全 文 ：·论 著· 中国现代医生 2016 年 2 月第 54 卷第 6 期
CHINA MODERN DOCTOR Vol. 54 No. 6 February 2016
钩藤碱对痴呆模型小白鼠学习记忆的干预作用研究
朱文娟 1 程金生 2▲
1.浙江省湖州市第一人民医院病理科，浙江湖州 313000；2.嘉应学院医学院，广东梅州 514031
[摘要] 目的 研究猫爪草提取物钩藤碱对痴呆模型小白鼠学习记忆的干预作用。 方法 采用免疫组化分析及半
定量反转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）测定钩藤碱（rhynchophylline，
RH）对快速老化痴呆型小白鼠（SAMP8）脑内 β 位点 APP 裂解酶（β-site APP cleavage enzyme，BACE）、β-淀粉样
蛋白前体（β-site amyloid precursor protein，AβPP）及淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）沉积表达。 结果 在小鼠探索实
验中，SAMP8组小鼠停留原平台象限时间（18.59±7.72）s，穿越平台次数为（1.00±0.95）次，而钩藤碱中剂量组两组
对应时间分别为（27.02±8.77）s和（2.30±1.07）次。 与对照组相比，钩藤碱实验组痴呆模型小白鼠在原来的平台各
象限中的驻留时间显著变长，且另一方面，该实验组小鼠穿越原来的平台的次数有明显的增加。 进一步研究发现
钩藤碱各剂量能明显降低 SAMP8 脑内 Aβ 平均光密度值和免疫阳性神经元数，如 SAMP8 组皮层 Aβ 平均光密
度值和免疫阳性神经元细胞数分别为（0.326±0.094）和（69.91±9.31），而钩藤碱中剂量组对应值分别为（0.242±
0.074）和（39.94±8.56）。 且采用钩藤碱干预后，SAMP8 小白鼠脑内 BACE、APP mRNA 含量也呈现下降趋势，如钩
藤碱高剂量组 AβPP mRNA 表达值为（84.00±5.03），与 SAMP8组对应值（110.11±30.51）。 以上效应均呈现一定的
量效关系。 结论 钩藤碱能较好地抑制 APP裂解酶、β-淀粉样蛋白前体及淀粉样蛋白的过度生成，从而保护小鼠
的神经元免受淀粉样蛋白的神经毒性影响，进而改善快速老化痴呆模型小白鼠 SAMP8的学习记忆能力。
[关键词] 阿尔茨海默病；小鼠；记忆；猫爪草
[中图分类号] R749.16；R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）06-0012-07
Intervention of rhynchophylline on the learning and memory abilities of a
dementia mouse model
ZHU Wenjuan1 CHENG Jinsheng2
1.Department of Pathology, the 1st Peoples Hospital of Huzhou City in Zhejiang Province, Huzhou 313000, China;
2.School of Medicine, Jiaying University, Meizhou 514031, China
[Abstract] Objective To research the intervention of rhynchophylline extracted from root of catclaw buttercup on the
learning and memory abilities of a dementia mouse model. Methods The expressions of beta-site APP cleaving enzyme
（BACE）， amyloid-β precursor protein （AβPP） and Aβ in senescence accelerated mouse prone 8 （SAMP8） mouse
brain were studied by immunohistochemical analysis and reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）
analysis etc. Results Comparing with the control group， in spatial exploration test of the RH-treated group， the stay-
ing time and the frequency of striding over primary terrace quadrant increased significantly. For example， the staying
time of original platform and frequency of crossing original platform of SAMP8 group were（18.59±7.72） sec and（1.00±
0.95） time， respectively. While for mid-dose of RH group， the data changed to（27.02±8.77） sec and（2.30±1.07） time，
respectively. The Aβ mean optical density as well as the brain immunoreactive neurons of the RH cured group would
decrease significantly comparing with SAMP8 group. For example， for SAMP8 group， mean optical density and the
brain immunoreactive neurons were（0.326±0.094） and（69.91±9.31），while for mid-dose， mean optical density and the
brain immunoreactive neurons would change to （0.242±0.074） and （39.94±8.56）. The mRNA contents of BACE and
AβPP also decline after rhynchophylline intervention. For example， for high-dose RH goup， the AβPP mRNA expres-
sion was （84.00±5.03）， while for SAMP8 group， the data was （110.11±30.51）. All of these effects showed a dose-effect
relationship. Conclusion All the results in this work indicate that rhynchophylline can improve the learning and memo-
ry abilities in SAMP8 by inhibit the expression of BACE， AβPP and Aβ in SAMP8 brain， leading to protection of the
neurons from the nuerotoxicity of Aβ.
