全 文 ：第 37 卷 第 2 期
2013 年 3 月
南京林业大学学报(自然科学版)
Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition)
Vol． 37，No． 2
Mar．，2013
收稿日期:2012 － 05 － 03 修回日期:2012 － 11 － 02
基金项目:国家林业局“948”项目(2011 － 4 － 69) ;国家林业公益性行业科研专项项目(201204501) ;江苏高校优势学科建设工程资
助项目(PAPD)
第一作者:李清清，硕士生。* 通信作者:叶建仁，教授。E-mail:jrye@ njfu． com． cn。
引文格式:李清清，叶建仁，吴小芹． 抗松材线虫赤松组培繁殖优良家系的筛选［J］． 南京林业大学学报:自然科学版，2013，37(2):50 －54．
抗松材线虫赤松组培繁殖优良家系的筛选
李清清，叶建仁* ，吴小芹
(南京林业大学森林资源与环境学院，江苏 南京 210037)
摘要:以抗松材线虫赤松(简称抗病赤松)27 个家系带子叶顶芽的胚苗为外植体，筛选生长势好、增殖系数高和
生根能力强的组培繁殖优良家系。结果表明:1、8、10、13、22 和 25 家系的平均伸长率都达到了 100%以上;随着
增殖代数的增加，各家系丛生芽增殖系数表现不一致，但总体趋势是 l 至 2 代丛生芽增殖系数随代数增加而增
加，2 至 3 代增殖系数随代数增加而下降;抗病赤松不同无性系不定根诱导率不同，19 － B 无性系的不定根诱导
率最高为 95. 8%。
关键词:赤松;组培繁殖;优良家系
中图分类号:S722． 3 + 7;S763 文献标志码:A 文章编号:1000 － 2006(2013)02 － 0050 － 05
Selection of wilt-resistant Pinus densiflora superior families for tissue culture propagation
LI Qingqing，YE Jianren* ，WU Xiaoqin
(College of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China)
Abstract:Using the embryo seedlings with cotyledons of 27 wilt-resistant Pinus densiflora families as explants，superior
families which were good growth vigor，high multiplication rate and strong rooting ability were selected． The average e-
longation percentages of No． 1，8，10，13，22 and 25 families were up to above 100%;With the increase of prolifera-
tion generations，the multiplication coefficient of clustered shoots in each family was variable，but the overall trend was
that multiplication coefficient of clustered shoots from generation 1 to generation 2 increased with generation increase，
and multiplication coefficient from generation 2 to generation 3 decreased;Adventitious root induction rate of wilt-resist-
ant P． densiflora clones was different，19-B clone of wilt-resistant P． densiflora was the highest，up to 95． 8% ．
Key words:Pinus densiflora;tissue culture propagation;superior families
赤松(Pinus densiflora)是荒山造林的先锋树
