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收稿日期:2015-01-30; 修订日期:2015-06-12
基金项目:国家自然科学基金(No． 81360568);
新疆 维 吾 尔 自 治 区 高 校 科 研 计 划 重 点 项 目 (No．
XJEDU2012I25)
作者简介:黄云飞(1977-)，男(汉族)，新疆哈密人，新疆医科大学公共卫
生学院讲师，博士学位，主要从事维医药的毒理学研究工作．
* 通讯作者简介:袁 芳(1976-)，女(汉族)，甘肃张掖人，新疆医科大学
基础医学院副教授，博士学位，主要从事维吾尔药物防治神经退行性疾病
的基础研究工作．
琐琐葡萄总黄酮
对 Aβ25 － 35诱导 PC12 细胞 Bax表达的影响
黄云飞，刘 玲，袁 芳*
(新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011)
摘要:目的 研究琐琐葡萄总黄酮(Flavones from Vitis viniferal L，VTF)对 Aβ25 － 35诱导 PC12 细胞 Bax 表达的影响。方法
体外培养 PC12 细胞，分为 5 组，对照组正常培养，模型组加入 20μmol·L －1Aβ25 － 35作用 24h建立阿尔茨海默病(Alzheimer
＇s disease，AD)细胞模型，实验组分别加入 20，40，80mg·L －1浓度 VTF干预 24h，通过检测细胞活性、乳酸脱氢酶(LDH)释
放，观察细胞损伤情况，采用实时荧光定量 PCＲ(Ｒeal － time PCＲ)检测 Bax mＲNA 表达，Western bolt 检测 Bax 蛋白表达。
结果 模型组较对照组细胞活性降低，LDH释放增加(P ＜ 0． 01)，Aβ25 － 35诱导 PC12 细胞明显损伤，VTF 实验组与模型组
比较，细胞活性增加，LDH释放减少，有显著差异(P ＜ 0． 05);与模型组比较，给药组 Bax表达下降(P ＜ 0． 01)。结论 VTF
通过调节 Bax表达，对 Aβ25 － 35诱导的细胞损伤有保护作用。
关键词:阿尔茨海默病; 琐琐葡萄总黄酮; PC12 细胞; Aβ25 － 35
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 09． 006
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)09-2064-02
阿尔茨海默病又称老年痴呆，随着老年人口寿命延长，这类
神经退行性疾病发病率增加，严重威胁着老年人的身体健康和生
活质量。AD属复杂性疾病，发病因素复杂，发病机制还未明确，
目前没有有效的治疗手段，从丰富的中草药植物资源寻找预防和
治疗 AD的有效成分，如黄酮、多糖、皂苷等防治 AD的作用机理，
成为老年医学的研究热点。琐琐葡萄(Vitis vinifera L．)为《神农
本草经》《维吾尔药志》等医药文献所记载，是主产于新疆吐鲁
番、和田等地的药用葡萄品种。琐琐葡萄中提取的总黄酮、多糖、
三萜类活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等作
用［1 ～ 3］。本研究采用 Aβ25 － 35 诱导 PC12 细胞损伤建立 AD 模
型，观察 VTF对 AD的保护作用，进而探讨其机制。
1 材料与仪器
1． 1 材料与试剂 琐琐葡萄购自新疆维吾尔自治区吐鲁番维药
市场，Aβ25 － 35(美国 Sigma 公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，
DMEM高糖培养液(Hyclone公司)，CCK － 8 检测试剂盒(武汉博
士德生物工程有限公司)，LDH 试剂盒(南京建成生物研究所)，
Trizol(Invitrogen) ，逆转录试剂盒(TaKaＲa)，荧光定量试剂(In-
vitrogen)，Bax、β － actin引物(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公
司);Bax抗体、β － actin 抗体(Santa Cruz Biotechnology 公司)，辣
根过氧化物酶酶标记二抗(Jackson分装)。
1． 2 仪器 垂直流超净化台(美国 Thermo 公司)，二氧化碳培养
箱(美国 Thermo公司)，酶标仪(美国 Bio － Ｒad 公司)，蛋白电泳
仪(美国 Bio － Ｒad公司)，PCＲ 扩增仪(美国 ABI 公司)，凝胶电
泳成像分析系统(美国 Bio － Ｒad 公司)，Ｒeal Time PCＲ System
7700 型(美国 ABI公司)。