[Key words] Alzheimer Disease; Mice; Memory; Root of catclaw buttercup
[基金项目 ] 广东省自然科学基金 （S2013010012676）；广东
省扬帆计划引进紧缺拨尖人才项目（No.2014014）
▲通讯作者
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·论 著·
阿尔茨海默氏病 （Alzheimers disease，AD）的临
床表现是患者的认知功能和记忆功能越来越差 [1]。 典
型病理特征为脑部 β 淀粉样蛋白（Aβ）沉积并聚集形
成老年斑（senile plaque，SP），且主要存在于与脑部与
记忆和认知相关的特定区域[2]。进一步的研究表明，大
量老年斑聚集、β 淀粉样肽的大量变性沉积以及细胞
内蛋白异常磷酸化导致的大量神经原的纤维缠结
（neurofibrillary tangles，NFT）其病患脑部的显著病理学
特征[3，4]，这也是 AD 发病机制中重要的环节之一。 诸
多证据表明，包括上述 Aβ 沉积、神经纤维缠结等因
素与 AD的发病机制密切相关[5，6]。 尽管西方国家已批
准 9-氨基四氢吖啶及石杉碱甲等药物用于阿尔茨海
默氏病的治疗，但治疗效果仍不尽人意，有必要探索
包括中草药在内的 AD替代治疗方法[7]。
越来越多的临床证据显示，一些中草药对提升轻
度至中度阿尔茨海默症患者的学习和记忆能力有很
大帮助 [8，9]。 钩藤碱是由传统中药钩藤[来源于一些药
用植物如钓钩藤 10（Uncaria rhynchophylla，也称鱼钩
藤，图 1）和绒毛钩藤 [11]（Uncaria tomentosa，也称猫爪
草）等]中提取的一种生物碱，临床应用较多。 钩藤碱
属于非竞争性拮抗剂和钙离子通道阻断剂 [12-15]。
目前，国内外已有中药干扰或治疗阿尔茨海默病
相关研究 [16-21]，但尚未见钩藤碱对阿尔茨海默病干扰
相关研究。本工作探索通过凝胶电泳和免疫组化方法
等技术研究钩藤碱对 β 淀粉样蛋白 Aβ 聚集体形成
及 Aβ纤维解聚的体外干预效应。 观察钩藤碱对快速
老化痴呆模型小白鼠 SAMP8 的学习记忆能力的改善
效果。
1 资料与方法
1.1 动物来源
6 月龄快速老化痴呆型小白鼠和正常老化小白
鼠（SAMR1，雄性）由广州中医药大学第一附属医院提
供，SPF 级，体重 18～22 g，所有动物实验均符合动物
实验伦理准则。
1.2 试剂
一抗：β-淀粉样蛋白前体及兔抗大鼠多克隆抗体
（购自 Invitrogen公司）；二抗：即用型快捷 MaxvisionTM
检测试剂盒；DAB 显色试剂盒购自 Invitrogen 公司；
cDNA 逆转录试剂盒和琼脂糖购自上海生工有限公
司；焦碳酸二乙酯（DEPC），石杉碱甲，Trizol 试剂及
PCR TaqMix 由 Gene Tech 公司购得； 钩藤碱由嘉应
学院医学院自制，纯度 98.3%，钩藤碱标准品（纯度
99%）由中国标准（成都）有限公司提供。
1.3 伦理声明
本工作包含的所有动物实验均符合国际动物伦
理准则，并获得学校相关动物伦理委员会的批准（以
书名报告的形式获得批准，审批编号为 20140325）。
本工作也是在广东省实验动物准则的规范下进行的。
所有的实验均努力降低实验动物的使用数量以及它
们所承受的痛苦度。
1.4 实验方法
1.4.1 分组方法 给药及研究试剂 6 月龄的快速老化
痴呆型小白鼠（SAMP8，雄性）50 只被随即平均分为
SAMP8组、huperzine A（石杉碱甲）阳性对照组、RH（钩
藤碱）低、中及高剂量组，共五组。 10只 6月龄正常老
化小白鼠（雄性）设为另一个对照组（SAMR1对照组）。
本研究中，快速老化痴呆型小白鼠对照组、正常老化
小白鼠对照组喂服生理盐水，剂量为每千克 30 mL；
huperzineA阳性对照组喂服 huperzineA每公斤 0.02mg；
RH低剂量组：喂服钩藤碱剂量：每公斤 45 mg；RH 中
剂量组：喂服钩藤碱剂量：每公斤 90 mg；RH 高剂量
组：喂服钩藤碱剂量：每公斤 180 mg；如上各实验组
每天以灌胃方式给药一次，连续给药 50 d。研究时间：
2012年 5月~2014年 3 月。
1.4.2 隐蔽性平台实验、探索性实验 隐蔽性平台实验：
各实验组药物给药结束后，开展水迷宫（Morris）试验。
所述水迷宫为一圆形池状结构，不锈钢材质，高度为
50 cm，直径为 100 cm，水温为 22℃。 该水迷宫共分为
四个区域，被成为象限，本实验随即选择任何一个象
限，居中放置一个直径 10 cm 的圆形小平台，并将平
台沉于水下 1 cm。 上述装置上缘安装有与电脑链接
的小型摄像机，并能随时跟踪小鼠的水下轨迹并实时
分析。该隐蔽性平台实验共 5 d，每天两次（上、下午各
一次）。 小鼠面向池壁，由相邻象限的圆池中间入池。
通过摄像机记录小鼠在百秒内寻找到平台的时间。一
旦该实验小鼠无法在规定的时间找到平台，将由研究
员人工牵引到平台保持约 10 s。 相关数据（逃避潜伏
期）被标记为 100 s。 每天记录两次，求平均值。
探索性试验：隐蔽性平台实验结束后，将上述平
台去掉，将实验小鼠随机放入水中，观察在 100 s 内