种，但易感染松材线虫，因此其生长受到严重影响。
由于常规种苗繁殖系数低，选育出的抗病材料难以
满足大规模林业生产的需求。组织培养技术具有
批量大、周期短、不受季节限制和可较好保持亲本
特性等优点，是繁殖优良品种的重要途径。Som-
mer等［1］从长叶松(P． palustris)成熟合子胚的离
体培养中经器官发生获得再生植株，此后针叶树的
再生离体培养植株研究取得了很大进展，Choi
等［2］进行赤松离体微繁殖获得少量完整植株，朱
丽华等［3］以幼苗子叶 /胚轴为外植体建立了赤松
植株再生体系，不定根发生率达 68． 4%，12 周后成
活率约 60%。秦莉等［4］对抗松材线虫赤松(简称
抗病赤松)组培苗生根移栽的因素进行了研究，将
待生根的丛生芽置于17 ℃条件下处理 5 d 后，不
定根诱导率最高达 93%。2009 年首次成功建立了
抗病赤松再生植株的野外造林试验地［5］。
笔者在前人抗病赤松直接器官发生研究的基
础上，对从日本引进的 27 个抗病赤松家系在丛生
芽诱导、伸长和生根等器官发生植株再生体系方面
进行了比较研究，从中筛选出生长势好、增殖系数
高和生根能力强的优良家系，为进一步利用引进的
27 个抗病赤松家系，开展组培繁殖推广提供依据。
1 材料与方法
1． 1 外植体的培养
2004 年从日本引进抗病赤松 27 个家系的成
熟种子(对这 27 个家系进行编号分别为 1，2，3，
…，27，每个家系分别选取不同数量的种子，同一家
系的不同种子编号为 1 － A，1 － B，…，2 － A，2 － B
……) ，保存于 4 ℃冰箱。参见朱丽华等［6］种子处
理方法，种子消毒处理后用解剖刀剥去胚乳，取出
第 2 期 李清清，等:抗松材线虫赤松组培繁殖优良家系的筛选
完整的成熟胚，放入 PDA 培养基上，培养成无菌
苗，以萌发生长 23 d左右的胚苗顶芽为外植体。
1． 2 丛生芽的诱导与伸长
截取培养 23 d 左右且生长良好的无菌苗带子
叶顶芽，转接到诱导培养基上，基本培养基为 GD，
附加 4 mg /L 6 － BA，0. 2 mg /L NAA，25 g /L蔗糖，
0. 1 g /L肌醇，6. 5 g /L卡拉胶，pH = 5. 8。比较 27
个家系丛生芽诱导率的差异，统计丛生芽诱导率及
每个外植体形成的平均芽数。
在诱导培养基培养 5 周后，将诱导出的丛生芽
转接到 DCR伸长培养基中进行第 1 次伸长生长，
附加 0. 1 mg /L 6 － BA 和 0. 2 mg /L NAA，pH =
5. 8;30 d左右转接到 DCR培养基中进行第 2 次伸
长生长，附加 0. 5 g /L活性炭(AC) ，17 g /L蔗糖，
0. 1 g /L肌醇，6. 5 g /L卡拉胶，pH =5. 8。
1． 3 丛生芽的继代增殖与伸长
取单个芽，截顶后转接到 DCR培养基(增殖培
养基)上，附加 2 mg /L 6 － BA，0. 25 mg /L NAA，25
g /L蔗糖，0. 1 g /L肌醇，6. 5 g /L卡拉胶，pH为 5. 8。
观察丛生芽增殖情况，比较 27 个家系不同增殖代
数的差异，计算增殖系数。
在增殖培养基培养 5 周后，将丛生芽转接到
第 1 次伸长培养基中，伸长生长前每个家系的各
无性系随机抽取 10 个芽，标记并测芽高，4 周伸
长后再测芽高。6、11、12 和 27 家系的芽数少于
10 个，这 4 个家系不统计，比较各家系芽伸长率
的差异。
1． 4 不同无性系组培苗不定根发生
将高 2． 0 cm以上且生长良好的抗病赤松组培苗
转入 1 /4 WPM 培养基上，附加 0. 15 mg /LNAA，1. 5
mg /L IBA，10 g /L蔗糖，pH为 5. 8，30 d左右统计不定
根诱导率。再将带有根原基的组培苗转入珍珠岩培
养基进行不定根的伸长培养，2个月后逐渐打开封口
膜炼苗 5 ～7 d，移栽时洗去根部残留的珍珠岩，移栽
到装有珍珠岩、河沙和苗圃土(体积比为 1∶ 1∶ 1)的混
合基质纸杯中，1个月后统计再生植株的移栽成活率。
1． 5 培养条件和数据处理
培养条件为:温度(23 ± 1)℃，光照强度 36
μmol /(m2·s) ，每日光照 16 h。诱导率 =有芽外植
体数 /接种外植体数 × 100%，增殖系数 =增殖后芽
数 /增殖前芽数，伸长率 =(伸长后芽高 －伸长前
芽高)/伸长前芽高 × 100%，不定根诱导率 =生根
数 /接种组培苗数 × 100%，移栽成活率 =成活的株
