全 文 ：质 量 工 艺
玻璃苣生物碱提取工艺与抗乳腺癌药效学研究
刚宏林1，马跃2，马英南2，马咏哥2，刘相辉1，唐先明1
(1．哈尔滨市食品药品检验检测中心，黑龙江 哈尔滨 150525;2．黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要:目的:优化玻璃苣总生物碱的提取工艺，为其进一步开发提供理论基础。方法:采用正交实验
法，以玻璃苣总生物碱提取率为指标优选得到最佳提取工艺。结果:提取时间、乙醇浓度、固液比及提取
溶剂 pH值对玻璃苣总生物碱提取率有较大的影响，pH值为 1． 5 的 75%乙醇、固液比 1∶ 20 以及提取时
间 2 h为最佳方案，按照最佳方案提取，得到玻璃苣总生物碱提取率为 0． 37%。以 Walker256 荷瘤大鼠
为模型，观察玻璃苣总生物碱对乳腺癌的抑瘤作用。结论:得到的玻璃苣总生物碱提取工艺优化参数准
确可靠，有一定的实用价值。玻璃苣总生物碱具有明显的抗乳腺癌活性。
关键词:玻璃苣;总生物碱;提取工艺;抗乳腺癌
中图分类号:Ｒ283． 6 文献标识码:A 文章编号:1002 － 2406(2016)03 － 0033 － 04
Extraction Process of Borage Alkaloids and the Drug Efficacy of Anti Breast Carcinoma
GANG Hong － lin1，MA Yue2，MA Ying － nan2，MA Yong － ge2，LIU Xiang － hui1，TANG Xian － ming1
(1． Harbin Food and Drug Inspection Center，Harbin 150525，China;
2． Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)
Abstract:Objective:To investigate the extraction process of total alkaloid in Borago officinalis L． ． Methods:On
the basis of single － factor experiments，the effects of different time，pH，solid － to － liquid ratioand ethanol
weight percent on the extraction yield of total alkaloid from Borago officinalis L． were investigated with a four －
factor orthogonal experiment design． Ｒesults:The results indicated that the best condition was with 75% etha-
nol of pH 1． 5 with solid － liquid ratio 1∶ 20 and extraction time of 2 hours． It was extracted to get the ratio of
0． 37% ． Using Walker256 tumor － bearing rats as a model，we observed the anti － tumor effect and the influ-
ence on rats’immune organs of total alkaloid in Borago officinalis L． for breast cancer． Conclusion:The ex-
traction technology and the analytical method have a practical value． Total alkaloid in Borago officinalis L． has
a significant anti － tumor activity for breast carcinoma．
Key words:Borago officinalis L．;Total alkaloids;Extraction technology;Anti breast carcinoma
基金项目:黑龙江省青年科学基金项目(No． QC2009C71);黑龙江省博
士后科研启动资金资助项目(No． LBH － Q12053);哈尔滨市
科技攻关项目(No． 2011AA3BS034)
作者简介:刚宏林(1975 －)，男，博士后，主任药师，硕士研究生导师，主
要研究方向:中药药效物质基础及作用机制研究。
收稿日期:2015 － 10 － 10
