全 文 ：红树植物海桑简单重复序列区间(ISSR)条件的优化
李海生1-2 ,陈桂珠2
(1.广东教育学院 生物系 ,广东 广州 510310;2.中山大学 环境科学研究所 ,广东 广州 510275)
　　摘要:海桑(Sonnerat ia caseolaris(L.)Eng ler)是海桑科一种重要的红树植物.
为利用 ISSR分子标记研究海桑的遗传多样性 ,对影响 ISS R-PCR的多个因素 ,包括
Taq酶的用量 、Mg2+浓度和 dNTP 浓度 、引物浓度及其退火温度 、模板 DNA 浓度等
进行研究 ,确定了海桑 ISSR-PCR 分析的最适条件:10 μL PCR反应体积中 , 10×
buf fer(100 mmol·L-1 KCl , 80 mmol·L-1(NH4)2SO4 , 100 mmol·L-1 Tris-HCl , pH
9.0 , 0.5%NP-40)1 μL ,0.35 U Taq 酶 ,2 ～ 3.75 mmol·L-1 Mg 2+ ,300 μmol·L -1
dNTP ,0.3 μmol·L-1引物 ,10 ng 模板 DNA.
关键词:海桑;ISSR;优化
中图分类号:Q 503　文献标识码:A　文章编号:1007-8754(2004)02-0080-04
收稿日期:2004-02-11
基金项目:国家教育部高等学校博士学科点基金资助项目(20010558004)
作者介绍:李海生(1971-), 男 ,河南沁阳人 , 广东教育学院生物系讲师 ,博士.
　　海桑(Sonneratia caseolaris(L .)Engler)是海桑科海桑属植物 ,主要分布于热带亚洲东南
部海岸 、澳大利亚北部和西太平洋所罗门群岛[ 1] ,在我国天然分布于海南的文昌 、琼海 、万宁
等地海岸 ,是热带和亚热带海岸红树林群落乔木层基本组成种类 ,也是红树林中的速生丰产树
种之一 ,在我国红树林植物中占有重要地位.由于树体高大通直 ,目前已引种于广东 、广西沿
海滩涂 ,是沿海滩涂生态恢复和海岸绿化的优良树种.目前对海桑的形态解剖 、生理 、生态学
领域进行了较广泛的研究 ,但迄今有关海桑遗传多样性的研究仍未见报道.
简单重复序列区间扩增多态 DNA(inter-simple sequence repeat , ISSR)技术是由
Zietkiewicz 等于 1994年创建 ,建立在PCR反应基础上的一种新型的分子标记技术[ 2] .它结合
了SSR 和 RAPD的优点 ,具有模板需要量少 ,多态性丰富 ,无需试剂盒 ,结果记录方便 ,实验成
本低 ,操作简单 ,实验稳定性较高等优点 ,现已在种质资源鉴定 、遗传作图 、基因定位 、遗传多样
性 、进化 、系统发育 、分子标记育种等研究方面被广泛应用[ 3] .
ISSR分子标记技术虽然操作简单 ,但为了获得好的 PCR扩增结果 ,最适反应条件需要一
定时间摸索[ 4-6] .为了研究海桑的遗传多样性 ,在对海桑种群进行 ISSR分析时 ,为获得清晰
而稳定的 ISSR反应体系 ,本文对 ISSR-PCR反应中的 Taq酶的用量 、Mg2+浓度和 dNTP 浓
度 、引物浓度及其退火温度 、模板 DNA 浓度等因素对实验结果的影响进行了实验 ,建立了重
复性强 ,结果清晰而稳定的海桑 ISSR反应参数 ,为深入研究红树植物海桑的遗传多样性奠定
了良好的基础.
1　材料和方法
1.1　实验材料
在海南万宁 、琼海 、文昌 、东寨港等地采集海桑(Sonneratia caseolaris)嫩叶 ,置变色硅胶中
第 24卷　第 2期 广 东 教 育 学 院 学报 2004年 5月
Vol.24　No.2 Journal of Guangdong Education Institute M ay 2004　
干燥保存.采用 CTAB法提取总 DNA[ 7] .