数 /移栽的株数 × 100%。
数据用 Excel 和 SPSS 17. 0 分析。
2 结果与分析
2． 1 抗病赤松 27 个家系丛生芽诱导的差异
将抗病赤松 27 个家系的带子叶顶芽转入诱导
培养基，15 d后可见顶芽开始膨大，20 d 后子叶基
部可见到有绿色小凸起，25 d 左右子叶基部长出
大小不等的小芽，5 周后子叶基部的小芽长到
0． 5 ～ 1． 0 cm(图 1)。27 个家系丛生芽诱导率见
图 2，抗病赤松 27 个家系的丛生芽诱导率都比较
高，最高诱导率为 100%，最低诱导率为 66． 67%，
图 1 抗病赤松植株再生的过程
Fig． 1 Plant regeneration process of Pinus densiflora
注:A．胚苗;B．丛生芽的诱导;C．丛生芽的伸长;D．丛生芽的增殖;E．生根的组培苗;F．移栽的再生植株。
15
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 37 卷
其中，3、4、7、9、10、11、12、17、19、22、23 和 26 家系
的丛生芽诱导为 100%，5、6、8、15、20 和 25 家系的
丛生芽诱导率为 66． 67%(图 2)。
在丛生芽诱导培养基上培养 5 周后，再转到伸
长生长培养基上，4 周后统计每个家系外植体产生
丛生芽的芽数见图 2。不同家系丛生芽诱导的芽
数差异显著，2 号家系平均芽数最多为 7． 3 个，与
其余 26 个家系差异显著。18 号家系平均芽数最
少为 1. 6 个，与 2、5、10、19 和 26 号家系差异显著。
5、10、19 和 26 号家系的平均芽数达到 4 个。
图 2 抗病赤松 27 个家系丛生芽诱导率和平均芽数的差异(p≤0. 05)
Fig． 2 Variation of clustered shoots and average buds of 27 wilt-resistant P． densiflora families
2． 2 抗病赤松家系嫩梢平均伸长率的差异
将抗病赤松家系各无性系组培苗统一测苗高，
伸长生长 4 周后(图 1C) ，再统一测量苗高，家系平
均伸长情况见图 3。由图 3 可知，不同家系芽平均
伸长率差异显著，8 号家系平均伸长率最高，为
140. 6%，与 2、3、7、14、16、17、18、20、21、23、24 和
26 号家系差异显著;18 号家系平均伸长率最低为
33. 27%，与 1、4、5、8、9、10、13、22 和 25 号家系差
异显著;1、8、10、13、22 和 25 家系的平均伸长率都
达到了 100%以上，这些家系生长较快，可以提前
进行继代增殖，缩短继代培养周期。
图 3 抗病赤松家系组培苗平均伸长率的差异(p≤0. 05)
Fig． 3 Variation of average elongation percentage of tissue culture seedlings in wilt-resistant P． densiflora families
2． 3 抗病赤松 27 个家系不同代数丛生芽增殖的
差异
将抗病赤松 27 个家系各组培苗的单个芽截顶
后转入增殖培养基中，40 d 左右长出大小不等的
小芽(图 1D)。各个家系丛生芽增殖情况见图 4，
随着增殖代数的增加，各家系丛生芽增殖系数表现
不一致，2、6、8、11 号家系第 1 代增殖系数大于第 2
和 3 代，大部分家系在第 2 代增殖中增殖系数达到
较高值，其中 3、7、10、12、13、14、15、16、17、18、19、
22、23、24、25、26 号家系第 2 代增殖系数平均达到
5. 4，远大于第 1 和 3 代;只有 1、5 号家系第 3 代增
殖系数大于第 1 和 2 代。
2． 4 抗病赤松不同无性系组培苗不定根诱导的差异
将高 2． 0 cm以上且生长良好的抗病赤松组培
苗转入生根培养基，30 d 左右统计不同无性系不
定根诱导率，结果见图 5。抗病赤松不同无性系不
定根诱导率不同，2 － A、19 － B 的不定根诱导率分
别为 94． 4%和 95． 8%，而 2 － B、10 － A 和 10 － C
的不定根诱导率为 0;抗病赤松同一家系不同无性
系的不定根诱导率也不同，如 1 － A、1 － B 不定根
诱导率分别为 62. 1%和 50%，2 － A 的不定根诱导
率为 94. 4%，2 － B不定根诱导率为 0。
25