小鼠回想寻找其记忆中的平台的水中轨迹，并记下其
图 1 钩藤碱结构图（A）及代表性植物来源：钓钩藤（B）
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穿越初始平台的次数以及在初始象限中游泳的时间
（s）。
1.4.3 生物化学检测 免疫组化实验：上述实验结束后，
将实验小鼠处死，在低温情况下快速取出实验小鼠的
脑部组织，置于超低温冰箱中保存。 每次对上述组织
进行切片分析前，一次将其放入低温冰箱和 4℃冰箱
各 30 min，随后用 10%的福尔马林处理。 经相关处理
（包括脱水、浸蜡、包埋等）后，切为 3 μm 左右切片，
并选用二甲苯进行脱蜡，并用酒精梯队水化处理。 β淀
粉样蛋白在柠檬酸缓冲溶液（pH 值为 6.0）修复抗原
约 90 s（在压力容器内加热至沸腾）。各切片滴加 1滴
上述溶液或者 H2O2溶液（3%，50 μL），在室温下静置
10 min。 从而对活性内源性过氧化物酶进行有效阻
断。各切片加 50 μL的 β-淀粉样蛋白前体和按 1∶100
稀释的淀粉样兔抗大鼠多克隆抗体，在常温冰箱保温
层静置过夜。 上述各切片采用 50 μL的二抗（Maxvi-
sionTM试剂盒）室温静置 15 min。二氨基联苯胺显色，
在显微镜下观察以控制时间。通过蒸馏水或去离子水
及时洗涤以结束上述反应。采用 Hematoxylin（苏木素）
复染 30 s，水洗涤、返蓝处理、乙醇梯度脱水处理、二
甲苯脱蜡处理、树胶（中性）封片处理等，在显微镜下
观察。
上述切片经二氨基联苯胺显色处理后，β 淀粉样
蛋白及 β-淀粉样蛋白前体显黄色。 采用磷酸缓冲液
替代一抗（primary antibody），以作为实验的阴性对照。
在 β-淀粉样蛋白前体等染色切片的小鼠脑部皮层以
及海马区域各取三个视野，采用病理切片分析系统分
析各视野范围内 β-淀粉样蛋白前体及淀粉样蛋白的
光密度均值以及具有阳性的细胞数目。
1.4.4 采用逆转录 PCR 测定 BACE 和 APP mRNA 按
Trizol试剂说明提取细胞总 RNA，并检测 RNA完整性
和纯度，利用 cDNA 逆转录试剂盒将 RNA 逆转录成
cDNA。 依据美国国家生物技术信息中心信息银行的
小鼠脑内 β 位点 APP 裂解酶（BACE）、β-淀粉样蛋白
前体 （AβPP）及淀粉样蛋白 （Aβ）的序列 ，以 Primer
premier 5.0 软件（加拿大 Premier 公司）来设计各蛋白
上下游的引物相应序列。
BACE 上游引物为 5’ -TGGGCTTCTGTCTTG-
GAG--3’， 下游引物为 5’-TATG CGATGCGAAT-
GTTT -3’；APP 上游引物为 5’ - AGATTGCGATCG
CGTACTCT-3’， 下游引物为 5’-GAT TTGATCGGC-
GATTATTG-3’；β-actin 上游引物为 5’-TAGCGCC-
CG TTGGTTGTCGT-3’， 下游引物为 5’-TTGACGC-
CTGATAGCTGCAGCC-3’， 以上引物由上海生工生物
工程公司合成。 本工作利用上述设计的引物及 PCR
试剂盒各自合成 β 位点 APP 裂解酶（BACE）、β-淀粉
样蛋白前体（AβPP）及淀粉样蛋白（Aβ）等基因。 扩增
反应条件：93℃预变性 5 min，随后同样温度变性 42 s。
55℃退火 50 s，70℃保持 1 min。 共 32~36 个循环 。
72℃继续延伸 10 min。随后，吸取 10 μL扩增产物于凝
胶电泳（含溴酚蓝），参数设置为 100福特，持续 45 min。
凝胶电泳完成红，采用 Bio-Rad 凝胶成像分析仪进行
观察。 并对 PCR扩增后的片段的光密度进行扫描，得
出相应的光密度积分值。 此外，扫描相同产品的靶基
因 PCR 扩增产物及内参的 PCR 扩增物的光密度，得
出光密度比值一分析靶基因的表达水平。
1.4.5 钩藤碱的制备、纯化 钓钩藤等样品采自梅州阴
那山，样品采集后经晒干、切段，粉碎及过筛（40 目，
59.6 pm）等工序进行预处理。 取 1个 100 mL烧杯，加
入 50 mL 80%乙醇，将样品（10 g）浸泡其中，并在-4℃
冰箱静置 12 h。 随后将样品溶液超声 1 h，旋转蒸发
除去溶剂，收集棕色残留物。 将该棕色样品在 60℃真
空干燥 24 h， 得到含有钩藤碱成分的钩藤总碱粗品
（标记为 RH-T）。
随后，将 400 mg上述 RH-T样品溶于 10 mL甲醇，
超声 5 min，经 0.22 μm 尼龙微孔滤膜过滤，得棕色溶
液（标记为 RH-S）。
采用 Waters 1525EF 半制备型高效液相色谱仪
对钩藤碱进行分离纯化，色谱柱：XTerra@Prep RP18 柱
（30 m×0.25 mm×0.25 μm），流动相：甲醇：0.01 mol/L
磷酸二氢钾（pH 8.0，以 KOH 调 pH），体积比 65∶35 至
50∶50（时间 30 min），流速 1.0 mL/min，柱温 30℃，检
测波长 245 nm。样品注入量：130 μL。上述条件可以较
好地将钩藤碱组分与异钩藤碱等其他碱分离开来。
收集保留时间在 36.2~53.5 min 范围内的钩藤组
分，薄层色谱数据显示，该样品比移值为 0.35（与钩藤