1.2　PCR条件
本实验采用上海申能博彩生物科技有限公司生产的 Taq酶.所用引物为加拿大 British
Columbia 大学的第 9组引物试剂盒(No.801 ～ 900),从中筛选出 11条引物(表 1)用于海桑的遗
传多样性研究.对可能影响结果清晰度和多态性的因子:Taq 酶的用量 、Mg2+和 dNTP浓度 、引
物浓度及其退火温度 、DNA模板浓度等进行了优化.PCR的基本条件是:反应体积 10 μL ,包括
10×buffer(100 mmol·L-1 KCl , 80 mmol·L-1(NH4)2SO4 , 100 mmol·L-1 Tris-HCl , pH 9.0 , 0.
5%NP-40)1 μL ,0.35 U Taq酶 ,2 mmol·L-1 Mg2+ , 200 μmol·L-1 dNTP ,0.3μmmol·L-1引
物 ,10 ng模板 DNA.经过摸索 ,得适合海桑 ISSR分析的 PCR反应程序:94℃预变性 5 min ,
之后进行 45个循环 ,每个循环包括 94℃变性 45 s , 52℃(50 ～ 55℃不定)退火 45 s ,72℃延伸
1.5 min ,循环结束后 72℃延伸 7 min.PCR反应在PTC100TM Programmable Thermal Controller
(MJ Research Inc., USA)PCR仪上进行.每次试验改变一个 PCR参数 ,其他条件不变.
1.3　PCR产物的检验
ISSR产物用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离 ,EB染色后用凝胶成像系统成像分析.
2　结果和分析
2.1　Taq酶的用量
在 PCR反应中 ,Taq酶活性的高低极大地影响 PCR扩增的结果.对于 10μL 反应体系的
Taq酶用量 ,设置了 0.15 U 、0.2 U 、0.35 U 、0.5 U 、1 U 5个酶含量.结果表明0.2 U以下 ,扩
增产物量明显减少 , 1 U非特异性扩增增强 ,0.35 ～ 0.5 U 时扩增反应较好.为节省成本 , Taq
酶用量取 0.35 U.
2.2　Mg2+浓度和 dNTP 浓度
Mg2+与 dNTP 在 PCR过程中相互作用.在 PCR 反应中 ,游离的 Mg2+用来增强 Taq
DNA聚合酶的活性 ,对引物与模板双链杂交体的解链与退火温度亦有影响 ,而游离的 Mg2+也
可以与 dNTP 中的磷酸基结合 ,只有 Mg2+浓度与 dNTP 浓度在一定的比例范围 ,才能得到高
质量的 PCR扩增结果[ 8] .本研究中 ,10 μL 反应液中 ,分别取 25 mmol·L-1 Mg2+ 0.5 μL 、0.8
μL 、1.3μL 、1.5μL 、2.0μL ,比较 PCR结果 ,结果表明不同引物最适Mg2+浓度有所不同 ,浓度
范围在 2 ～ 3.75 mmol·L-1之间.结果见表 1.
表 1　用于海桑 ISSR扩增的引物 , Mg2+浓度及退火温度
引物 Mg 2+(mmol·L-1) 退火温度(℃)
808 3.25 53.5
809 2 52.0
835 3.75 53.5
836 2 52.0
840 3.75 53.0
842 3.75 53.0
847 2 53.5
857 2 52.0
864 3.75 53.5
868 2 52.5
887 3.75 52.0
81第 2期　　　李海生等:红树植物海桑简单重复序列区间(ISS R)条件的优化
　　在 PCR反应中 ,dNTP 浓度一般在 20 ～ 200 μmmol·L-1 , dNTP 浓度过高可加快反应速
度 ,同时可增加碱基的错误掺入率和实验成本 ,而低浓度的 dNTP 会导致反应速度的下降 ,影
响到产物的多样性和特异性[ 8-9] .在 10μL 反应液中 ,分别取 2 mmol·L-1 dNTP 0.5μL 、1.0
μL 、1.5 μL 、2.0 μL 、2.5μL , 比较 PCR结果 ,确定最适 dNTP 的量为 1.5 μL ,即最适浓度为
300 μmmol·L-1.