2 方法
2． 1 制备样品 琐琐葡萄药材粉碎后，95%乙醇回流提取，合并
提取液浓缩至浸膏，浸膏以水混悬后，石油醚萃取脱脂，再经乙酸
乙酯萃取，上 AB － 8 型大孔吸附树脂，依次洗脱馏分，减压浓缩，
真空干燥，琐琐葡萄总黄酮测定含量为 35． 28%。
2． 2 细胞培养和分组 中国科学院上海细胞生物学研究所细胞
库提供 PC12 细胞(高分化)，DMEM高糖培养液含 10%灭活胎牛
血清、1%双抗，37℃、5%CO2 细胞培养箱，隔天换液，2 ～ 3d传代。
实验分对照组，模型组(20μmol·L －1Aβ25 － 35作用细胞 24h)，VTF
低、中、高剂量实验组，分别为 20，40，80mg·L －1。
2． 3 细胞活性的测定 PC12 细胞在培养瓶培养至对数生长期，5
× 104·ml －1接种于 96 孔板，每孔 100μl，培养至细胞贴壁，实验
组加入 20，40，80mg· L －1 VTF 预处理 4h，除对照组外加入
Aβ25 － 35(超纯水溶解浓度为 1mmol·L
－1，置于 37℃7d凝集老化，
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时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 9 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 9
实验 前 稀 释)，模 型 组、VTF 实 验 组 Aβ25 － 35 终 浓 度 为
20μmol·L －1，细胞培养 24h后，每孔加入 CCK － 8 染色液 10μl，
继续培养 4h，在全自动酶标仪 450nm 波长下，测定吸光度(OD)
值。
2． 4 LDH活性的测定 按照“2． 3”方法分组培养细胞 24h后，收
集细胞培养上清液，转移至新的 96 孔板中，按照 LDH 检测试剂
盒说明书操作，酶标仪分析每孔 OD值，按照公式计算 LDH 活性
(U/L)。
2． 5 Ｒeal － time PCＲ测定 baxmＲNA表达 细胞培养至对数生长
期，接种到 6 孔板，5 × 105 个细胞每孔，如上分组处理细胞，加入
胰酶消化后吹打收集细胞，Trizol 法提取总 ＲNA，对 ＲNA 浓度和
纯度进行检测。按照试剂盒说明合成 cDNA，荧光定量 PCＲ反应
条件 94℃5min，94℃30s，57 ～ 52℃30s，72℃30s，72℃10min，35 个
循环。鼎国昌盛生物技术有限责任公司设计、合成引物序列，β
－ actin和 bax 引物序列分别为 5＇－ AGACCTTCAACACCCCAGCC
－ 3 ＇，5 ＇ － CGTCAGGCAGCTCAT AGCTC － 3 ＇，5 ＇ － CGGCGAATTG-
GAGATGAACTG － 3＇，5 ＇ － GCAAAGTAGAAGAGGGCAACC － 3 ＇，扩
增的目的基因片段分别为 362bp 和 161bp。采用双标准曲线法，
计算待测组目的基因相对于对照组的表达差异倍数。
2． 6 Western － Blot检测 Bax蛋白表达 分组培养细胞至 6 孔板，
胰酶消化收集细胞，每孔加 PBS反复吹打收集细胞入离心管，离
心保留细胞，将细胞置于冰上，用 ＲIPA 蛋白裂解液裂解细胞提
取蛋白。BCA法测定每组蛋白含量，样品经聚丙稀酰胺凝胶电
泳，转膜，封闭，PVDF膜置于杂交袋，加入配好的一抗溶液(β －
actin、Bax的一抗用 TBST 以 1∶ 1000 比例稀释)，4℃过夜孵育，
用 TBST脱色摇床洗膜 3 次，加辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶
4000 稀释)，室温摇床孵育 2 h 洗膜，加入 ABC 复合物，洗膜，加
入显色液后压片、曝光、显影、扫描胶片，用 Quantity One 图像分
析软件进行灰度扫描，对蛋白条带进行图像采集，分析样本蛋白
与 β － actin 区带的灰度值的比值，反映样本蛋白的表达水平。
2． 7 统计学分析 SPSS18． 0 软件统计处理，试验数据均以 珋x ± s
表示，P ＜ 0． 05 视为差异有统计学意义。
3 结果
3． 1 VTF对 Aβ25 － 35诱导的 PC12 细胞活性和 LDH的影响 与对
照组比较，模型组细胞生长受到抑制，细胞活性下降，LDH 释放
增多(P﹤ 0． 01);与模型组相比，加入 VTF干预后，中、高剂量实
验组细胞活性明显增加(P ＜ 0． 05)，LDH 释放减少(P ﹤0． 01)。
见表 1。
表 1 VTF对 Aβ25 － 35诱导的 PC12 细胞活性的影响(珋x ± s)
组别
浓度
/mg·L －1