碱标准品数据一致）。样品也分别用 1H NMR（Bruker
Advanced Ⅲ 500 核磁共振仪，500 MHz，CDCl3 为氘
代试剂）、质谱（JEOL JMS-800D 质谱仪）进行了详细
表征，与钩藤碱的标准数据基本一致[12，13]。在上述表征
结果基础上， 重复上述 HPLC分离实验过程 20次，小
心收集保留时间范围为 36.2~53.5 min 的所有钩藤碱
组分，将该组分放置于-80℃冰箱内 48 h，所得到的白
色絮状固体用去离子水洗涤 3 次除去残留磷酸二氢
钾，随后将洗涤后样品再次放入-80℃冰箱内 24 h，得
白色粉状钩藤碱固体，纯度为 98.3% （HPLC）。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 17.0 统计学软件进行分析。 计量资料
以均数±标准差（x±s）表示，采用 t 检验，P＜0.05 为差
异有统计学意义。
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·论 著·
2 结果
2.1 钩藤碱表征数据
1H NMR （500 MHz，CDCl3，27℃）：δ0.723（m，3H），
0.865 （m，1H），1.185 （m，1H），1.306 （s，1H），1.603 （t，
1H），1.880 （d，2H），2.221 （m，3H），3.345 （m，2H），3.567
（d，2H），3.688（t，3H），6.844（s，3H），6.958（t，1H），7.103
（m，1H），7.159 （m，2H），7.190 （m，1H），8.638 （s，1H）;
MS m/z 385（[M+H]+），384，383，353，170，149，148，
136，114。
2.2 小鼠隐蔽平台及探索性实验数据
2.2.1 隐蔽平台实验结果 研究指标为逃避性潜伏期
参数（单位为 s），给出的是对照组以及不同药物干扰
后小白鼠 5 d内逃避潜伏期数据。 见表 1。
2.2.2 小白鼠探索性实验结果 研究指标为停留原平
台象限时间（单位为 s）及穿越原平台次数（单位为次）
等参数，给出的是不同实验组小白鼠停留原平台象限
时间、穿越原平台次数数据。 见表 2。
2.3 免疫组化实验数据
不同实验组小白鼠脑部皮层Aβ 在神经细胞的胞
浆表达，见图 2；不同实验组小白鼠大脑海马 Aβ 在
神经细胞的胞浆表达，见图 3。钩藤碱干扰对小白鼠脑
部 BACE mRNA、AβPP mRNA表达的影响，见图 4。
2.4 各组小鼠脑部皮层以及海马淀粉样蛋白表达的平
均光密度和阳性细胞数
以平均光密度值和免疫阳性神经元细胞数百分比
值（单位为%）为研究指标，给出的为 SAMR1 对照组、
SAMP8 对照组以及 huperzine A 阳性药对照组、不同
剂量钩藤碱实验组大脑皮层 Aβ 平均光密度值和免
疫阳性神经元细胞数。 见表 3。
表 1 钩藤碱对快速老化小白鼠 SAMP8 逃避性潜伏期影响研究（x±s，s）
注：△所标记该数据与 SAMR1 对照组同一日数据间比较：（81.47±16.17） vs （57.69±23.03），t=5.85，P<0.05；（77.88±26.64） vs （48.87±31.59），t=4.37，
P<0.05；（75.11±26.22） vs （41.98±28.77），t=2.07，P<0.05；（64.87±34.22） vs （31.77±7.89），t=3.23，P<0.05；△△所标记该数据与 SAMR1 对照组同一日
数据间比较：（64.01±35.12） vs （22.89±9.57），t=3.43，P<0.01；▲所标记该数据与 SAMP8 对照组同一日数据间比较：（57.69±23.03 vs 81.47±16.17，t=
5.85，P<0.05；（48.87±31.59） vs （77.88±26.64），t=4.87，P<0.05；（41.98±28.77） vs （75.11±26.22），t=3.53，P<0.05；（31.77±7.89） vs （64.87±34.22），t=
2.92，P<0.05；（41.14±38.16） vs （75.11±26.22），t=3.42，P<0.05；（33.66±30.85） vs （64.87±34.22），t=3.16，P<0.05；（30.71±25.73） vs （64.01±35.12），t=
2.84，P<0.05；（42.02±26.02） vs （75.11±26.22），t=3.54，P<0.05；（32.75±16.32） vs （64.87±34.22），t=3.04，P<0.05；（32.01±19.11） vs （64.01±35.12），t=
3.00，P<0.05；（43.51±25.46） vs （75.11±26.22），t=3.75，P<0.05；（30.69±12.17） vs （64.87±34.22），t=2.80，P<0.05；▲▲所标记该数据与 SAMP8 对照组
同一日数据间比较：（22.89±9.57） vs （64.01±35.12），t=2.11，P<0.01；（26.12±6.97） vs （64.01±35.12），t=2.38，P<0.01；（31.01±12.33） vs （75.11±26.22），