修回日期:2015 － 11 － 07
玻璃苣(Borago officinalis L．)系紫草科，玻璃苣属
植物，是一种强壮的、每年生的草本植物。玻璃苣具有
明显的抗脂质体过氧化作用，能够抑制血小板聚集及
血栓素 A2的合成。并能抑制溃疡及胃出血，增加胰岛
素分泌。同时亦具有抗炎、抗肿瘤、利尿、镇痛等药理
作用［1］。研究玻璃苣生物碱的提取工艺，对玻璃苣的
进一步开发和应用具有重要意义［2］。观察玻璃苣总
生物碱抗乳腺癌的活性，为玻璃苣的进一步开发利用
提供科学依据。
1 生物碱提取工艺研究
1． 1 材料
干燥玻璃苣(哈尔滨食品药品检验检测中心提
供);盐酸水苏碱标准品(中国药品生物制品检定所，
批号 110712 － 201111);硫氰酸铬钾试剂(上海迈坤化
工有限公司，批号 20091203);无水乙醇、丙酮、盐酸等
均为分析纯。
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1． 2 实验方法
工艺流程:玻璃苣粉末→生物碱提取(加热回流)
→过滤→大孔吸附树脂分离纯化→紫外可见分光光度
计测 OD值→比较得出最优工艺条件。
1． 2． 1 样品溶液的制备
取干燥的玻璃苣药材，粉碎，过 0． 425 mm 筛，加
乙醇溶液加热回流、浓缩、调 pH 值、过滤后得提取液。
提取液经大孔吸附树脂分离纯化后，收集乙醇洗脱
液，所得溶液即为样品溶液。
1． 2． 2 总生物碱含量的测定
以盐酸水苏碱为指标性成分，采用雷氏盐比色法
测定玻璃苣总生物碱含量。
标准曲线制备:精密吸取对照品溶液 1． 0、1． 5、
3. 0、4． 0、5． 0、6． 0 mL，分别加入 0． 1 mol /L 的盐酸至
10 mL，加 2%雷氏盐溶液 3 mL，并摇匀，静置冰水浴
30 min。取出后，抽滤，用适量蒸馏水洗涤沉淀，抽干，
用丙酮溶解并定容至 5 mL。
以丙酮为空白在 UV2550 紫外分光光度的 180 ～
700 nm下扫描，找出最大吸收波长为 521 nm，以 521
nm为检测波长测量吸光度，参照文献［5］，以吸光度为
纵坐标，样品浓度为横坐标绘制标准曲线，为 y =
0. 0278x － 0． 0015，Ｒ2 = 0． 9993。
1． 2． 3 单因素试验
选取乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%)、提
取时间(1、2、3、4、5 h)、pH值(1． 5、2． 5、3． 5、4． 5、5． 5)
和固液比(1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20、1∶ 25、1∶ 30)4 个可能影响
提取效果的因素，按 1． 2． 1 中样品溶液制备方法和
1． 2． 2中总生物碱含量的计算方法进行单因素试验，以
确定相关因素及各因素的适宜范围。
1． 2． 4 正交实验
根据单因素实验，设计因素水平表进行正交实验。
选择乙醇浓度、提取时间、固液比，溶液 pH 值 4 个因
素作为正交实验的考察因素，按表 4 的 L9(3
4)正交表
进行实验，以玻璃苣总生物碱得率作为考察指标，以优
化玻璃苣总生物碱提取工艺。
2 结果与分析
2． 1 玻璃苣总生物碱提取工艺条件单因素试验结果
2． 1． 1 不同浓度乙醇对总生物碱提取率影响的考察
精确称取 10 g玻璃苣干燥粉末 5 份，分别加入不
同浓度的乙醇 200 mL，用 HCl调节至 pH值为 2． 5，电
热套加热回流 2 h 后，测定提取液吸光度，如图 1 所
示，结果表明，乙醇浓度在 50% ～ 80%之间，随着浓度
的升高，提取率呈上升趋势，60% ～80%期间变化幅度
较大，在 80%达到最高，综合效果与成本，选择 65%，
75%，85%三个水平进行正交实验。
图 1 乙醇浓度对玻璃苣生物碱提取效率的影响
2． 1． 2 提取时间对总生物碱提取率影响的考察
精确称取 10 g 玻璃苣干燥粉末 5 份，加入 pH 值
为 2． 5 的 70%乙醇 200 mL，电热套分别加热回流不同
时间后，测定提取液吸光度，如图 2 所示，结果表明，回
流时间在 1． 5 ～ 2． 5 h，提取效率显著上升，综合效果与
成本，选择 1． 5 h，2 h，2． 5 h三个水平进行正交实验。
图 2 提取时间对玻璃苣总生物碱提取效率的影响
2． 1． 3 固液比对总生物碱提取率影响的考察
精确称取 10 g 玻璃苣干燥粉末 5 份，分别加入
pH值为 2． 5 的不同体积的 70%乙醇，电热套加热2 h，
测定提取液吸光度，如图 3 所示，结果表明，提取率在
固液比 1∶ 10 ～ 1∶ 20 间大幅度提高，1 ∶ 25 时达到最高
值，选择 1∶ 20，1∶ 25，1∶ 30 三个水平进行正交实验。
