全 文 ：深圳梧桐山毛棉杜鹃根内真菌的分离与鉴定
刘 亚1，唐光大1，洪文君1，张国强2，庄雪影1*
(1．华南农业大学林学与风景园林学院，广东广州 510642;2．深圳兰科植物保护中心，广东深圳 518114)
摘要 ［目的］对深圳梧桐山毛棉杜鹃根内真菌进行分离、鉴定，为深圳梧桐山毛棉杜鹃优良菌株的筛选奠定基础。［方法］采用根段直
接培养法从毛棉杜鹃的根内分离得到 14个菌株，采用 rDNA-ITS-PCＲ分子生物学方法对所得菌株进行鉴定。［结果］深圳梧桐山毛棉杜
鹃根内真菌丰富，所获的 14个菌株均属于子囊菌门( Ascomycota) ;除瓶头霉属( Phialocephala)和软盘菌属( Mollisa)外，其余菌株分别与
Bionectria ochroleuca、Gloeotinia temulenta、Aspergillus sydowii、Paecilomyces javanicus和 Fusarium oxysporum同源或近缘，均首次在杜鹃花科
植物根内发现。［结论］该研究为毛棉杜鹃菌根化育苗技术的优良菌株筛选研究奠定基础。
关键词 毛棉杜鹃;根内真菌;菌落形态; rDNA ITS序列
中图分类号 S718． 81 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2015) 29 －009 －04
Isolation and Identification of Fungi from Ｒoots of Ｒhododendron moulmainense of Wutong Mountain，Shenzhen
LIU Ya，TANG Guang-da，HONG Wen-jun，ZHUANG Xue-ying* et al ( College of Forestry and Landscape Architecture，South China
Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642)
Abstract ［Objective］Fungi on roots of Ｒhododendron moulmainense from Wutong Mountains，Shenzhen were isolated and identified in order to
establish foundation for screening excellent strains． ［Method］A total 14 isolates were obtained by root culture methods，colony characters of these
isolates on PDA medium were observed and described，rDNA ITS sequence of them were analyzed． ［Ｒesult］The result showed that there were
rich endophytic fungi in the roots of Ｒhododendron moulmainense from Wutong Mountains． All the isolates belonged to Ascomycota; except for
the species of Phialocephala and Mollisia，the rest isolates are the homologous or sibling species of Bionectria ochroleuca，Gloeotinia temulenta，As-
pergillus sydowii，Paecilomyces javanicus，Fusarium oxysporum which were first reported in Ericaceous plants’root． ［Conclusion］The study can
lay a foundation for screening of excellent strains for Ｒhododendron moulmainense breeding technology．
Key words Ｒhododendron moulmainense; Endophytic fungus; Colony morphology; rDNA ITS sequence
基金项目 深圳市城管局科研项目( 201408) 。
作者简介 刘亚( 1990 － ) ，女，湖南长沙人，硕士研究生，研究方向:园
林植物。* 通讯作者，教授，博士，从事植物资源学和林木
菌根生态学研究。
收稿日期 2015-08-26
毛棉杜鹃(Ｒhododendron moulmainense)为杜鹃花科杜鹃
属马银花亚属常绿灌木或小乔木，其花朵艳丽，花色丰富，具
有较高的观赏价值。深圳市梧桐山风景名胜区有较大面积
的毛棉杜鹃天然林，盛花期整体景色壮丽，是该景区的特色
景点。开展毛棉杜鹃资源的开发利用，不仅具有较高的经济
效益，也具有较高的社会效益和生态效益。
