全 文 ：收稿日期:2014-11-24
基金项目:青海省科技计划项目(2014-HZ-810，2014-NS-516);中国教育部重大攻关课题(212188)
作者简介:马涛(1989-)，女，在读硕士研究生，专业方向:天然药物化学;Tel:15209719164，E-mail:matao15209719164@ 163. com。
* 通讯作者:丁晨旭，E-mail:cxding@ nwipb. cas. cn。
响应面法优化假北紫堇总生物碱提取工艺
马 涛1，2，张秋龙1，2，丁晨曦3，索有瑞1，王洪伦1，丁晨旭1*
(1. 中国科学院西北高原生物研究所藏药重点研究实验室，青海 西宁 810001;2. 中国科学院大学，北京
100049;3. 青海省红十字医院，青海 西宁 810000)
摘要 目的:采用响应面法优化热回流提取假北紫堇总生物碱的工艺研究。方法:在单因素试验基础上，选取
4 因素 3 水平响应面法建立假北紫堇总生物碱得率与影响因子的多元二次回归方程，得到总生物碱的最佳提取条
件。结果:假北紫堇总生物碱的最佳提取工艺为:液料比 25 mL /g、提取时间 1. 7 h、提取温度 53 ℃、乙醇浓度 73%，
总生物碱得率为 1. 62%。结论:实验结果表明二次多项式建立的数学模型具有良好的预测性，响应面法筛选得到
的总生物碱提取工艺稳定、可行，重现性好。
关键词 假北紫堇;总生物碱;响应面法;热回流提取
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)08-1736-05
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 08. 044
藏药假北紫堇 Corydalis pseudoimpatiens Fedde
为罂粟科紫堇属植物，主要分布于青海、甘肃、四川、
西藏等地〔1〕，生于海拔 2 850 ～ 4 500 m 的山坡或山
谷石砾处。假北紫堇以全草入药，具有活血散瘀、行
气止痛、清热解毒的功效，主治胃脘痛、肝炎、胆囊
炎、腰腿痛、痈肿等〔2〕。化学成分研究表明本属植
物主要含有异喹啉类生物碱〔3-7〕。本文采用 Box-
Behnken 响应面法得到了假北紫堇总生物碱得率的
最佳提取工艺。现将结果报道如下。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 759 紫外分光光度计，上海精密科学仪
器有限公司;AL204 电子天平，梅特勒-托利多仪器
(上海)有限公司。
1. 2 材料 实验用假北紫堇采自青海群加乡，经
中科院西北高原生物研究所植物学专家卢学峰副研
究员鉴定为罂粟科紫堇属植物假北紫堇 Corydalis
pseudoimpatiens Fedde的干燥全草，自然阴干，粉碎;
leptopidine对照品由中国科学院西北高原生物研究
所藏药研究重点实验室制得(质量分数 97. 8%)。
2 方法与结果
2. 1 生物碱得率的测定
2. 1. 1 检测波长的选择:在 250 mL 分液漏斗中加
入 0. 2 mol /L冰醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 3. 6)20 mL
后，加入 4 mL溴甲酚绿指示液，摇匀，以 50 mL氯仿
萃取，取萃取液 10 mL转移至 100 mL 量瓶中，加氯
仿定容。氯仿作为随行空白。在 200 ～ 800 nm 波长
范围内进行扫描，结果在 415 nm 波长处有最大吸
收。
2. 1. 2 标准曲线的制备:精密称取干燥恒重的 lep-
topidine 对照品 6. 40 mg 于 25 mL 量瓶中，甲醇定
容，摇匀。量取对照品溶液 1. 0、2. 0、4. 0、6. 0、8. 0
mL，分别置于 25 mL 量瓶中，加入甲醇定容，摇匀。
分别取上述 5 种溶液 10 mL，在 60℃下减压蒸干。
待加入 20 mL缓冲液溶解后分别置于分液漏斗中，
加入溴甲酚绿指示液摇匀，反应 5 min 后加入氯仿
30 mL，充分振摇，静置。分取氯仿层于已放入少量
无水硫酸钠的带塞锥形瓶，以上述缓冲液同法操作，
所得氯仿液作空白，以吸光度值 A 为纵坐标，对照
品浓度(μg /mL)为横坐标，绘制标准曲线〔8〕，得到
吸光度(y)与浓度(x)之间的回归方程:y = 0. 013x
－ 0. 056，r = 0. 9995，表明对照品浓度在 10 ～ 80 μg /
mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。
2. 1. 3 得率计算:依据上述标准曲线和吸光度值
进行假北紫堇总生物碱含量测定，并计算假北紫堇
中生物碱的提取得率。
2. 2 假北紫堇生物碱提取的单因素试验考察 称
取假北紫堇粗粉 5 份，每份 1. 00 g，分别考察液料
比、提取时间、提取温度、乙醇浓度和提取次数 5 个
单因素对总生物碱得率的影响。
2. 2. 1 液料比对总生物碱得率的影响:当液料比
