全 文 ：4　讨论
大鼠长期毒性实验以 3个剂量(即 20, 9, 4.5 g/kg,分别为临
床拟用剂量的 222, 100, 50倍)连续给药 6个月及停药 2周后 , 对
大鼠一般状况 、体质量增长无明显影响;血液学指标及血液生化
学指标均在正常范围内 , 对大鼠心 、肝 、脾 、肺 、肾 、脑 、睾丸 、子宫
等重要脏器重量 , 脏器系数与对照组比较均无显著差异 , 并对大
鼠心 、肝 、脾 、肺 、肾 、脑 、睾丸 、子宫等重要脏器进行组织检查也未
见明显病理改变。故本实验结果提示生津利咽含片大鼠 6个月
长期毒性实验 , 未发现明显的毒性反应及延迟性毒性反应 , 可以
安全地应用于临床。
参考文献:
[ 1 ] 　陈　奇.中药药理研究方法学 [ M].北京:人民卫生出版社 , 1993:
112.
[ 2 ] 　中华人民共和国卫生部药政管理局.中药新药研究指南 [ S].北京:
人民卫生出版社 , 1994:203.
收稿日期:2009-05-08;　修订日期:2009-11-20
基金项目:国家自然科学基金(No.30772714)
作者简介:王永奇(1946-),男(汉族),吉林德惠人 ,现任大连大学生物工程学院教授 ,博士学位 ,主要从事天然活性物质的研究工作.
西南山茶抗 IgE介导 I型过敏
有效部位及有效成分的研究
王永奇 ,侯　蕾 ,史丽颖 ,唐　玲 ,郭　雨 ,牟红梅 ,冯宝民
(大连大学生物工程学院 ,辽宁 大连　116622)
摘要:目的 以致敏大鼠血清免疫球蛋白 E(IgE)和白三烯(LT)、全血和肺泡灌洗液(BALF)中的嗜酸性粒细胞(EOS)及
肺组织炎症面积为活性指标 ,跟踪研究西南山茶叶抗 IgE介导 I型过敏的有效部位和有效成分。 方法 西南山茶叶用
95%乙醇提取 , 提取物用石油醚 、醋酸乙酯萃取 , 醋酸乙酯萃取物进行化学分离。用卵白蛋白(OVA)和氢氧化铝 [ Al
(OH)3 ]的混合液致敏和诱发 , 制成 I型过敏反应动物模型。将实验动物随机分组即正常组 ,模型组 , 孟鲁司特钠(Men-
glusitena)组 ,各样品的低 、高剂量组。采用 ELISA法测定致敏大鼠血清 IgE和 LT含量;采用细胞计数法 , 检测大鼠全血
和 BALF中 EOS数量;通过病理学检查 , 检测肺组织炎症面积。结果 得到 95%乙醇提取物(总黄酮 10.95%, 总多酚
15.73%)(1)、石油醚萃取物(2)、醋酸乙脂萃取物(总黄酮 39.38%, 总多酚 20.01%)(3)、水层(4)。化学分离得到 7个
黄酮醇类化合物 , 其槲皮素(5)含量最高(5g)。 1、3、5均可降低血清中 IgE和 LT含量 ,强弱顺序为 1 <3<5;1、3、5均能
减少全血和 BALF中 EOS数量 ,强弱顺序为 1<3<5;1、 3、5均可减少肺组织炎症面积 , 强弱顺序为 1<3<5。结论 西南
山茶叶抗 IgE介导 I型过敏反应的有效部位为黄酮醇类酚性成分。有效成分或代表性成分为槲皮素 , 其活性强度优于孟
鲁司特钠。
关键词:西南山茶;　有效部位;　有效成分;　过敏反应;　炎症
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)03-0519-03
StudyoftheEffectivePartandConstituentfromLeavesofCamalliapitardiCoh.StSea-
lyontheAnti-AlergyofIgEInvolvedinTypeI
WANGYong-qi,HOULei,SHILi-ying,TANGLing,GUOYu,MUHong-mei,FENGBao-min
(ColegeofBioengineeringofDalianUniversity, Dalian, Liaoning116622, China)
Abstract:ObjectiveTotrackandstudytheeffectivepartandconstituentfromleavesofC.pitardiCoh.St.Sealyontheanti–
allergyofIgEinvolvedintypeIaccordingtotheactivitieswiththeserumIgEandLT, EOSinwholebloodandBALF, inflamma-
tioninpulmonarytissueofsensitizedrats.MethodsTheleavesofC.pitardiwereextractedbyEtOHpetroleumetherandEtOAC