杜鹃花科植物为典型的菌根依赖型植物，能与真菌形成
具有圈状结构的菌根共生体，即杜鹃花菌根(Ericoid mycor-
rhiza)。不同种类的杜鹃花属植物或不同生态环境的同种杜
鹃花植物，其根内真菌的种类和组成具有较大差异性［1 －3］。
笔者采用根段培养法，对深圳梧桐山野生毛棉杜鹃根内真菌
进行分离与培养，并运用 rDNA-ITS-PCＲ 分子生物学方法进
行菌株鉴定，探讨毛棉杜鹃菌根真菌多样性，以期为毛棉杜
鹃菌根化育苗技术的优良菌株筛选研究奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料 梧桐山自然风景区位于广东省深圳市东部，
113°17 ～ 114°18E，22°23 ～ 22°43N。2014年 3月下旬于梧
桐山自然风景区采集一批毛棉杜鹃野生幼苗作根内真菌的
分离研究。
1． 2 方法
1． 2． 1 根内真菌的分离及培养。根内真菌分离培养基使用
改良的马丁 －孟加拉红培养基［4］，菌株培养基使用马铃薯葡
萄糖琼脂培养基(PDA)。选取毛棉杜鹃健壮纤细的根系，在
清水中洗净泥土和杂质，沥干水分。在超净工作台下先在
75%乙醇中浸泡 15 s，无菌水漂洗 3 ～ 5 次;再在 0． 1%升汞
中浸泡 1 ～ 2 s，无菌水漂洗 3 ～ 5 次。把根系剪成长约 0． 5
cm的小段，用无菌滤纸吸干水滴，每个平板 5 条根段，置于
分离培养基中培养，共 50 个根段。用接种棒蘸取少量最后
一遍漂洗根系的无菌水，均匀涂抹于平板，作为对照排除杂
菌。把培养根段和对照的平板置于 25 ℃培养箱中黑暗培养
14 ～28 d。
待菌落从根段中长出，用接种针挑取菌丝至 PDA 培养
基上，培养 7 d后观察菌落形态的一致性和均匀性。若菌落
形态有差异，进行二次分离，如此反复直至纯化。把纯化后
的菌株根据菌落形态特征进行描述记录和分类整理，包括菌
落直径、颜色、质地、是否有液体分泌物、边缘、菌落外形等。
1． 2． 2 菌株分子生物学鉴定。菌株 DNA 提取参考庄彩云
等［5］方法。PCＲ扩增采用真菌通用引物［6］，ITS1-F:5-CTTG-
GTCATTTAGAGGAAGTAA-3，ITS4-B:5-TCCTCCGCTTATT-
GATATGC-3。PCＲ扩增体系(25 μl):2 × MightyAmp Buffer
Ver． 2(Mg2 +，dNTP plus)(TaKaＲa)12． 5 μl;引物各 0． 8 μl;
DNA模板 20 ng;MightyAmp DNA Polymerase(1． 25 U /μl)
(TaKaＲa)0． 5 μl;ddH2O定容至 25 μl。PCＲ反应循环参数:
98 ℃预变性 3 min;98 ℃变性 30 s，50 ℃退火 30 s，68 ℃延伸
1 min，38个循环;68 ℃延伸 7 min。
ITS区段 PCＲ扩增产物的检测及测序:12 g /L PCＲ产物
的 Agarose在 80 V电压下电泳 40 min，BIO-ＲAD凝胶成像系
统检测，若条带清晰则样品可用于测序。
PCＲ扩增产物测序由英潍捷基(上海)贸易有限公司完
成。把得到的序列提交至 GeneBank 数据库进行 Blast 相似
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2015，43(29):9 － 12 责任编辑 李占东 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2015.29.004
性比对，下载相似度较高的序列，经过 ClustalX 软件比对并
校正后，采用 MEGA6 软件的 Neighbor-Joining 程序构建系统
发育树。
2 结果与分析
2． 1 菌落形态 从野生毛棉杜鹃幼苗根内分离纯化 14 个
菌株，按照菌落的形态特征分为 6类(表 1)。接种于 PDF培
养基上，置于 25 ℃培养箱中暗培养 21 d后，生长最快的菌株
菌落直径可达 8． 0 cm，生长最慢的仅有 0． 8 cm;菌落颜色以
灰色或深灰色为主，还有白色和黄色;质地多为绒毡状，还有
薄蜡质和银耳状;均没有液体分泌物;少数菌落中间隆起。
2． 2 菌株 ITS序列鉴定及系统发育分析 把测得的序列提
交至GeneBank数据库进行 Blast相似性比对(表2)。下载相
似度最高及较高的序列，以亲缘关系相对较远的 Schizophyl-
lum commune(GeneBank登录号 EF155505)［6］为外群，构建 NJ
系统发育树(图 1)，14个菌株聚为 11类。其中，菌株 2、3、7、
8与 Mollisia聚在一起获得 99%的支持率，序列相似度均达
到 99%;菌株 7、8 与 Mollisia cinerea 的序列相似度均达到
93%。菌株 13和 10 与 Phialocephala 具有 99%的序列相似
度，菌株 13与 P． fortinii菌株(GeneBank登录号 AB671499)
的相似度为 99%。菌株 1和菌株 4分别与 GeneBank登录号
EU076958 菌株(Uncultured Helotiales sp．)和 KF498574． 1菌