t=2.41，P<0.01；（25.73±8.68） vs （64.87±34.22），t=2.31，P<0.01；（23.52±6.77） vs （64.01±35.12），t=2.16，P<0.01
1
2
3
4
5
6
SAMR1 对照组
SAMP8 对照组
huperzine A阳性药对照组
钩藤碱低剂量组
钩藤碱中剂量组
钩藤碱高剂量组
57.69±23.03▲
81.47±16.17△
71.50±18.81
65.72±31.66
66.45±23.22
62.80±30.13
48.87±31.59▲
77.88±26.64△
64.92±39.05
71.66±31.82
65.31±37.11
56.23±20.23
1.24/0.063
1.34/0.27
1.27/0.17
2.09/0.24
1.61/0.18
1.33/0.11
41.98±28.77▲
75.11±26.22△
41.14±38.16▲
42.02±26.02▲
43.51±25.46▲
31.01±12.33▲▲
1.52/0.027
1.40/0.25
1.87/0.04
2.40/0.05
1.64/0.049
2.62/0.011
序号 组别 第 1 天 第 2 天 F 值/P 值 第 3 天 F 值/P 值
1
2
3
4
5
6
SAMR1 对照组
SAMP8 对照组
huperzine A阳性药对照组
钩藤碱低剂量组
钩藤碱中剂量组
钩藤碱高剂量组
31.77±7.89▲
64.87±34.22△
33.66±30.85▲
32.75±16.32▲
30.69±12.17▲
25.73±8.68▲▲
1.31/0.0038
1.09/0.17
1.17/0.005
1.43/0.005
1.00/0.0036
4.250.00021/
22.89±9.57▲▲
64.01±35.12△△
30.71±25.73▲
32.01±19.11▲
26.12±6.97▲▲
23.52±6.77▲▲
2.32/0.000062
1.66/0.17
4.02/0.0015
5.54/0.0022
4.88/0.00023
30.56/0.000046
序号 组别 第 4 天 F 值/P 值 第 5 天 F 值/P 值
表 2 钩藤碱对快速老化痴呆型小白鼠逃避时间影响研究（x±s）
注：△所标记该数据与 SAMR1 对照组同一测定项目数据间比较：（18.59±7.72） vs （26.32±6.95），t=5.81，P<0.05；（1.00±0.95） vs （2.31±1.56），t=2.53，
P<0.05；（21.31±5.83） vs （26.32±6.95），t=9.51，P<0.05；▲所标记该数据与 SAMP8 对照组同一测定项目数据间比较：（26.32±6.95） vs （18.59±7.72），t=
5.81，P<0.05；（2.31±1.56） vs （1.00±0.95），t=2.53，P<0.05；（2.21±0.91） vs （1.00±0.95），t=2.65，P<0.05；（2.17±0.97） vs （1.00±0.95），t=2.71，P<0.05；
（27.02±8.77） vs （18.59±7.72），t=5.41，P<0.05；（2.30±1.07） vs （1.00±0.95），t=2.54，P<0.05；（27.99±8.92） vs （18.59±7.72），t=4.96，P<0.05；▲▲所标记该
数据与 SAMP8对照组同一测定项目数据间比较：（2.60±0.99） vs （1.00±0.95），t=2.25，P<0.01
1
2
3
4
5
6
SAMR1 组
SAMP8 组
huperzine A阳性药对照组
钩藤碱低剂量组
钩藤碱中剂量组
钩藤碱高剂量组
序号 组别
26.32±6.95▲
18.59±7.72△
21.31±5.83△
24.40±5.95
27.02±8.77▲
27.99±8.92▲
8.65/0.0000015
3.55/0.000039
19.20/0.00011
16.48/0.00030
25.30/0.00044
停留原平台象限时间（s） F 值/P 值
2.31±1.56▲
1.00±0.95△
2.21±0.91▲
2.17±0.97▲
2.30±1.07▲
2.60±0.99▲▲
3.75/0.0032
5.21/0.0044
4.64/0.0032
4.77/0.0032
4.98/0.0031
穿越原平台次数（次） F 值/P 值
15
·论 著· 中国现代医生 2016 年 2 月第 54 卷第 6 期
CHINA MODERN DOCTOR Vol. 54 No. 6 February 2016
2.5 钩藤碱对 BACE、AβPP mRNA表达的影响
以不同组别 BACE、AβPP mRNA 表达百分比为
研究指标，给出的是对照组、huperzine A 阳性药对照
组、不同剂量钩藤碱实验组对 BACE、AβPP mRNA 表
达的影响相关数据。 见表 4。
图 4 钩藤碱对（A） BACE mRNA；（B） AβPP mRNA 表达的影响