inorderandtheEtOACextractionswereisolatedbysilicagelcolumeandHPLC.RatsweresensitizedwiththemixtureofOVA
andAl(OH)3 toestablishtheexperimentalanimalmodeloftypeIallergy.Theanimalsweredevidedintofivegroupsrandomly,
namelynormalgroup, modelgroup, Menglusitenagroup, sample(low-andhigh-dose)groups.TheIgEandLTcontentsinser-
umofsensitizedratsweremeasuredwithELISAmethod.Theinflammatoryareainpulmonarytissuethroughthepathologiealex-
amination.ResultsTogetEtOHextraction(flavonecontent10.95%, polyphenolcontent15.73%)(1), petroleumetherextrac-
tion(2), EtOACextraction(flavonecontent39.38%, polyphenolcontent20.01%)(3), H2Oextraction(4).Toget7 flavonols
compoundsthroughchemicalisolation, amongthemquercetin(5)contentwasthehighest(5g).1, 3, 5 coulddecreasethecontents
ofIgEandLTinserum, theactivesequencewas1<3<5;1, 3, 5couldreducethequantitiesofEOSinwholebloodandBALF,
theactivesequencewas1<3<5;1, 3, 5couldreducetheinflammatoryareainpulmonarytissue, theactivesequencewas1<3
<5.ConclusionTheeffectivepartfromleavesofC.pitardiontheanti-allergyofIgEinvolvedintypeIisflavonolconstitu-
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ents.Theeffectiveconstituentisquercetin.ItismoreexcelentthanMenglusitena.
Keywords:CamalliapitardiiCoh.StSealy;　Effectivepart, 　Effectiveconstituent;　Alergicreaction;　Inflammation
　　根据过敏反应发生机制和临床表现 , 将过敏反应分为 Ⅰ ,
Ⅱ , Ⅲ , Ⅳ四种类型.其发病机制Ⅰ , Ⅱ , Ⅲ型为抗体参与的反应 ,
Ⅳ型为致敏 T细胞介导的反应。
西南山茶 CamelliapitardiCoh.St.Sealy系山茶科山茶属红
山茶组植物 , 分布于云南 、四川 、广西 、贵州等省 、自治区 , 是山茶
属植物中分布最广的品种之一。
我们对山茶属植物的研究始于 2002年 [ 1 ～ 13] , 在对山茶属植
物抗骨质疏松植物雌激素的研究过程中发现山茶属植物普遍含
有大量的黄酮醇类酚性成分 , 其中西南山茶含量最高 ,引发我们
对其抗过敏性哮喘的研究。
1 　材料与仪器
1.1　动物 Wistar大鼠 60只 , 雄性 , 170 ～ 180 g, 购自吉林大学
实验动物中心 , 合格证号:SCXK-(吉)2003-0007。
1.2 　药品 组分 1, 3, 5号 ,均由本研究组提供;孟鲁司特钠片 ,
杭州默沙东制药有限公司 , 批号:08040;上述药物用时以 5%吐
温 -80配成混悬液 , 4℃保存 , 均灌胃(ig)给药。
1.3　 试剂 卵白蛋白 , 北京鼎国生物技术有限责任公司 , Sigma
分装 , LOT:056K0729;大鼠白三烯(LT)、免疫球蛋白 IgEELISA
检测试剂盒 , BiowenCo;LtdCanada, LOT:2008/08/11;瑞氏 -姬
姆萨染色液 , 珠海贝索生物技术有限公司 , LOT:070202。
1.4 　仪器 680型全自动酶标仪 , 美国 BIO-RAD伯乐公司产
