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拳参乙醇提取物和水提取物体外抗菌和抗氧化活性



全 文 :吴璐璐,许剑锋,赵 勇. 拳参乙醇提取物和水提取物体外抗菌和抗氧化活性[J]. 江苏农业科学,2013,41(5) :246 - 249.
拳参乙醇提取物和水提取物体外抗菌和抗氧化活性
吴璐璐,许剑锋,赵 勇
(上海海洋大学食品学院 /上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306)
摘要:为了了解拳参是否可以替代现有食品抗菌剂和抗氧化剂,通过滤纸片法测定拳参乙醇提取物和水提取物
(简称醇提物和水提物)的抑菌效果,同时用清除 DPPH自由基、ABTS自由基和 FRAP法对拳参醇提物和水提物的体
外总抗氧化活性进行评价,并与水溶性维生素 E 和二叔丁基羟基甲苯(BHT)进行比较。结果表明,拳参醇提物和水
提物都有较广的抑菌范围;醇提物和水提物都具有较好的抗氧化活性,其中醇提物的抗氧化活性与同浓度的水溶性维
生素 E相当,而水提物的抗氧化活性略差,但两者都比 BHT溶液的抗氧化活性略强。说明拳参醇提物和水提物具有
一定的抗菌抗氧化活性,对于天然食品防腐抗氧化剂的开发具有一定的意义。
关键词:拳参;DPPH自由基;ABTS自由基;FRAP;抗氧化活性
中图分类号:Q946 - 33 文献标志码:A 文章编号:1002 - 1302(2013)05 - 0246 - 03
收稿日期:2012 - 10 - 10
基金项目:上海市科委工程中心建设项目(编号:11DZ2280300) ;上
海市教育委员会重点学科建设项目(编号:J50704)。
作者简介:吴璐璐(1987—) ,女,江苏太仓人,硕士研究生,研究方向
为食品微生物。E - mail:wlljpc@ 163. com。
通信作者:许剑锋,博士,副教授,硕士生导师,主要研究方向海洋天
然药物。E - mail:jfxu@ shou. edu. cn。
随着生活水平的提高,食品的质量与安全问题愈来愈受
到人们的关注。通常食品变质有 2 种情况,一种是食品在适
合微生物生长的环境和条件下,因微生物迅速生长繁殖而导
致食品腐败变质,并产生有毒物质;另一种是食品被氧化变
质,主要是食品受空气、光线和热的影响而氧化,从而影响食
物品质并产生有毒物质。为了提高食品的抗菌、抗氧化性能,
在加工食品的过程中,必要时须要添加防腐保鲜剂[1]。众所
周知,食品行业的添加剂大多数是工业合成的化学物质,动物
试验表明,人工合成的食品添加剂可能对人身体产生一定的
毒副作用[2 - 3],因此开发高效、安全、天然的食品防腐抗氧化
剂是当今食品行业的必然趋势。
拳参为蓼科蓼属植物拳参(Polygonum bistorta L.)的根
茎[4]。常星等研究发现,拳参甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物
的抗氧化活性高于食品行业中常用的抗氧化剂二叔丁基羟基
甲苯(BHT)[5]。而刘春棋等研究发现,拳参提取物对金黄色葡
萄球菌、大肠杆菌和痢疾杆菌具有一定的抑制作用[6]。国内外
学者对于拳参乙醇提取物和水提取物(简称醇提物和水提物)
的研究相对较少,并且乙醇提取法和水溶液提取法是食品行业
中相对安全的提取方法,因此研究拳参醇提物和水提物的抗菌
和抗氧化特性对天然食品防腐剂的开发具有重要意义。
本研究旨在体外测定拳参醇提物和水提物的抗菌和抗氧
化活性,为开发拳参醇提物和水提物作为天然的食品防腐剂
提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器
中药拳参,购自上海同济大药堂;乙醇、没食子酸、福林 -
酚试剂、硫代硫酸钠、冰乙酸、浓盐酸、三水合乙酸钠、无水碳
酸钠、三氯化铁、过二硫酸钾均为分析纯,购自国药集团化学
试剂有限公司;二苯代苦味酰基(DPPH)自由基、水溶性维生