图 3 固液比对玻璃苣总生物碱提取效率的影响
2． 1． 4 溶液 pH值对总生物碱提取率影响的考察
精确称取 10 g玻璃苣干燥粉末 5 份，分别加入由
HCl调节为不同 pH 值的 70%乙醇 200 mL，电热套加
热 2 h。测定提取液吸光度，如图 4 所示，结果发现生
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物碱在酸性环境下成盐而更容易提取，选择 pH 值为
1． 5、2． 5、3． 5 三个水平进行正交实验。
2． 2 正交实验
根据单因素实验，按表 1 的 L9(3
4)设计因素水平
表进行正交实验，实验结果如表 2 所示。实验结果表
明，各因素对玻璃苣总生物碱提取的影响程度为 A ＞
D ＞ B ＞ C，确定最佳提取方案为 A2B2C1D1，即 pH值为
1． 5 的 75%乙醇，固液比 1∶ 20，提取时间 2 h为最佳方
案，按照最佳方案提取，得到玻璃苣总生物碱提取率为
0． 37%(n = 3，ＲSD =3． 09%)，高于正交实验中的所有
其他组合，确立该条件为玻璃苣总生物碱的最佳提取
方案。
图 4 pH值对总生物碱提取效率的影响
表 1 正交实验因素水平表
水平 /因素
A
乙醇浓度(%)
B
提取时间(h)
C
固液比
D
溶液 pH值
1 65 1． 5 1∶ 20 1． 5
2 75 2 1∶ 25 2． 5
3 85 2． 5 1∶ 30 3． 5
表 2 正交实验结果
因素 乙醇浓度 提取时间 固液比 溶液 pH值 实验结果
实验 1 1 1 1 1 0． 284
实验 2 1 2 2 2 0． 273
实验 3 1 3 3 3 0． 241
实验 4 2 1 2 3 0． 293
实验 5 2 2 3 1 0． 322
实验 6 2 3 1 2 0． 313
实验 7 3 1 3 2 0． 291
实验 8 3 2 1 3 0． 280
实验 9 3 3 2 1 0． 291
均值 1 0． 266 0． 289 0． 292 0． 299
均值 2 0． 309 0． 292 0． 286 0． 292
均值 3 0． 287 0． 282 0． 285 0． 271
极差 0． 043 0． 010 0． 007 0． 028
3 抗肿瘤作用
3． 1 实验瘤株
Walker256 大鼠乳腺癌细胞，由中国医学科学院
提供。
3． 2 实验动物
雌性 Wistar 大鼠，初始体质量 80 ～ 100 g，5 只;
Sprague － Dawley大鼠 40 只，体质量 250 ～ 300 g，由哈
尔滨医科大学实验动物学部提供，合格证编号:
2014102602。实验条件下饲养。
3． 3 药物及试剂
玻璃苣总生物碱提取物(Borago officinalis Alkaloid
Extractive，GAE，自制);阳性对照药枸橼酸他莫昔芬
(扬子江药业有限公司，批号 14061111)。
3． 4 试剂的配制
PBS液:NaCl 8． 00 g，KCl 0． 20 g，Na2HPO4·H2O
1． 56 g，KH2PO4 0． 24 g，溶于 1000 mL 超纯水，8 磅高
压蒸汽灭菌 15 min，置于 4℃冰箱保存。
ＲPMI1640 培养液:一份 ＲPMI1640 干粉，加灭菌
超纯水至 900 mL，添加胎牛血清 100 mL 至 1 L，无菌
滤器过滤除菌，分装，置于 4℃冰箱备用。用时添加青
霉素、链霉素至培养液中含量分别为 100 U /mL。用
7． 4% NaHCO3调整 pH值到 7． 2 ～ 7． 4。
3． 5 主要仪器
优普系列超纯水器:程度超纯科技有限公司。
3． 6 实验方法
3． 6． 1 含 Walker256 肿瘤细胞的大鼠腹水瘤的制备
Walker256 细胞保存在 － 80℃的冰箱中，取出瘤
株，迅速放入盛有 37℃水浴的烧杯中，缓缓搅动，以迅
速解冻。擦净冻存管上的水痕，用酒精灯外焰轻燎消
毒管口，在超净台内旋开管口，吸出细胞悬液，用吸管
移入离心管中，补加 10 mL 用含 10%胎牛血清的 ＲP-
MI 1640 培养液悬浮细胞，用吸管轻轻吹打，而使细胞
悬浮。1500rpm离心 5 min，弃上清，用培养液漂洗，加
入适量 PBS，使用细胞计数板，调整细胞浓度为 2 × 107
细胞数 /mL。选 80 ～ 100 g 的 Wistar 幼年大鼠 5 只，
75%的酒精擦拭腹部消毒，用无菌 5 mL 注射器抽取
0． 3 mL准备好的 Walker256 肿瘤细胞悬液 5 mL(约
6 × 106个)行大鼠腹腔内注射接种。接种后的 7 ～
10 d后，雌性 Wistar大鼠均出现明显的腹水症状。
3． 6． 2 提取含肿瘤细胞的腹水
大鼠断颈处死，腹部朝上迅速将 Wistar 大鼠固定