注 ：M、1、2、3、4、5，6 道分别对应于 Marker、SAMR1 对照组 、SAMP8
空白组、石杉碱甲阳性药对照组、钩藤碱低剂量组、钩藤碱中剂量组、
钩藤碱高剂量组
表 3 各组小鼠脑部皮层以及海马淀粉样蛋白表达的平均光密度和阳性细胞数（x±s）
1
2
3
4
5
6
SAMR1 对照组
SAMP8 空白组
huperzine A阳性药对照组
钩藤碱低剂量组
钩藤碱中剂量组
钩藤碱高剂量组
0.234±0.042▲▲
0.326±0.094△△◆◆
0.235±0.043▲
0.260±0.054▲
0.242±0.074▲
0.235±0.072▲
6.95±2.62▲▲◆◆
69.91±9.31△△◆◆
48.36±8.54△△▲▲
47.88±8.57△▲▲
39.94±8.56△△▲◆◆
37.88±6.87△△▲▲◆◆
0.150±0.069▲▲
0.232±0.048△△◆
0.150±0.066▲▲
0.165±0.064▲▲
0.144±0.061▲▲
0.135±0.071▲▲
5.61±1.94▲▲◆◆
62.50±8.70△△◆◆
43.37±8.23△△▲▲
45.74±6.31△△▲▲
40.00±9.57△△▲▲
31.08±5.87△△▲▲◆◆
序号 组别
皮层
平均光密度 阳性细胞数（%）
海马
平均光密度 阳性细胞数（%）
注：△所标记该数据与 SAMR1 对照组同项目数据间比较：（47.88±8.57） vs （6.95±2.62），t=1.33，P<0.05；△△所标记该数据与 SAMR1 对照组同项目
数据间比较：（0.326±0.094） vs （0.234±0.042），t=6.09，P<0.01；（69.91±9.31） vs （6.95±2.62），t=1.22，P<0.01；（0.232±0.048） vs （0.150±0.069），t=4.66，P<
0.01；（62.50±8.70） vs （5.61±1.94），t=1.20，P<0.01；（48.36±8.54） vs （6.95±2.62），t=1.34，P<0.01；（43.37±8.23） vs （5.61±1.94），t=1.30，P<0.01；（45.74±
6.31） vs （5.61±1.94），t=1.28，P<0.01；（39.94±8.56） vs （6.95±2.62），t=1.42，P<0.01；（40.00±9.57） vs （5.61±1.94），t=1.33，P<0.01；（37.88±6.87） vs （6.95±
2.62），t=1.45，P<0.01；（31.08±5.87） vs （5.61±1.94），t=1.44，P<0.01；▲所标记该数据与 SAMP8 对照组同项目数据间比较：（0.235±0.043） vs （0.326±
0.094），t=6.16，P<0.05；（0.260±0.054） vs （0.326±0.094），t=8.88，P<0.05；（0.242±0.074） vs （0.326±0.094），t=6.76，P<0.05；（0.235±0.072） vs （0.326±
0.094），t=6.16，P<0.05；（39.94±8.56） vs （69.91±9.31），t=3.67，P<0.05；▲▲所标记该数据与 SAMP8对照组同项目数据间比较：（0.234±0.042） vs （0.326±
0.094），t=6.09，P<0.01；（6.95±2.62） vs （69.91±9.31），t=1.22，P<0.01；（0.150±0.069） vs （0.232±0.048），t=4.66，P<0.01；（5.61±1.94） vs （62.50±8.70），t=
1.20，P<0.01；（48.36±8.54） vs （69.91±9.31），t=5.49，P<0.01；（0.150±0.066） vs （0.232±0.048），t=4.66，P<0.01；（47.88±8.57） vs （69.91±9.31），t=5.35，
P<0.01；（0.165±0.064） vs （0.232±0.048），t=5.93，P<0.01；（45.74±6.31） vs （62.50±8.70），t=6.46，P<0.01；（0.144±0.061） vs （0.232±0.048），t=4.27，P<
0.01；（40.00±9.57） vs （62.50±8.70），t=4.56，P<0.01；（37.88±6.87） vs （69.91±9.31），t=3.37，P<0.01；（0.135±0.071） vs （0.232±0.048），t=3.78，P<0.01；
（31.08±5.87） vs （62.50±8.70），t=2.98，P<0.01；◆所标记该数据与 huperzine A阳性药对照组同项目数据间比较：（0.232±0.048） vs （0.150±0.066），t=
4.66，P<0.05；◆◆所标记该数据与 huperzine A阳性药对照组同项目数据间比较：（6.95±2.62） vs （48.36±8.54），t=1.34，P<0.01；（69.91±9.31） vs （48.36±