素 E均为分析纯,购自梯希爱化学工业发展有限公司;2,2 -
连氨 -(3 -乙基苯并噻唑啉 - 6 -磺酸)二氨盐(ABTS)、三
吡啶三吖嗪(TPTZ)均为分析纯,购自上海源叶生物科技有限
公司。
供试菌种包括大肠杆菌(Escherichia coli ATCC25922)、金
黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)、副溶血性
弧菌(Vibrio parahaemolyticus ATCC17802)、单增李斯特氏菌
(Listeria monocytogenes ATCC19115)、蜡样芽孢杆菌(实验室
分离)。
紫外可见分光光度计 UV1102,上海美谱仪器有限公司;
数显恒温水浴锅 HH -2,国华电器有限公司;R - 205 型旋转
蒸发器,上海申顺生物科技有限公司;DHG - 9243BS -Ⅲ电
热恒温鼓风干燥箱,上海新苗医疗器械制造有限公司。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 拳参醇提物和水提物的制备 称取 200 g 拳参药材,
粉碎后放入 500 mL回流瓶中,加 200 mL 95%乙醇后于 80 ℃
下回流煮沸 5 h;倒出提取液后,再加入 200 mL 95%乙醇回流
煮沸 5 h,合并提取液。取合并后的粗提液,减压抽滤,倒入旋
转蒸发瓶中,65 ℃减压旋转蒸发除去溶剂后得到提取的膏状
物质。拳参水提法与醇提法步骤相同,溶剂为 200 mL去离子
水。
1. 2. 2 拳参醇提物和水提物的抑菌活性 参照 Chan等的方
法[7]测定抑菌圈直径,但略有改动。将均匀涂菌后的平板置
于 37 ℃或 30 ℃恒温培养箱中 5 min,使表面干燥,用无菌镊
子将滤纸片贴在培养基表面,轻压纸片以确保接触良好,然后
吸取 10 μL 0. 001 g /mL 样品溶液于滤纸表面并作标记,以
10 μL 0. 001 g /mL山梨酸钾的滤纸片作为对照,试验步骤同
样品溶液。37 ℃ 恒温倒置培养 18 ~ 24 h,观察抑菌圈大小
并测定其直径。
1. 2. 3 多酚含量的测定 没食子酸标准曲线的绘制参考黄
—642— 江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 5 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2013.05.032
树苹等的方法[8],但略有改动。得没食子酸回归方程为 y =
0. 005 2x + 0. 012 4,r2 = 0. 997。
多酚含量测定:配置不同浓度的样品溶液,按上述标准曲
线测定方法测定拳参多酚含量,试验重复 3 次,最后代入标准
曲线计算各样品的多酚含量(mg /g) ,表示为 1 g 提取物中多
酚的量(mg)等同于没食子酸的量,试验重复 3 次。
1. 2. 4 DPPH自由基清除能力的测定 参照 Thaipong 等的
方法[9]测定 DPPH自由基清除率,但略有改动。具体试验方
法如下:取 0. 2 mL不同浓度的样液,加入 7. 8 mL 吸光度为
0. 7 ± 0. 02 的 DPPH自由基标准液(现用现配) ,以甲醇替代
样液作为空白对照。反应 30 min 后,将混合溶液摇匀,用比
色皿在 515 nm波长处测定不同浓度的吸光度,对照公式(1)
计算各样品的 DPPH自由基清除率。且以水溶性维生素 E溶
液作标准曲线,计算样品溶液 DPPH 自由基清除率相当于水
溶性维生素 E的量(μmol /g) ,试验重复 3 次。
DPPH自由基清除率 =(1 -
Ds
Dc
)× 100% (1)
式中:Ds 为样品溶液清除 DPPH·后的吸光度;Dc 为空白对
照所测定的吸光度。
1. 2. 5 ABTS自由基清除能力的测定 参照 Deepika 等的方