2.3　引物浓度及其退火温度
引物浓度对扩增结果的影响主要表现为:引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增 ,
且可增加引物之间形成二聚体的几率 ,浓度过低则无法测出所有 ISSR位点.本研究对所筛选
出的引物浓度进行了优化实验 ,在 10μL 反应液中 ,分别取 15 μmol·L-1的引物 0.1 μL、0.2μL 、
0.3 μL、0.5μL 、0.6μL 、0.8 μL ,结果发现引物取 0.2μL 、0.3μL 扩增条带清晰 ,0.5 μL 以上 ,条
带亮度增加 ,但弥散背景增加.取 0.1μL 虽然条带清晰 ,但条带数较少 ,故取 0.2 μL 和 0.3μL
均能取得较好的扩增结果.本研究采用0.2 μL ,即最终浓度为 0.3 μmol·L-1.引物的退火温度
也极大地影响着 ISSR反应的进行 ,随引物的不同 ,退火温度亦不一样.根据目前大多数 ISSR
实验所采用的退火温度 52℃,分别上下设置几个梯度 ,结果各引物的最适温度在 52 ～ 53.5℃
之间 ,结果见表 1.
2.4　DNA 模板浓度
在 10μL反应液中 ,将模板 DNA含量分别设为:5 ng 、10 ng 、20 ng 、50 ng、100 ng 、200 ng ,比较
PCR结果 ,发现海桑 ISSR反应对模板DNA浓度不甚敏感 ,模板含量许可范围较大 ,5 ～ 50 ng 均
扩增出了基本相同的带型 ,但高于 100 ng ,扩增条带减少.这可能是因为模板 DNA 中含有一
定的抑制 Taq酶活性的物质 ,模板 DNA浓度高时 ,抑制物浓度也随之增高 ,因而影响了 PCR
结果.在 DNA不纯的情况下 ,应采用有效浓度范围内的较低浓度 ,使抑制聚合酶活性的因子
影响到最小.因而本研究采用比较合适的模板 DNA量为 10μL 反应体积 10 ng.
综上所述 ,本实验得到的海桑 ISSR-PCR的最佳条件是:10 μL PCR反应体积中 , 10×PCR
buffer(100 mmol·L-1 KCl , 80 mmol·L-1(NH4)2SO4 , 100 mmol·L-1 Tris-HCl , pH 9.0 , 0.5%
NP-40)1μL ,0.35 U Taq DNA 聚合酶 , 2 ～ 3.75 mmol·L-1 Mg2+ , 300 μmol·L-1 dNTP , 0.3
μmol·L-1引物 , 10 ng 模板 DNA.用上述反应体系进行海桑的遗传多样性研究中 ,所产生的
ISSR标记位点清晰 ,反应系统稳定.图 1是引物 857 对文昌横山种群内 22 个海桑个体的
ISSR扩增带型.
图 1　引物 857 对文昌横山种群内 22个海桑个体扩增的 ISSR带型
M:DNA标准分子量(100～ 3 000 bp);CN:负对照
82 广东教育学院学报　　　　　　　　　　　　第 24卷
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Optimal Choice for Compositions in Inter-simple
Sequence Repeat (ISSR)Analysis of Mangrove
Plant Sonneratia caseolaris
LI Hai-sheng1-2 , CHEN Gui-zhu2
(1.Dept.of Biology , Guangdong Education Insti tute , Guang zhou ,
Guangdong , 510310 , P.R.China;2.Insti tute of Environmental Sciences ,
Zhongshan University , Guangzhou , Guangdong , 510275 , P.R.China)
Abstract:Sonneratia caseolaris is an important mang rove species of Sonneratiaceae.In order to
study the genetic diversity of S .caseolaris using ISSR molecular markers , the factors affecting ISSR-
PCR , which include content of Taq DNA polymerase , Mg2+ concentration and dNTP concentration ,
primers′concentration and their annealing temperatures , and concentration of template DNA etc.were
tested.The optimal ISSR-PCR reaction conditions for S .caseolaris were determined as follows:10×
buffer(100 mmol·L-1 KCl , 80 mmol·L-1(NH4)2SO4 , 100 mmol·L-1 Tris-HCl , pH 9.0 , 0.5%NP-
40)1 μL ,0.35 U Taq DNA polymerase ,2 ～ 3.75 mmol·L-1Mg2+ , 300 μmol·L-1 dNTP , 0.3 μmol·
L-1 primer ,10 ng template DNA in total 10μL reaction volume.
Key words:Sonneratia caseolaris;ISSR;Optimal choice
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