8.54），t=5.49，P<0.01；（0.326±0.094） vs （0.235±0.043），t=6.16，P<0.01；（62.50±8.70） vs （43.37±8.23），t=5.53，P<0.01；（39.94±8.56） vs （48.36±8.54），t=
10.49，P<0.01；（37.88±6.87） vs （48.36±8.54），t=8.23，P<0.01；（31.08±5.87） vs （43.37±8.23），t=6.06，P<0.01
表 4 钩藤碱对 BACE、AβPP mRNA 表达的影响（x±s，n=10）
注：Δ 所标记该数据与 SAMR1 对照组同一测定项目数据间比较 ：
（10.27±2.31） vs （7.47±2.95），t=6.34，P<0.05；（110.11±30.51） vs （85.27±
7.26），t=7.87，P<0.05； ▲所标记该数据与 SAMP8 对照组同一测定项目
数据间比较：（7.47±2.95） vs （10.27±2.31），t=6.34，P<0.05；（85.27±7.26）
vs （110.11±30.51），t=7.87，P<0.05；（85.63±14.28） vs （110.11±30.51），t=
8.00，P<0.05；（84.23±4.66） vs （110.11±30.51），t=7.51，P<0.05；（84.00±
5.03） vs （110.11±30.51），t=7.43，P<0.05；▲▲所标记该数据与 SAMP8 对
照组同一测定项目数据间比较：（6.43±2.42） vs （10.27±2.31），t=4.35，P<
0.01；（5.50±1.62） vs （10.27±2.31），t=3.31，P<0.01；（5.48±1.10） vs （10.27±
2.31），t=3.29，P<0.01；（5.35±1.23） vs （10.27±2.31），t=3.17，P<0.01；◆◆所
标记该数据与 huperzine A 阳性药对照组同一测定项目数据间比较：
（10.27±2.31） vs （6.43±2.42），t=4.35，P<0.01
1
2
3
4
5
6
SAMR1 对照组
SAMP8 对照组
huperzine A阳性药对照组
钩藤碱低剂量组
钩藤碱中剂量组
钩藤碱高剂量组
7.47±2.95▲
10.27±2.31Δ◆◆
6.43±2.42▲▲
5.50±1.62▲▲
5.48±1.10▲▲
5.35±1.23▲▲
85.27±7.26▲
110.11±30.51Δ
88.56±18.63
85.63±14.28▲
84.23±4.66▲
84.00±5.03▲
序号 组别 BACE（%） AβPP（%）
图 2 各组小鼠大脑皮层 Aβ 免疫组化染色×400
注：a、b、c、d、e、f分别为 SAMR1对照组、SAMP8空白组、 石杉碱甲阳
性药对照组、钩藤碱低剂量组、钩藤碱中剂量组、钩藤碱高剂量组
图 3 各组小鼠大脑海马 Aβ 免疫组化染色×400
注：a、b、c、d、e、f 分别为 SAMR1 对照组、SAMP8 空白组、石杉碱甲阳
性药对照组、钩藤碱低剂量组、钩藤碱中剂量组、钩藤碱高剂量组
a b c
d e f
a b c
d e f
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中国现代医生 2016 年 2 月第 54 卷第 6 期
CHINA MODERN DOCTOR Vol. 54 No. 6 February 2016
·论 著·
3 讨论
3.1 不同实验组的隐蔽性平台试验及小鼠探索性试验
实验数据显示，由第 1 天起 ，正常老化小白鼠
（SAMR1）组的逃避性潜伏期显著短于快速老化痴呆型
小白鼠（SAMP8）。 如在第 2天时，SAMR1对照组的逃
避潜伏期为（48.87±31.59）（表 1），明显短于 SAMP8
组同一天数据 （77.88±26.64），具有显著性差异，表明
SAMR1小鼠记忆及学习能力较 SAMP8强。 由表 1数
据所示，从第 3天开始，huperzine A 阳性对照组（石杉
碱甲阳性药组）及钩藤碱各用药组的逃避性潜伏期较
快速老化痴呆型小白鼠（SAMP8）明显缩短，且差异较
为显著。 如石杉碱甲阳性药组第 3 天逃避潜伏期为
（41.14±38.16），同一天钩藤碱低、中、高剂量组逃避潜
伏期数据分别为（42.02±26.02），（43.51±25.46），（31.01±
12.33），均较同一天 SAMP8组数据（75.11±26.22），大大
减小，表明通过钩藤碱或石杉碱甲用药，能较好地改
善 SAMP8 小鼠的记忆及学习能力。 但钩藤碱各组与
huperzine A 阳性组各实验数据差异不显著（表 1）。
第 5 天撤除平台， 观察小鼠的空间探索能力，
SAMR1 对照组（表 2）和钩藤碱组（表 2）水下示踪轨
迹基本都处于原来的平台象限范围内， 其次轨迹较多
的区域为原来的平台临近的两侧象限。 如表 2 所示，
huperzine A 阳性对照组小鼠水下游泳轨迹与 SAMR1
对照组小鼠轨迹大致相同。但快速老化痴呆型小白鼠
（SAMP8）游泳轨迹则基本围绕 Morris 水迷宫池壁，且
轨迹基本上在各象限具有分布，较为随机。 上述数据