吸光度值
(OD)
LDH 活力
/U·L －1
对照组 － 0． 590 ± 0． 017 324． 63 ± 14． 23
模型组 － 0． 365 ± 0． 017△ 580． 00 ± 13． 60△
VTF低剂量组 20 0． 381 ± 0． 015 532． 28 ± 12． 13＊＊
VTF中剂量组 40 0． 439 ± 0． 027* 465． 15 ± 15． 12＊＊
VTF高剂量组 80 0． 539 ± 0． 034＊＊ 416． 21 ± 13． 14＊＊
与对照组相比，△P ＜0． 01;与模型组相比，* P ＜0． 05，＊＊P ＜0． 01
3． 2 VTF 对 Aβ25 － 35诱导的 PC12 细胞 Bax mＲNA 表达的影响
Ｒeal － time PCＲ结果显示，与对照组相比，模型组 Bax mＲNA 表
达升高(P﹤ 0． 01);与模型组相比，VTF 中高剂量组 Bax mＲNA
表达下降，差异显著(P ＜ 0． 05)，见表 2。
3． 3 VTF 对 Aβ25 － 35诱导的 PC12 细胞 Bax 蛋白表达的影响
Western blot结果显示，与对照组相比，模型组 PC12 细胞 Bax 的
蛋白表达增多，与模型组相比，VTF实验组 PC12 细胞 Bax蛋白表
达减少。见图 1。
表 2 VTF对 Aβ25 － 35诱导 PC12 细胞 Bax mＲNA表达的影响(珋x ± s)
组别 浓度 /mg·L －1 Bax mＲNA相对表达 /倍
对照组 － 1． 00 ± 0． 00
模型组 － 3． 84 ± 0． 40△
VTF低剂量组 20 3． 19 ± 0． 20*
VTF中剂量组 40 2． 93 ± 0． 16*
VTF高剂量组 80 1． 95 ± 0． 07＊＊
与对照组相比，△P ＜0． 01;与模型组相比，* P ＜0． 05，＊＊P ＜0． 01
1．对照组;2．模型组;3． VTF高剂量组;
4． VTF中剂量组;5． VTF低剂量组
与对照组相比，△P ＜ 0． 01;与模型组相比，#P ＜ 0． 01
图 1 VTF对 Aβ25 － 35诱导 PC12 细胞 Bax蛋白表达的影响(珋x ± s)
4 讨论
Aβ是 AD特征性病理学改变———老年斑的主要成分，源自
淀粉样前体蛋白(Amy1oid precursor protein，APP)。正常情况下，
Aβ的形成和清除保持平衡状态，但当 APP发生异常表达或代谢
时，Aβ 在神经细胞沉积，形成老年斑，启动病理级联反应(amy-
loid cascade hypothesis，淀粉样级联假说)，损害脑功能，Aβ 对神
经细胞的毒性作用是目前公认 AD发病的关键［4］。Aβ诱导建立
AD体内体外模型，在 AD 发病机制及药物筛选研究中被广泛应
用［5，6］。PC12 细胞为大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞株，具有较
典型的神经细胞特性，与原代培养的神经细胞相比，PC12 细胞具
有易控制、传代快速、细胞同一性好等优点，国际上公认用于体外
进行神经系统疾病研究的理想模型，也可用来建立模型筛选神经
保护药物［7，8］。本研究建立 AD 细胞模型，采用 20μmol·L －1
Aβ25 － 35作用于 PC12 细胞 24h，结果显示，模型组细胞活性减小、
LDH释放增加(P ＜ 0． 01)，表明 Aβ25 － 35对细胞产生毒性损伤，可
以作为评价 VTF保护作用的实验条件。
黄酮类物质为各类天然药物的主要成分，具有抗氧化、抗衰
老、神经保护、促进学习记忆等作用。中药、豆类植物等提取的黄
酮对 PC12 细胞具有神经保护作用［9，10］。本实验从琐琐葡萄中提
取总黄酮，对 AD细胞模型进行干预，观察其是否具有神经保护
作用，结果显示，与模型组比较，高、中剂量 VTF组细胞活性明显
增加(P ＜ 0． 05)，实验组细胞损伤引起的 LDH 释放也明显减少
(P ＜ 0． 01) ，表明 VTF 对细胞损伤有明显改善作用，进而探讨其
作用机制，ＲT － PCＲ 与 Western blot 结果显示，与模型组比较，
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 9 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 9 期
VTF能下调 Bax表达，具有显著性差异(P ＜ 0． 05)。Bax是 Bcl －
2基因家族成员，Bcl － 2 家族蛋白是定位在线粒体膜及内膜系统
上的凋亡调控蛋白，Bcl － 2 家族介导凋亡信号在线粒体外膜结
合并插入，使得线粒体通透性发生改变，细胞进入凋亡。此家族
