于充分利用有限的营养资源[ 13] 。
3.2　海南海桑的遗传结构
海南海桑 的遗 传变异 大部 分在种 群内
(75.89%), 种群之 间有 了一 定的 遗传 分化
(24.11%)。种群间的基因流为 0.787。影响种群间
的基因流大小及种群遗传结构的因素很多 , 如繁育
系统 、分布范围 、种子传播机制 、演替阶段等[ 14] 。
海桑属植物是以异交为主的交配系统 , 主要靠蝙
蝠 、鸟[ 15] 、天蛾[ 16] 等传播花粉 , 造成了一定的基
因流动 , 而且由于海南海桑天然种群之间以及迁地
保护种群之间地理距离较近 , 基因流尚未产生严重
的障碍 , 加之在东寨港的海南海桑植株是在文昌采
种育苗而来的 , 实为文昌海南海桑植株的后代 , 种
群间有很近的亲缘关系 , 因而检测到的遗传变异主
要分布在种群内。海南海桑自然分布多为散生 , 未
有纯林 , 并且不连续分布 , 因此造成种群间一定的
遗传分化 , 海南海桑种群的遗传距离与地理距离呈
显著正相关 , 亦说明了一定的地理隔离对种群遗传
分化产生了影响。
3.3　海南海桑的保护
目前人们在红树林生长地搞水产养殖 , 因挖鱼
塘 、虾塘等砍掉了大量的红树林植物 , 红树林生长
的生境丧失 、生境遭到破坏 , 给海南海桑的生存带
来极大的威胁。在海南海桑天然种群和迁地保护种
群中 , 均很难发现其幼苗存在。原因与海南海桑母
树少 , 繁育能力差[ 10] 有关。海南海桑果实为浆果 ,
果实落地后 , 种子极易受螃蟹 、 蚂蚁啃食 、病虫危
害 , 再加上种子小 , 受涨退潮的影响 , 易被潮水冲
走 。另外 , 生长地可能缺乏种子萌发 、幼苗生长的
立地条件。因此 , 保护海南海桑的生境 , 对天然生
长的每一株海南海桑实行挂牌保护是当前首先要做
的事 , 尤其是分布于东阁的两株海南海桑 , 植株个
体高大 , 耸立于其它红树植物之中 , 是极为重要的
70 中山大学学报 (自然科学版) 第 43 卷　
种质资源 。鉴于海南海桑个体数少 , 面临的环境压
力大 , 除实施就地保护外 , 还应实行迁地保护工
作。海南海桑种群间已发生了一定的遗传分化 , 除
应继续加强对文昌东阁海南海桑种质资源的收集工
作外 , 为全面保护其遗传多样性 , 还应加强对文昌
头宛海南海桑的采种工作 , 进一步提高育苗 、造林
技术及回归引种工作 , 这方面的工作近年来在东寨
港红树林自然保护区取得了一定进展。另外 , 为弄
清楚海南海桑自然更新能力差的原因 , 应在海南海
桑的繁殖生态学上进一步开展研究 。
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Genetic Diversity of Sonneratia hainanensis (Sonneratiaceae)
Detected by Inter_simple Sequence Repeats(ISSR)Analysis
LI Hai_sheng1 , CHEN Gui_zhu1 , SHI Su_hua2
(1.Institute of Environmental Sciences , Sun Yat_sen University , Guangzhou 510275 , China;
2.Key Laboratory of Gene Engineering of the Ministry of Education∥
School of Life Sciences , Sun Yat_sen University , Guangzhou 510275 , China)
Abstract:Sonneratia hainanensis is an endangered mangrove species of Sonneratiaceae distributed only in Hainan
Island , China.Inter_simple sequence repeats(ISSR)markers were used to investigate the genetic variations within and
among 4 populations of S.hainanensis.Young leaf samples were collected from 33 individuals.Eleven ISSR primers
gave rise to 166 discernible DNA bands of which 142 (85.54%)were polymorphic , indicating a considerable genetic
variation at specific level.At the population level , the percentage of polymorphic bands (P)was from 14.46% to
80.12%, 46.24% on average.Expected heterozygosity (h)and Shannons information index (I)were 0.232 9 and
0.361 9 respectively at specific level , 0.153 8 and 0.231 7 at population level.A large proportion of genetic variance
(75.89%)was among individuals within population , 24.11%genetic variance was among populations.UPGMA cluster
analysis based on Neis(1972)genetic distance divided the populations into two main groups:two natural populations
TW and DG from Wenchang were in one group , two introduced populations LJW and SJ from Dongzhai Harborwere in the
other group.The Mantel test showed that genetic distance among populations was positively correlated with geographical
distance significantly.The correlation analysis showed that population genetic diversity level of S.hainanensis had
negative correlations with the content of total soil nitrogen and the content of soil organic matter significantly .
Key words:Sonneratia hainanensis;ISSR;genetic diversity;genetic differentiation;being endangered;conservation
71　第 2 期 李海生等:海南海桑遗传多样性的 ISSR研究