法[10]测定 ABTS自由基清除率,并略有改动。配置完 ABTS
工作液后,取 150 μL 不同浓度的样品溶液和 4 850 μL 吸光
度为(0. 70 ± 0. 02)的 ABTS 自由基工作液,以纯甲醇为空白
对照,反应 1 h 后,测定其在 734 nm 处的吸光度,对照公式
(2)计算各样品的 ABTS自由基清除率,以水溶性维生素 E溶
液作标准曲线,计算样品溶液 ABTS 自由基清除率性相当于
水溶性维生素 E的量(μmol /g) ,重复 3 次。
ABTS自由基清除率 =(1 -
Ds
Dc
)× 100% (2)
式中:Ds 为样品溶液清除 DPPH·的吸光度;Dc 为空白对照
所测定的吸光度。
1. 2. 6 铁离子还原抗氧化能力(FRAP)测定 参照 Re 等的
方法[11]进行测定,但略有改动。取不同浓度的样品溶液
150 μL,加入 4 850 μL TPTZ 工作液,于 35 ℃水浴中反应 30
min,再于 593 nm 波长处测吸光度;并且以水溶性维生素 E
溶液作标准曲线,FRAP 法抗氧化活性表示为相当于水溶性
维生素 E的量(μmol /g) ,重复 3 次。
2 结果与分析
2. 1 拳参醇提物和水提物的抑菌活性
表 1 为拳参醇提物和水提物对 5 种食品常见致病菌的抑
菌圈净直径(溶液抑菌圈直径与溶剂抑菌圈直径之差)。3 种
溶液对大肠杆菌的抑菌圈净直径大小为:拳参醇提物 >拳参
水提物 >山梨酸钾;对金黄色葡萄球菌的抑菌圈净直径大小
为:山梨酸钾 <拳参醇提物 <拳参水提物;对蜡样芽孢杆菌的
抑菌圈净直径大小为:拳参醇提物 <拳参水提物 <山梨酸钾;
对单增李斯特氏菌的抑菌圈净直径大小为:拳参水提物 <拳
参醇提物 <山梨酸钾;对副溶血性弧菌的抑菌圈净直径大小
为拳参醇提物 <拳参水提物 <山梨酸钾。
2. 2 拳参醇提物和水提物的多酚含量与抗氧化活性
由表 2 可以看出,总体上来说,拳参醇提物的抗氧化活性
表 1 拳参醇提物和拳参水提物抑菌圈净直径
提取物
抑菌圈净直径(mm)
大肠
杆菌
金黄色
葡萄球菌
蜡样芽
孢杆菌
单增李
斯特氏菌
副溶血
性弧菌
0. 001 g /mL拳参水提物 4. 1 14. 1 7. 1 0. 1 2. 0
0. 001 g /mL拳参醇提物 4. 5 4. 9 1. 3 0. 3 0. 1
0. 001 g /mL山梨酸钾 2. 6 2. 6 7. 3 0. 6 2. 1
强于拳参水提物。拳参醇提物的多酚含量是拳参水提物的
15. 7 倍,拳参醇提物 DPPH 自由基清除率是其水提物的 1. 5
倍,拳参醇提物 ABTS自由基清除率是其水提物的 1. 8 倍,拳
参醇提物铁离子还原能力是其水提物的 1. 3 倍。
表 2 拳参醇提物和水提物的多酚含量与抗氧化活性
拳参
提取物
多酚含量
(mg /g)
清除率(μmol /g)
DPPH ABTS FRAP
醇提物 243 146 ± 18 433 13 930 ± 510 4 326 ± 410 3 651 ± 118
水提物 15 513 ± 786 9 034 ± 186 2 386 ± 260 2 735 ± 31
2. 3 DPPH自由基清除率试验结果
图 1 为拳参醇提物、拳参水提物、BHT 溶液、水溶性维生
素 E溶液样品含量与 DPPH自由基清除率的线性关系。4 种
样品对 DPPH自由基的清除率与样品含量呈显著正相关,拳
参醇提物样品含量与 DPPH自由基清除率的线性关系为 y =
15. 2x + 0. 067 6(r2 = 0. 973) ;拳参水提物的清除率线性关系
为 y = 10. 5x + 0. 035 8(r2 = 0. 987) ;BHT 溶液的清除率线性
关系为 y = 11. 083x + 0. 105(r2 = 0. 956) ;水溶性维生素 E 溶
液的清除率线性关系为 y = 47. 8x + 0. 029 3(r2 = 0. 988) ;但