株 (Sordariomycetes sp．)具有较高的相似度(表 2)。
表 1 菌落形态类型及其特征
菌落形
态类型
菌株号
直径
cm
颜色 质地 边缘
液体
分泌物
菌落
外形
A 2、3、7、8 5． 5 ～5． 9 灰色或深灰 绒毡状 白色或浅白 无 圆形
B 5 4． 9 灰色或深灰 薄蜡质 白色或浅白 无 圆形
C 1、10、13 5． 3 ～7． 5 灰色或深灰 绒毡状 浅灰 无 圆形，中间隆起
D 6、14 8 乳黄色 薄蜡质 乳黄色 无 圆形
E 4 0． 8 深乳黄色 银耳状 深乳黄色 无 圆形
F 9、11、12 3． 1 ～4． 9 白色 绒毡状 白色 无 圆形
此外，菌株 6、9、11、12和 14分别与 Bionectria ochroleuca、
Gloeotinia temulenta、Paecilomyces javanicus、Fusarium oxyspo-
rum、Aspergillus sydowii等菌株聚在一起，序列相似度在 99%
以上，表明它们与对应菌株同源或为同一菌种。
表 2 分离菌株的 rDNA ITS序列 Blast结果
菌株
编号
GeneBank中最
相近菌株
覆盖度
%
相似度
%
相似菌株的
GeneBank登录号
2 Mollisia sp． 91 99 KJ188683
3 Mollisia sp． 91 99 KJ188683
7 Mollisia sp． 89 99 KJ188683
Mollisia cinerea 96 93 JF514855
8 Mollisia sp． 92 99 KJ188683
Mollisia cinerea 99 93 JF514855
13 Phialocephala fortinii 100 99 AB671499
10 Phialocephala sp． 100 99 KF156325
4 Uncultured Helotiales sp． 99 99 KF498574． 1
14 Aspergillus sydowii 98 99 AY373869
9 Gloeotinia temulenta 100 100 DQ235697
6 Bionectria ochroleuca 97 99 EU273558
12 Fusarium oxysporum 100 99 JF439472
5 Sordariomycetes sp． 87 100 AB847034
Ascomycota sp． 98 96 HQ608112
11 Paecilomyces javanicus 100 100 AB099944
1 Soil fungal sp． 94 97 EU076958
Neofusicoccum australe 100 82 KF702388
3 结论与讨论
3． 1 结论 从深圳梧桐山毛棉杜鹃野生幼苗根段中分离得
到 14个内生真菌的菌株。依据菌落形态特征分为 6 类，菌
落颜色以灰色或深灰色为主;基于 rDNA-ITS序列分析和 NJ
系统发育树，14个菌株聚为 11 类，均隶属于子囊菌门，其中
柔膜菌目菌株的数量(菌株 2、3、7、8、13、10、4、9)最丰富，占
菌株总数的 57． 1%。
3． 2 讨论
3． 2． 1 菌株数量和菌株类型数量。张春英［7］从浙江、湖南
等 4个样地采集了 24株云锦杜鹃(每个样地分别采集 6株，
取 200个根段)，从 800 个根段中共分离培养得到 280 个菌
株。应用菌落形态、菌丝体显微特征和 rDNA-ITS 片段的
ＲFLP图谱分析，确定了 14 个 ＲFLP类型和 3 个未能鉴定的
类型。在 14个 ＲFLP类型中，有 7个类型与现有的杜鹃花类
01 安徽农业科学 2015 年
图 1 基于各菌株以及 GenBank的相似菌株的 ITS序列构建的 NJ系统发育树
菌根菌亲缘关系密切，分别为 Oidiodendron maius、Cryptospori-
opsis ericae 和 5 种尖苞树科植物的内生真菌的同源或近缘
种;2个类型为黑色有隔内生真菌，即 Phialocephala 类。杨
兵［8］采用与张春英［7］的研究方法，从上海、杭州、宁波 3个地
区 18株毛鹃的 600个根段内，分离培养得到 366 个菌株，确
定了 19个 ＲFLP类型，其中 9个类型为尖苞树科尖苞树属植
物的内生真菌，另有 8 个未知的子囊菌和 2 个其他未知类
型。刘振华［9］从吉林、重庆、云南 3个样地的牛皮杜鹃(Ｒho-
dodendron chrysanthum)、小杜鹃(Ｒhododendron)、越橘(Vac-
cinium)等 9种共 24株杜鹃中，分离培养得到 500个菌株，利
用菌落形态结合 rDNA-ITS序列分析鉴定出 3种杜鹃花类菌
根真菌 Oidiodendron maius、Meliniomyces variabilis、Cryptospori-
opsis ericae，1种黑色有隔内生真菌 Phialocephala fortinii 和 2
种尖苞树科植物内生真菌或其近缘种。