第 2 期 李清清，等:抗松材线虫赤松组培繁殖优良家系的筛选
图 4 抗病赤松 27 个家系不同代数丛生芽增殖的差异
Fig． 4 Variation of axillary buds proliferation of 27 different generations in wilt-resistant P． densiflora families
图 5 抗病赤松不同无性系不定根诱导的差异
Fig． 5 Variation of adventitious roots induction of
wilt-resistant P． densiflora clones
注:2 － B、10 － A、10 － C未做诱导。
将有根原基的组培苗转入珍珠岩培养基进行
不定根的伸长培养，2 个月后根系伸长达8 cm，且
侧根多(图 1E)。然后移栽到混合基质纸杯中(图
1F)培养，2 ～ 3 d 浇水 1 次。1 个月后质量高的苗
成活率高，移栽成活率还达 70%左右。
3 讨 论
针叶树组织培养繁殖中丛生芽生长缓慢是继
代培养周期长的主要原因，芽苗生长缓慢一方面可
能是因为树种本身细胞分裂频率低，生长缓慢造
成;另一方面可能因为增殖率高而导致芽苗营养需
求和吸收不平衡，营养供给不足造成［7］。每一粒
种子为一种基因型，不同个体之间差别较大，表现
出不定芽出芽不整齐，长势不均的现象［8］。试验
研究表明，不同家系芽平均伸长率差异显著，其中
1、8、10、13、22 和 25 号家系平均伸长率都达到了
100%以上，这些家系生长较快，长势较好，可以提
前进行继代增殖，缩短继代培养周期。
外植体基因型是影响芽苗增殖和植株再生的
重要因素［9］，不同遗传材料在繁殖能力方面存在
差异［10］。随着继代代数的增加，分化能力显著下
降［11］，出现生长势衰弱、老化和死亡现象［8］。
Bergmann等［12］研究发现辐射松 31 个家系间不定
芽产量差异显著。吴丽君等［13］发现湿地松抗病与
非抗病家系的芽增殖率与增殖代数存在负相关性，
首次转代增殖率均较高，l 至 3 代增殖率随代数增
加而急剧下降，4 至 5 代趋于下降平缓，一方面可
能是因为植物体内的内源分裂素较高，连续继代后
离体芽对外源分裂素的敏感性降低;另一方面可能
是连续在同一培养基培养后，每代有 10% ～ 20%
的小芽点褐化死亡造成的［13］。吴大忠［14］研究发
现不同无性系繁殖率差异显著，有效苗梢最大相差
8 倍，湿地松不同家系间、家系内个体间增殖率存
在显著差异，同一家系内不同基因型增殖能力也有
差异［15］。以上研究表明，随着增殖代数的增加，抗
病赤松各家系丛生芽增殖系数表现不一致。可能
是组培苗体内内源分裂素较高，连续继代后离体芽
对外源分裂素的敏感性降低［13］造成的。各家系 3
代以上增殖系数和代数的关系还需进一步的研究。
生根是组织培养的重要环节，较高的根系质量
才能保证移栽成活。不定芽的生根与基因型、生理
状态、激素的种类和浓度、预处理及温度有关。不
同树种或同一树种不同家系间以及同一家系内不
同无性系间遗传特性的不同，会导致组培苗在不定
根发生及再生植株移栽成活率等方面有较大的差
异［16］。Cuesta等［17］研究表明意大利石松 6 个家系
的生根率差异很大;欧阳磊［18］研究表明邓恩桉不
同无性系之间的生根率差别非常大，从 16% 到
80%不等。上述结果表明，抗病赤松不同无性系不
定根诱导率不同，其他家系或无性系不定根发生有
待进一步研究。
35
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 37 卷
优良家系的筛选不仅包括组培繁殖生长情况，
还应包括抗病能力、野外适应性。张艺等［19］对抗
松材线虫病 27 个家系进行抗病性测定，结果有 13
个家系抗病表现较好，秦莉等［5］对抗松材线虫赤
松组培再生植株田间生长情况进行监测，统计表明
抗病赤松再生植株试种成活率与再生植株的苗龄
表现出一定的相关性，不同无性系间再生植株生长
状况存在明显差异。通过组培繁殖筛选出生长势
好、增殖系数高、生根能力强的优良家系，是实现抗
病赤松组培快繁的必要有效的途径，可为实现抗病
赤松组培苗工厂化生产提供参考价值。
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(责任编辑 刘昌来)
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