四者的清除效率不同,即水溶性维生素 E 溶液 > 拳参醇提
物 > BHT溶液 >拳参水提物。
2. 4 ABTS自由基清除率试验结果
图 2 为拳参醇提物、拳参水提物、BHT 溶液、水溶性维生
素 E溶液样品含量与 ABTS自由基的清除率线性关系。4 种
样品对 ABTS自由基的清除率与样品含量显著正相关性,即
拳参醇提物样品含量与 ABTS 自由基清除率的线性关系为
y = 25. 2x + 0. 082 4(r2 = 0. 968) ;拳参水提物的清除率线性关
系为 y = 29. 5x + 0. 020 9(r2 = 0. 991) ;BHT 溶液的线性关系
为 y = 10. 268x + 0. 03(r2 = 0. 983) ;水溶性维生素 E 溶液的
线性关系为 y = 29. 5x + 0. 020 9(r2 = 0. 991) ;但其清除效率
不同,即水溶性维生素E溶液 > 拳参醇提物 > 拳参水提
—742—吴璐璐等:拳参乙醇提取物和水提取物体外抗菌和抗氧化活性
物 > BHT溶液。
2. 5 铁离子还原抗氧化能力( FRAP) 试验结果
图 3 为拳参醇提物、拳参水提物、BHT 溶液、水溶性维生
素 E溶液样品含量与铁离子还原能力的线性关系。4 种样品
的铁离子还原能力与样品含量显著正相关,拳参醇提物的样
品含量与铁离子还原能力的线性关系为 y = 21. 938x - 0. 014 9
(r2 = 0. 997) ;拳参水提物的铁离子还原能力线性关系为 y =
16. 614x - 0. 011(r2 = 0. 995) ;BHT 溶液的线性关系为 y =
7. 857x + 0. 006 5(r2 = 0. 998) ;水溶性维生素 E 溶液的线性
关系为 y = 23. 062x + 0. 001 6(r2 = 0. 991)。4 种样品溶液铁
离子还原能力依次为:水溶性维生素 E 溶液 >拳参醇提物 >
拳参水提物 > BHT溶液。
3 结论与讨论
3. 1 拳参醇提物和水提物的抗菌活性
拳参醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆
菌、单增李斯特氏菌均有一定的抑制作用,而对副溶血性弧菌
没有抑制作用。其中醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的
抑菌圈净直径值远大于同浓度的山梨酸钾,说明醇提物对这
2 种菌的抑制作用强于山梨酸钾;醇提物对蜡样芽孢杆菌的
抑菌圈直径值比山梨酸钾小很多,说明山梨酸钾对蜡样芽孢
杆菌的抑制作用强于醇提物;醇提物和山梨酸钾对单增李斯
特氏菌的抑菌圈净直径均很小,说明醇提物和山梨酸钾对单
增李斯特氏菌几乎没有抑制作用;醇提物对副溶血性弧菌的
抑菌圈也极小,说明拳参醇提物对其几乎没有抑制作用。
拳参水提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆
菌、副溶血性弧菌均有一定的抑制作用,而对单增李斯特氏菌
几乎没有抑制作用。其中水提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球
菌的抑菌圈净直径远大于山梨酸钾,说明水提物对这 2 种菌
的抑制作用强于同浓度的山梨酸钾溶液;水提物对蜡样芽孢
杆菌、副溶血性弧菌的抑菌圈净直径与山梨酸钾接近,说明同
浓度的水提物和山梨酸钾溶液的对这 2 种菌抑制作用相当;
水提物对单增李斯特氏菌的抑菌圈净直径很小,说明水提物
对其几乎没有抑制作用。
总体来说,拳参醇提物和水提物都具有较广的抑菌范围。
同浓度的拳参醇提物、拳参水提物和山梨酸钾溶液对食品中
最为常见食源性致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢
杆菌都有较好的抑制效果,这与刘春棋等的结果[6]相吻合;
三者对肉类食品中常见的单增李斯特氏菌的抑制作用都比较