表明 ，正常老化小白鼠 （SAMR1）组、huperzine A 阳
性药对照组和钩藤碱各实验组小鼠停留在初始平台
象限的时间以及游泳穿越初始平台次数均显著多于
快速老化痴呆型小白鼠（SAMP8）组，显示正常老化小
白鼠和钩藤碱、石杉碱甲等用药组小白鼠的记忆及学
习能力比快速老化痴呆型小白鼠强， 揭示本研究用
药：钩藤碱一定程度上可以提高快速老化痴呆型小白
鼠的学习能力。
如上所述，在隐蔽平台试验中，钩藤碱各组逃避
潜伏期均大大小于 SAMP8 对照组（表 1），显示喂服
钩藤碱后，SAMP8 组小白鼠的记忆能力提高较为显
著。此外，空间探索性实验表明，钩藤碱各实验组小鼠
在原平台象限的停留时间及游泳穿越初始平台的次
数均大于快速老化痴呆型小白鼠组（SAMP8，表 2），
与对照组相比，由传统中药钩藤提取出的钩藤碱活性
成分能使快速老化小白鼠 SAMP8 保持较长时间记忆
能力。
3.2 Aβ免疫阳性神经元形态特征及分布区域
一般来说， 小白鼠脑部皮层及海马等部位为 Aβ
免疫阳性神经元主要分布区域。该类神经元一般呈现
不规则锥形等。 DAB阳性反应物颜色为棕黄色，主要
定位于细胞膜、胞浆等部位。可观察到阴性细胞核。此
外，通过研究也可以在小鼠脑部细胞壁观察到淀粉样
蛋白（Aβ）的沉积。 正常老化小白鼠脑部皮层以及海
马区域 Aβ 神经元的相关表达极少，阳性反应物 DAB
染色后颜色较浅；快速老化痴呆型小白鼠脑部皮层
Aβ 阳性免疫神经元在神经细胞的胞浆具有广泛表
达，DAB 染色明显变深（图 2b，图 3b）；与之相比钩藤
碱各剂量组（图 2d、e、f，图 3d、e、f）大脑皮层和海马区
Aβ 免疫阳性神经元细胞数降低较为明显。 且呈现
一定量效关系，钩藤碱高剂量组（图 2f、图 3f）较钩藤
碱低剂量组（图 2d、图 3d）降低更为明显。与 SAMP8组
相比，石杉碱甲阳性药对照组（图 2c、图 3c）也具有较
明显的降低效应。但石杉碱甲阳性药对照组与钩藤碱
各剂量组数据间差异不显著。
3.3 免疫组织化学染色结果
由表 3可见，SAMR1对照组大脑皮层 Aβ 平均光
密度值和免疫阳性神经元细胞数分别为（0.234±0.042）
和（6.95±2.62）（表 3）。而对应的，SAMP8组皮层 Aβ平
均光密度值和免疫阳性神经元细胞数分别为（0.326±
0.094） 和（69.91±9.31），显示 SAMP8组大脑皮层淀粉
样蛋白平均光密度以及免疫阳性神经元数均较正常
老化小白鼠（SAMR1）组升高。类似的现象也可以在海
马区观察到，SAMP8 组海马区 Aβ 平均光密度值和免
疫阳性神经元细胞数均较 SAMR1 对照组升高明显
（表 3），差异有统计学意义（P<0.05）。
与此同时，与快速老化痴呆型小白鼠组相比，hu-
perzine A 阳性对照组和钩藤碱各用药组的小鼠脑部
平均光密度和免疫阳性神经元细胞数降低明显。表明
钩藤提取物：钩藤碱能较好地减少淀粉样蛋白 Aβ 的
平均光密度和阳性细胞数。 如钩藤碱中剂量组：海马
区 Aβ平均光密度值为（0.144±0.061）（表 3），与SAMP8
组对应值（0.232±0.048）相比明显降低，低剂量组、高
剂量组也可以观察到类似现象，显示钩藤碱对于减小
Aβ平均光密度值和阳性细胞数具有较好效果。
3.4 钩藤碱对 BACE、AβPP基因表达影响研究
如图 4 所示，脑内 β 位点 APP 裂解酶（BACE）、
β-淀粉样蛋白前体（AβPP）及淀粉样蛋白（Aβ）的 PCR
扩增产物在 156 bp、468 bp 和 300 bp 上下观察到较
为明晰的目的基因以及内参基因扩增带，并与初始设
计的 PCR扩增长度吻合，且未观察到其他 PCR扩增产
物。 经分析比对，与快速老化痴呆型小白鼠（SAMP8）
组相比，钩藤碱组的 β 位点 APP 裂解酶（BACE）、β-
淀粉样蛋白前体（AβPP）基因表达水平降低明显（P<
0.05）。例如，钩藤碱高剂量组：AβPP mRNA表达值为
（84.00±5.03）（表 4），与 SAMP8组对应值（110.11±30.51）
17
·论 著· 中国现代医生 2016 年 2 月第 54 卷第 6 期
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（表 4）相比明显降低；钩藤碱低剂量组、钩藤碱中剂
量组也可以观察到类似趋势。 此外， 与 SAMP8 组相
比，钩藤碱各组 BACE mRNA 表达也有明显下降（P<
0.05，表 4），以上效应均呈现一定的量效关系，显示钩
藤碱能减少或抑制 Aβ 的过度产生，从而改善快速老
化痴呆模型小白鼠 SAMP8的学习记忆能力。
综上所述，钩藤碱对快速老化小白鼠脑组织脑内
β 位点 APP 裂解酶、β-淀粉样蛋白前体及淀粉样蛋
白沉积表达有明显的抑制作用，提示钩藤碱改善快速
老化小白鼠的学习记忆力的作用机制是通过调节 Aβ
通路的表达等途径，我们期待本研究对未来阿尔茨海
默症的治疗可以扮演重要角色。
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（收稿日期：2015-11-13）
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