于工作台上，75%的酒精消毒腹部，使用无菌剪刀剪开
皮肤和皮下，暴露腹白线，使用 75%的酒精消毒腹膜。
用无菌镊子轻提腹腔一侧，使腹水积在腹白线附近，取
无菌 5 mL注射器沿腹白线进针，尽量避开血管与器
官，抽取腹水。弃掉暗红色带血腹水，棕黄色粘稠的细
胞悬液，留存待用。
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3． 6． 3 肿瘤细胞的腋下接种
以络合碘消毒每只 SD 大鼠腋下皮肤，予以 1 mL
注射器注射 0． 3 mL 浓度为 2 × 107个 /mL Walker256
细胞 1 mL悬液至 SD大鼠腋下皮下。
3． 6． 4 分组与给药
SD大鼠造应性喂养一周后，称重，按随机数字表
法随机分成 5 组，即空白组、治疗高剂量组(6 g /kg)、
治疗中剂量组(3 g /kg)、治疗低剂量组(1 g /kg)、阳性
对照组，每组 8 只。
每日口服灌胃;阳性对照组给予枸橼酸他莫昔芬
20 mg /kg;空白组给予相同体积的清水。
3． 6． 5 造模后的体质量观察
接种肿瘤细胞后的大鼠的天数为 2、5、8、11、14 天
进行体质量的监测。
3． 6． 6 标本采集
第 14 天，对大鼠禁食不禁水 12 h 后，对大鼠称
重。引颈猝死，将大鼠仰卧固定于手术台上，用手术剪
刀片打开胸腔，快速剥离荷瘤组织，用无菌冰生理盐水
清洗血污后，放入用 DEPC水处理过的离心管，封口后
置液氮中保存备用。
4 实验结果
实验结果发现，枸橼酸他莫昔组对乳腺癌 Walk-
er256 抑瘤率为 46． 20%，玻璃苣总生物碱的高、中、低
剂量组对乳腺癌移植瘤的抑瘤率分别为 32． 80%、
17. 10%、18． 30%，发现 GAE 各给药组对荷瘤大鼠的
体质量影响较小，其中，中、低剂量与空白对照组比较
差异无统计学意义。而阳性药枸橼酸他莫昔芬使大鼠
的体质量明显降低，与空白对照组比较，具有显著性差
异(P ＜ 0． 01)。结果详见表 3。
表 3 玻璃苣总生物碱对乳腺癌的抑制作用(珋x ± s，n = 8)
组别 n 给药前体质量 给药后体质量 瘤重 抑瘤率(%)
空白对照组 8 262 ± 2． 31 277． 2 ± 2． 9 3． 33 ± 0． 46
阳性对照组 8 266 ± 2． 91 261． 7 ± 3． 7* 1． 79 ± 1． 31* 46． 20
高剂量给药组 8 273 ± 1． 24 268． 6 ± 5． 6* 2． 24 ± 1． 02* 32． 80
中剂量给药组 8 269 ± 1． 93 272． 4 ± 4． 5 2． 76 ± 0． 34* 17． 10
低剂量给药组 8 266 ± 1． 02 287． 5 ± 6． 3 2． 72 ± 0． 54* 18． 30
注:与空白对照组比较，* P ＜ 0． 01。
5 结论与讨论
研究已经证实，γ －亚麻酸(gamma linolenic acid，
GLA)是玻璃苣提取物中的主要成分，但对于其生物碱
成分的研究尚未开展［3］。我们前期的工作发现，玻璃
苣提取物具有抗抑郁、平喘等多种复杂的药理作
用［4 － 6］。同时，我们采用 UPLC /TOF － MS 技术，分析
了玻璃苣家兔体内移行成分［7］。我们推测，玻璃苣中
取物中的其他成分可能也参与了其药理作用的发挥。
由于玻璃苣中的生物碱含量较低，为了提高提取效率，
本实验对影响提取效率的主要因素进行了考察。根据
相似相溶的原理，本实验以乙醇为溶剂进行了提取玻
璃苣生物碱［8］。考虑到乙醇浓度、pH 值以及提取时
间对提取效率的影响［9］，本研究通过单因素实验，确
定适宜提取条件的范围，通过正交实验，得出最佳的提
取方案［10］。
本实验以盐酸水苏碱为指标计算玻璃苣总生物碱
的含量，忽略了玻璃苣中其他的生物碱，并且采用了加
热回流这一传统提取方法，提取温度高、时间长，可能
造成了热敏性成分的分解和挥发性成分的损失，不可
避免地会对最终提取效果造成一定的影响。因此，合
理应用一些新技术，有效改善提取效果，促使玻璃苣总
生物碱制备向高效节能的方向发展，将是本课题的下
一步的目标。
玻璃苣总生物碱提取物对乳腺癌 Walker256 在大
鼠体内有一定的抑制作用，高、中、低(6 g /kg，3 g /kg，
1 g /kg)剂量组的抑瘤率分别为 32． 80%、17． 10%、
18. 30%。根据《国家新药(西药)临床前研究指导原
则汇编》规定，当抑制率 ＞ 30%，经统计学处理，差异
具有统计学意义(P ＜ 0． 05)，则评定该受试物有一定
的抗肿瘤活性。因此，可以得出结论，玻璃苣总生物碱
有抗乳腺癌活性。
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