分别为 24 和 32 mL /g 时，生物碱得率均达到较大
值，且数值相近(图 1)。其原因主要是在此范围内，
溶剂用量的增加有助于生物碱的浸出，当液料比达
到 24 mL /g时，液料比的进一步增加对提取率的影
响不大。故选取适宜生物碱提取的液料比为 24
mL /g 。
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图 1 液料比对假北紫堇总生物碱得率的影响
2. 2. 2 提取时间对总生物碱得率的影响:总生物
碱得率在提取时间为 1. 5 h 时达到最大值，当时间
超出 1. 5 h后，总生物碱得率反而呈现出下降趋势
(图 2)。可能是因为随着提取时间的增加部分不太
稳定的生物碱发生了降解。故选取 1. 5 h 作为总生
物碱的提取时间。
图 2 提取时间对假北紫堇总生物碱得率的影响
2. 2. 3 提取温度对总生物碱得率的影响:当提取
温度在 40 ～ 50 ℃范围内，总生物碱得率随着温度的
升高而增加;超过 50 ℃时，总生物碱得率反而略有
所降低(图 3)。这是因为温度升高后，生物碱的溶
出量减少;也可能由于过高的温度使得生物碱结构
发生改变，故选择 50℃为较适宜的提取温度。
图 3 提取温度对假北紫堇总生物碱得率的影响
2. 2. 4 乙醇浓度对总生物碱得率的影响:在乙醇
浓度为 70%时，总生物碱得率最高，随着乙醇浓度
的继续增大，总生物碱得率呈下降趋势(图 4)。当
乙醇浓度较小时，总生物碱的溶解度较小，随着乙醇
浓度的增大，也会将样品中的油脂类、三萜类等物质
提取出来，不利于生物碱的提取。因此选取总生物
碱提取的乙醇浓度为 70%。
图 4 乙醇浓度对假北紫堇总生物碱得率的影响
2. 2. 5 提取次数对总生物碱得率的影响:提取次
数由 1 变为 2 时，总生物碱得率大幅增加，当提取次
数为 3 次及超过 3 次时，总生物碱的得率增加缓慢
(图 5)。故选择提取次数为 2 次。
图 5 提取次数对假北紫堇总生物碱得率的影响
2. 3 响应面法优化提取工艺 综合单因素试验结
果进行极差分析，在固定提取次数 2 次的条件下优
选出 4 个主要影响因素，按照响应面试验设计 4 因
素 3 水平(共 29 个试验点，5 个中心点)的方案进行
生物碱提取。每组试验重复 3 次，取其平均值。试
验设计因素编码及水平见表 1。29 组响应面试验结
果见表 2。方差分析见表 3。
对试验结果进行响应面软件分析，经二次回归
拟合后得到假北紫堇总生物碱得率(Y)与上述 4 个
因素之间的模拟方程为:Y = 1. 62 + 0. 030A + 0. 11B
+ 1. 865 × 10 －3C + 0. 096D + 0. 025AB － 1. 350 × 10 －3
AC －2. 421 × 10 －3 AD + 0. 10BC + 0. 035BD + 8. 150 ×
10 －3CD －0. 14A2 －0. 18B2 －0. 073 C2 －0. 19D2。该回
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表 1 中心组合设计因素与水平表
因素
水平
A液料比
/(mL/g)
B提取
时间 /h
C提取
温度 /℃
D乙醇
浓度 /%
－ 1 16 1 50 60
0 24 1. 5 60 70
1 32 2 70 80
归模型 F 检验为显著(P ＜ 0. 01)，其失拟项在 α =
0. 05 水平上为极显著(P ＜ 0. 01)，其决定系数 Ｒ2 =
0. 9659，说明该拟合方程与实际情况相符，且误差较
小，能充分反映出各因素与响应值之间的关系，其影
响不是呈简单的线性关系。通过该方程发现，各种
因素之间存在一定的交互作用，其中 B、D、BC、A2、
B2、C2、D2 均呈极显著影响(P ＜ 0. 01)，A 呈显著影
响，C、AB、AC、AD、CD、BD 之间的交互作用均不显
著。从单因素水平观察，其影响顺序为:B(提取时
间)＞ D(乙醇浓度)＞ A(液料比)＞ C(提取温度)。
在有交互作用存在下，对假北紫堇总生物碱得率的
影响顺序为:BC ＞ BD ＞ AB ＞ CD ＞ AD ＞ AC。
2. 6. 2 响应面分析:从各因素之间两两相互作用
的响应面图形(图 6)观察，曲线走势越平滑，其影响
越小;图形曲线走势较陡，说明其影响最为显著。由
Design-Expert 7. 0 软件进行系统分析，得出影响假
北紫堇总生物碱得率的最佳提取工艺条件为:液料
比 25. 11 mL /g、提取时间 1. 72 h、提取温度
53. 44℃、乙醇浓度 72. 98%，此时总生物碱得率理
论值为 1. 66%，结合实际操作修正后的工艺条件
为:液料比 25 mL /g、提取时间 1. 7 h、提取温度为
53℃、乙醇浓度为 73%。按照此优化条件进行 3 组
表 2 响应面试验结果
编号
A液料比
/(mL/g)
B提取
时间 /h
C提取
温度 /℃
D乙醇
浓度 /%
Y总生物碱
得率 /%
1 16 1. 5 40 70 1. 4078