包括两类功能相反的蛋白，分促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。促凋亡
主要有 Bax、Bid、Bad等，诱导细胞凋亡的发生。Aβ 能加强神经
细胞对神经毒素、自由基等有害因素的易感性，造成线粒体功能
障碍［11］。Bax是促凋亡基因，Aβ 通过上调 Bax 及蛋白表达造成
细胞损伤，而 VTF通过抑制 Bax表达减轻 Aβ的神经毒性。综上
所述，VTF能减轻 Aβ25 － 35诱导 PC12 细胞的损伤，对 AD 模型具
有神经保护作用，有可能是通过抑制 Bax mＲNA和蛋白的表达发
挥作用，减轻 Aβ 毒性造成的神经细胞损伤，为进一步探索 VTF
防治 AD作用机制的后续研究提供依据。
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收稿日期:2014-11-14; 修订日期:2015-06-16
基金项目:国家自然科学基金(No． 81273942);
天津市应用基础及前沿技术研究计划(No． 12JCZDJC25300)
作者简介:刘 爽(1984-)，女(汉族)，河北唐山人，天津中医药大学第二
附属医院主治医师，硕士学位，主要从事中西医结合治疗脑病临床、科研
及教学工作．
* 通讯作者简介:周 震(1974-)，男(汉族)，天津人，天津中医药大学第
二附属医院副主任医师，硕士研究生导师，博士学位，主要从事中西医结
合神经内科临床与科研工作．
化痰通络中药对急性脑梗死模型大鼠溶栓治疗后
内质网应激诱发神经细胞凋亡的影响
刘 爽1，周 震1* ，张玉莲1，樊晓靖1，宋宛珊2，王 凯2，孙伟明2
(1．天津中医药大学第二附属医院，天津 300150; 2． 天津中医药大学，天津 300193)
摘要:目的 明确化痰通络中药对急性脑梗死模型大鼠溶栓治疗后内质网应激诱发神经细胞凋亡的影响及其可能的分
子机制。方法 将 160 只健康 SD大鼠随机等分为 4 组，即假手术组、模型组、rt － PA组、rt － PA +化痰通络组，每组再随机
分为 6h、1d、3d、7d四个时相，假手术组以生理盐水造模作为对照，其余各组以栓子盐水悬液制造大脑中动脉栓塞
(MCAO)模型，造模成功后假手术组和模型组尾静脉注入生理盐水干预，rt － PA 组尾静脉注入 rt － PA 干预，rt － PA +化
痰通络组给予尾静脉注入 rt － PA和化痰通络中药灌胃干预。采用原位末端标记法(TUNEL)观察各组大鼠不同时相海
马 CA3 区神经元凋亡情况，并采用流式细胞仪计数凋亡神经元。通过 Western blot 法检测梗死脑组织 GADD153 /CHOP、
TＲB3 和 Akt蛋白表达水平。结果 同一组内与 6h 时相比较，各组在 24h、72h 时相神经元凋亡具有显著性差异(P ＜
0． 05)，并以 24h神经元凋亡最多。同一时相内与假手术组比较，模型组神经元凋亡显著升高(P ＜ 0． 05)。同一时相内与
模型组比较，rt － PA组在 24h、7d时相神经元凋亡明显低于模型组(P ＜ 0． 05)，rt － PA +化痰通络组各个时相神经元凋亡
均显著降低(P ＜ 0． 05)。与 rt － PA组相比，rt － PA +化痰通络组在 1d 和 3d 时相神经元凋亡显著(P ＜ 0． 05)，其余时相
均有降低的趋势。rt － PA +化痰通络组 TＲB3 表达受到抑制(P ＜ 0． 05)，而 Akt表达受到促进(P ＜ 0． 05)。结论 化痰通
络中药可明显减轻急性脑梗死模型大鼠溶栓治疗后内质网应激诱发的神经元凋亡，且其机制可能与抑制 TＲB3 和促进
Akt蛋白表达有关。
关键词:化痰通络; 急性脑梗死; 溶栓; 内质网应激; 凋亡
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 09． 007
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)09-2066-04
急性脑梗死是一种临床常见急症，早期有效的治疗对患者预
后影响很大。大量研究表明超早期溶栓是治疗急性脑梗死最有
效的治疗方法之一［1，2］。美国卒中协会(ASA)也推荐，急性脑梗
死 3 h内采用重组组织型纤溶酶原激活剂(rt － PA)溶栓是一种
有效治疗方法［3，4］，但迄今为止仅有 3% ～5%的患者得到了及时
的溶栓治疗，这不仅因为溶栓时间窗较短(3 ～ 4． 5 h内)，同时也
与溶栓后易发生严重的缺血再灌注损伤［5］有关，其可导致脑部
梗死区及周围半暗带区神经细胞的坏死与凋亡，进而加重脑损
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