品;显微镜 ,日本 OLYMPUS公司 。
1.5　药物的提取与分离 西南山茶叶 , 粉碎 , 用 95%乙醇提取 ,
得乙醇提取物(总黄酮含量 10.95%,总多酚含量 15.73%)(1)。
乙醇提取物依次用石油醚 、醋酸乙酯萃取 , 得石油醚萃取物(2)、
醋酸乙酯萃取物(总黄酮含量 39.38%, 总多酚含量 20.01%)
(3)、水层(4)。对醋酸乙酯萃取物进行化学分离 , 得到槲皮素
(5)。
2 　方法
2.1　 模型建立 [ 14 , 15] 大鼠一次性腹腔注射含卵白蛋白 1 mg和
氢氧化铝 10mg的生理盐水 1 ml, 2周后尾静脉注射卵白蛋白 15
mg/kg激发哮喘 , 5 ～ 10 min后出现喘促 、咳嗽等呼吸道痉挛梗阻
症状提示造模成功。 1次 /d, 连续 3次。空白对照组注射等体积
生理盐水。
2.2 　分组与给药 大鼠随机分组 , 分别为正常对照组 , 模型对
照组 , 孟鲁司特钠 1 mg/kg组 , 1, 3, 5号样品各设高 、低两个剂量
组。各给药组与致敏前 1 h至末次攻击前 1 h每天 ig给药 1次 ,
正常对照组及模型对照组给予同体积 5%吐温 -80水溶液。
2.3 　测定指标及方法
2.3.1　外周血 IgE与 LT检测 大鼠末次攻击后 24 h, 300 mg/
kg水合氯醛腹腔注射麻醉 , 腹主动脉采血 , 3 000 r/min离心
10min分离血清 ,按 ELISA试剂盒操作要求 , 以全自动酶标仪于
450nm测定 A值 , 通过标准曲线计算全血 IgE、LT含量。
2.3.2　全血嗜酸性粒细胞计数 全血镜下计数白细胞数;全血
涂片 , 瑞氏 -姬姆萨染色 ,镜下进行白细胞分类计数 ,计数 200个
白细胞中嗜酸性粒细胞所占百分数 ,按全血白细胞数 ×嗜酸性粒
细胞(%), 计算嗜酸性粒细胞数量。
2.3.3　肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞计数 大鼠腹主动脉采血处
死 , 消毒后打开胸腔 ,左侧肺支气管插管 , 缓慢注入 D-Hanks液
5 ml,停留 10s,缓慢抽回 , 重复 3次 , 回收液约 4 ml, 注入消毒试
管 , 1 500 r/min离心 15min, 取少量白细胞涂片 ,按全血方法进行
白细胞分类计数 ,剩余沉淀用 4 ml生理盐水稀释 , 镜下进行白细
胞计数 ,按全血方法计算嗜酸性粒细胞数量。
2.3.4　组织病理学检查 大鼠腹主动脉采血处死后 , 立即剖去
右侧肺组织 , 10%多聚甲醛固定 ,石蜡包埋切片 , HE染色 , 镜下观
察肺组织病理学改变。
2.4 　统计学处理 计量资料以 x±s表示 , 方差齐性采用 F检
验 , 两组间均数差异性采用 t检验(方差不齐时采用 t检验校正
公式), P<0.05认为有统计学意义。
3 　结果
3.1　对过敏性哮喘大鼠血清 IgE、LT含量的影响 与正常对照组
大鼠比较 , 模型对照组大鼠血清 IgE、LT含量明显增高(P<
0.01)。不同组分灌胃给药大鼠同对照组比较 , 均有不同程度依
次降低 , 5号最强 , 3号次之 ,但较 1号为强。结果见表 1。
表 1　对过敏性哮喘大鼠血清 IgE、LT含量的影响( x±s)
组别 剂量 C/mg· kg-1 IgE/ng· L-1 LT/pg· L-1
正常对照 - 4.88±1.77 3.21±0.51
模型对照 - 22.05±13.93## 19.96±6.61##
孟鲁司特钠 1 7.44±3.64＊＊ 3.54±0.55＊＊＊
1号 400 14.29±11.73 14.69±5.57
100 14.96±8.54 15.08±7.12
3号 400 10.21±6.07＊ 14.08±5.48＊
100 14.16±13.18 14.22±7.77
5号 40 5.75±0.77＊＊ 3.04±0.46＊＊＊
10 7.54±1.67＊＊ 3.08±0.48＊＊＊
　　与正常组比较 , ##P<0.01;与模型对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<
0.01, ＊＊＊P<0.001;n=10
3.2　对过敏性哮喘大鼠全血与BALT中 EOS的影响 与正常对
照组大鼠比较 , 模型对照组大鼠全血与 BALF中 EOS数明显增
高(P<0.01), 同模型对照组比较 1, 3, 5号可使全血中 EOS数
量明显降低 ,其中 5号作用最强 , 3号次之 , 1号作用不明显;1
号 、3号 、 5号可使 BALF中 EOS数量明显降低 , 其中 5号作用最