深圳梧桐山毛棉杜鹃自然群落中极少见到野生幼苗，采
集的样本较少，但在 50 个根段内分离得到 14 个菌株，经过
ITS序列分析被归为 11 类不同菌种的同源或近缘种。虽然
采样植株较少，菌株数量不多，但菌株类型较丰富，反映了梧
桐山毛棉杜鹃根内真菌也具有较高的菌种多样性。
3． 2． 2 菌落形态分类和 ITS分子分类结果的比较。传统的
真菌鉴定方法依据菌落形态特征及菌体的光学显微结构，但
真菌形态结构复杂，而且不少菌种的菌落形态特征和生理生
化指标在不同培养基上会发生变化［7］。另一方面，大多数菌
根真菌在培养过程中不产生孢子，更增加了菌种鉴定的困
难。随着 GeneBank数据库的建立和生物信息学的发展，应
用 rDNA-ITS序列分析进行真核生物的系统发育、分类鉴定
和多样性研究已成为一种有效且快速的方法［1］。
其他学者对杜鹃花类菌根菌的研究也表明不同菌落形
态的菌株的 rDNA 序列具有同源性［7 －10］。在该研究所获得
的 14个菌株中，根据菌落形态特征和 rDNA ITS序列分析分
别划分为 6类和 11类，所获结果稍有差异。其中，同属菌落
形态 C类的菌株 1、10、13，在 NJ 系统发育树上并未聚在一
起，菌株 1与菌株 10和 13的分支距离很远。分别同属菌落
形态 D类的菌株(菌株 6、14)和菌落形态 F类的菌株(菌株
9、11、12)，也在 NJ系统发育树上分离。然而，有些菌落形态
类似的菌株，如菌株 2、3、7、8，在 rDNA 序列上具有一致性，
反映了它们是同一种或近缘种。由此可见，rDNA-ITS 序列
分析结果更可信。
1143卷 29期 刘 亚等 深圳梧桐山毛棉杜鹃根内真菌的分离与鉴定
3． 2． 3 菌株鉴定。目前国内外已有研究表明，从杜鹃花科
植物中分离并回接确认为杜鹃花类菌根真菌的都属于子囊
菌类［7］。该研究对毛棉杜鹃进行菌根分离得到的 14个菌株
均属于子囊菌门，分别属于柔膜菌目、肉座菌目、散囊菌目。
其中菌株 2、3、7、8与皮盘菌科软盘菌属 Mollisia同源;菌株 7
和 8与 M． cinerea的序列相似度达 93%，反映了它们具有较
高的同源性。杨秀丽［11］和刘凤红等［12］分别在大兴安岭地区
的杜香(杜鹃花科杜香属)和长白山地区的笃斯越橘根内也
分离得到同属 Mollisia minutella的同源菌株;刘仁阳等［2］在
梵净山雷山杜鹃的根内也分离得到 M． cinerea的同源菌株，
反映了 Mollisia属菌种可与杜鹃花科植物形成菌根共生体。
该研究还分离获得了 2 个与 Phialocephala 具有较高同
源性的菌株，其中 1 个与 P． fortinii具有 99%的序列相似度
(菌株 13)。Phialocephala属的真菌通常被归为深色有隔内
生真菌［13］。近年有关 Phialocephala属的真菌在杜鹃花科植
物根内出现的研究已有报道，如杨秀丽［11］、刘凤红等［12］和刘
振华［9］分别报道了 Phialocephala 属同源或近缘真菌为大兴
安岭地区和长白山地区杜鹃花科植物菌根菌的优势种。
该研究未分离到 Hymenoscyphus eircae、Oidiodendron sp．、
Cryptosporiopsis ericae、Meliniomyces variabilis 等典型的杜鹃花
类菌根菌种。值得关注的是分离获得的 Bionectria ochroleu-
ca、Gloeotinia temulenta、Aspergillus sydowii (聚 多 曲 霉)、
Paecilomyces javanicus(爪哇拟青霉菌)和 Fusarium oxysporum
(尖孢镰刀菌)的同源或近缘种，均是首次在杜鹃花科植物根
内出现。其中，Bionectria ochroleuca 对多种植物病原菌具有
拮抗作用［14 －15］;Gloeotinia temulenta和 Fusarium oxysporum通
常为植物致病性真菌［16 －18］;Paecilomyces javanicus 为昆虫天
敌真菌［19］。该研究回接了2个曲霉菌株到毛棉杜鹃幼苗上，
未见有致病性且具有促生作用(另文报道)，它们与毛棉杜鹃
的生态关系还有待进一步研究。
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檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
466 －470．
(上接第 5 页)
卵形或卵状披针形，长1． 5 ～2． 5 mm，向前伸展，彼此近平行，
边缘具细缘毛，两裂片间的凹缺具细尖 高山鸟巢兰………
29． 根状茎较粗，肉质，呈珊瑚状分枝。
33． 总状花序具 3 ～7朵花，花小，直径 3 ～ 8 mm，倒
置，唇瓣位于下方，唇瓣近中部 3裂，无距 珊瑚兰…………
33． 总状花序具2 ～6朵花，花较大，直径长约2 cm，
不倒置，唇瓣位于上方，唇瓣近基部 3裂，具距
裂唇虎舌兰
……………
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21 安徽农业科学 2015 年