2 16 1. 5 50 60 1. 1568
3 32 1. 5 40 70 1. 4089
4 24 1 40 70 1. 3944
5 16 2 50 70 1. 3344
6 24 1. 5 50 70 1. 6218
7 24 1. 5 50 70 1. 6220
8 24 1. 5 50 70 1. 6321
9 24 1. 5 40 60 1. 1833
10 24 1. 5 40 80 1. 4472
11 32 1 50 70 1. 1907
12 24 1. 5 50 70 1. 6038
13 16 1 50 70 1. 1561
14 16 1. 5 50 80 1. 3411
15 32 1. 5 50 60 1. 2551
16 24 1 60 70 1. 1561
17 24 1 50 60 1. 1203
18 24 2 40 70 1. 4018
19 24 1. 5 50 70 1. 6187
20 24 2 60 70 1. 5752
21 24 1. 5 60 80 1. 5197
22 24 2 50 80 1. 4505
23 24 1. 5 60 60 1. 2231
24 32 1. 5 50 80 1. 4297
25 16 1. 5 60 70 1. 3979
26 24 1 50 80 1. 1689
27 32 1. 5 60 70 1. 3936
28 24 2 50 60 1. 2627
29 32 2 50 70 1. 4704
表 3 拟合二次多项式模型的方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 ＞ F 显著性
模型 0. 74 14 0. 053 28. 32 ＜ 0. 0001 ＊＊
A 0. 010 1 0. 010 5. 63 0. 0325 *
B 0. 14 1 0. 14 76. 85 ＜ 0. 0001 ＊＊
C 4. 176 × 10 －5 1 4. 176 × 10 －5 0. 022 0. 8829
D 0. 11 1 0. 11 59. 95 ＜ 0. 0001 ＊＊
AB 2. 573 × 10 －3 1 2. 573 × 10 －3 1. 39 0. 2588
AC 7. 290 × 10 －6 1 7. 29 × 10 －6 3. 926 × 10 －3 0. 9509
AD 2. 345 × 10 －5 1 2. 345 × 10 －5 0. 013 0. 9121
BC 0. 042 1 0. 042 22. 83 0. 0003 ＊＊
BD 4. 853 × 10 －3 1 4. 853 × 10 －3 2. 61 0. 1282
CD 2. 657 × 10 －3 1 2. 657 × 10 －4 0. 14 0. 7109
A2 0. 13 1 0. 13 72. 38 ＜ 0. 0001 ＊＊
B2 0. 20 1 0. 20 108. 91 ＜ 0. 0001 ＊＊
C2 0. 035 1 0. 035 18. 68 0. 0007 ＊＊
D2 0. 24 1 0. 24 128. 69 ＜ 0. 0001 ＊＊
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续表 3
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 ＞ F 显著性
残差 0. 026 14 1. 857 × 10 －3
失拟项 0. 026 10 2. 558 × 10 －3 24. 55 0. 0037 ＊＊
纯误差 4. 167 × 10 －4 4 1. 042 × 10 －4
总差 0. 76 28
决定系数 Ｒ2 = 0. 9659;矫正的决定系数 Ｒ2adj = 0. 9318
注:＊＊P ＜ 0. 01，差异极显著;* P ＜ 0. 05，差异显著
图 6 各两两因素交互作用对假北紫堇总生物碱得率影响的响应面图
平行试验，得其平均实测值为 1. 62%，与其理论值
偏差为 2. 41%，可见采用上述响应面法优化的提取
条件可靠。
3 结论
用热回流法提取假北紫堇中总生物碱，根据单
因素试验结果，采用 Box-Behnken 试验设计以及响
应面分析得出最优工艺条件为:液料比 25 mL /g、提
取时间 1. 7 h、提取温度为 53 ℃、乙醇浓度为 73%。
本实验采用 Box-Behnken响应面法首次对假北紫堇
中总生物碱的提取工艺进行了优化，为其进一步开
发提供了科学、合理的理论和实验依据。
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参 考 文 献
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·0471· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 8 期 2015 年 8 月