强 , 3号次之 , 1号作用不明显。结果见表 2。
表 2　对过敏性哮喘大鼠全血与 BALF中 EOS数的影响( x±s)
组别 剂量C/mg· kg-1
EOS
全血 / ×108 肺泡灌洗液 /×107
正常对照 - 2.26±0.70 3.62±0.96
模型对照 - 4.60±1.13### 7.56±3.51##
孟鲁司特钠 1 2.51±1.08 4.39±1.59
1号 400 3.78±0.84 5.68±1.60
100 3.81±1.27 5.87±0.84
3号 400 3.30±1.46＊ 4.97±1.22＊
100 3.62±1.33 5.77±1.76
5号 40 2.42±1.13＊＊＊ 3.73±1.18＊＊
10 2.98±0.84＊＊ 4.21±1.69＊
　　与正常组比较 , ##P<0.01;与模型对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01,
＊＊＊P<0.001;n=10
3.3 　对过敏性哮喘大鼠肺组织病理形态的影响 正常对照组
大鼠肺组织结构正常 ,肺泡内无炎细胞浸润 、渗出。模型对照组
的肺泡 、肺泡囊 、肺胞管明显变小 , 肺间质明显增生 , 其中以各
类成纤维细胞 、嗜酸性粒细胞为主 , 中性粒细胞较少 , 肺内未见
明显的白细胞渗出和液体渗出。主要表现为成纤维细胞为主的
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 3期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.3
炎症。 1, 3, 5号给药后肺组织面积明显减小 , 5号最强 , 3, 1号次
之。结果见表 3。
4　讨论
本实验以卵白蛋白为抗原 ,复制大鼠过敏性哮喘 、炎症模型 ,
通过特异性 IgE的产生 、血清炎症介质白三烯含量变化 、全血和
肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量变化及肺组织炎性细胞浸润炎
症面积增减 , 对西南山茶叶 95%乙醇提取物(总黄酮含量
10.95%, 总多酚含量 15.73%)、乙醇提取物的醋酸乙酯萃取物
(总黄酮含量 39.38%, 总多酚 20.01%)槲皮素的抗 IgE介导 I
型过敏进行了研究。结果表明各项指标依次降低 、减少和减小。
其中槲皮素作用最强 , 优于阳性对照药孟鲁司特钠。由此确认
西南山茶抗 IgE介导 I型过敏的有效部位为黄酮醇类酚性成分 ,
其有效成分或代表性成分为槲皮素。
表 3　抗过敏性哮喘组分对过敏性哮喘大鼠肺组织炎症的影响
组别 剂量C/mg· kg-1
炎症面积
正常 <25% <50% <75% >75% U值 P值
正常对照 - 10
模型对照 - 0 1 2 7
孟鲁司特钠 1 10 0 0 0 4.141 <0.01
1号 400 0 1 2 7 0 >0.05
100 0 2 4 4 1.2636 >0.05
3号 400 2 2 2 4 1.5829 >0.05
100 0 1 2 7 0 >0.05
5号 40 9 1 0 4.0206 <0.01
10 10 0 0 0 4.141 <0.01
　　n=10
　　IgE在过敏反应中起重要作用 , 机体吸入抗原后产生特异性
IgE抗体 , IgE与肥大细胞膜上 IgEFC段高亲合力受体结合 , 使
机体呈致敏状态(图 1)[ 16] 。
组胺 、白三烯 、血小板活化因子通称为过敏反应三大介质 ,
但与 I型过敏反应相关的是组胺和白三烯 , 而与支气管哮喘和过
敏性鼻炎密切相关的是白三烯 , 它引起肺气管收缩作用比组胺
大 1 000倍。活性成分是 LTC4.D4.E4 , 而 LTB4能吸引嗜酸性粒
细胞 , 这些白细胞大量出现在炎症部位 , 所以白三烯被称之为
IgE介导 I型过敏反应的罪魁祸首(图 1)[ 16] 。
图 1　过敏反应机理
嗜酸性粒细胞增多为过敏性哮喘的特征变化 ,它能产生多种
毒性蛋白 , 可直接损伤气道上皮和肺组织 , 引起气道上皮剥离和
气道高反应性 [ 17] 。
孟鲁司特系进口喹啉类合成药是刚刚完成临床观察上市的
新药 , 也是目前唯一的白三烯拮抗剂。其上市使用后的不良反
应是血管性水肿 、嗜睡 、痛痒 、幻觉 、烦躁不安 、心悸 、恶心 、呕吐 、
消化不良 、腹泻等。所以努力从天然资源中寻找高效低毒 、快速
灵敏的白三烯拮抗剂仍然是摆在药学工作者面前的迫切任务。
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