弱,水提物对水产品中常见致病菌副溶血性弧菌有较好抑菌
活性,而醇提物对其几乎没有抑制作用。
3. 2 拳参醇提物和水提物的抗氧化活性
DPPH法测定结果表明,对自由基的清除能力大小为水
溶性维生素 E溶液 >拳参醇提物 > BHT溶液 >拳参水提物;
ABTS 法测定结果表明,对自由基的清除能力大小为水溶性
维生素 E溶液 >拳参醇提物 >拳参水提物 > BHT溶液,其中
拳参醇提物对自由基的清除效果与水溶性维生素 E 接近;
FRAP法测定结果表明,4 种物质对铁离子还原能力大小为水
溶性维生素 E溶液 >拳参醇提物 >拳参水提物 > BHT 溶液,
其中拳参醇提物对铁离子还原能力与水溶性维生素 E 接近。
各种方法所测定的结果基本一致,但 DPPH 法与其他结果略
微不同,这可能与 3 种方法的抗氧化机制不同有关,但是不影
响总体结果。
水溶性维生素 E为生物体内重要的抗氧化剂 α -生育酚
的衍生物,具有很高的抗氧化活性[12];BHT 为食品中最常用
的抗氧化剂,也具有抗氧化活性[13]。总体来说,拳参醇提物
的抗氧化活性比水溶性维生素 E 略低,部分原因可能是拳参
醇提物多酚类物质含量高,但 2 种提取物的抗氧化活性均比
BHT强。
拳参醇提物和水提物都具有较广的抑菌范围。拳参醇提
物和水提都具有一定的抗氧化活性,其中醇提物的抗氧化活
性与水溶性维生素 E 相当,而水提物的抗氧化活性略差,但
是比 BHT高。拳参醇提物和水提物虽都具有较高的抗菌和
抗氧化活性,但两者均为混合物,其作用物质和机制尚待进一
步研究。
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潘训海,刘新露,罗惠波,等. 桑葚果酒酵母的分离及筛选[J]. 江苏农业科学,2013,41(5) :249 - 251.
桑葚果酒酵母的分离及筛选
潘训海1,刘新露2,罗惠波1,卫春会1
(1.四川理工学院生物工程学院 /酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡 643000;
2.四川理工学院化学与制药工程学院,四川自贡 643000)
摘要:以桑葚果汁自然发酵液和桑果园土壤为分离源,从中分离筛选桑葚果酒酵母,将筛选得到的酵母与对照酵
母进行发酵对比研究,进一步确定桑葚果酒酿酒优良菌种,并将筛选得到的酵母进行生产中试。结果表明:从分离源
中分离得到 12 株酵母菌,经过初筛、复筛,获得 1 株比较适宜酿造桑葚果酒的酵母菌(SY - 2) ,该菌种具有起酵快、发
酵过程缓和、产香好等优异特征,通过生产中试,制得紫红色、澄清透明、香气协调、柔和爽口的优质桑葚果酒,从而确
定该菌株可作为桑葚果酒生产用酵母。
关键词:桑葚果酒;酵母;筛选
中图分类号:TS261. 1 文献标志码:A 文章编号:1002 - 1302(2013)05 - 0249 - 03
收稿日期:2012 - 12 - 28
基金项目:四川省重点技术创新项目(企业技术创新专项) (编号:
2011NCLZ433)。
作者简介:潘训海(1980—) ,男,重庆忠县人,讲师,硕士,主要从事发
酵工程方面的研究。E - mail:panxh2000@ 163. com。
桑葚又叫桑果,为桑科落叶乔木桑树的果实,成熟的桑葚
甘甜多汁、酸甜适口、风味独特[1]。桑葚富含多种营养成分
及黄酮类化合物,具有滋阴补血、保肝护肾、润肠通便、增强免
疫力及促进新陈代谢等功效[2 - 4],已被我国卫生部列入“既是
食品又是药品”的名单中[5]。
桑葚酒历史悠久,根据生产工艺不同可以分为发酵酒和
配制酒 2 种[6]。桑葚发酵酒是以成熟的桑果为原料,经榨汁、
调整成分后加入活性酵母精心酿制而成的果酒。桑葚酒营养
保健价值高,具有很高的开发利用价值。我国是丝绸之国,种
桑养蚕历史悠久,桑树种类及桑葚产量均位居世界首位,全国
各地均有栽培,资源十分丰富。开发桑葚果酒是果桑资源综
合利用的一个重要领域,可以增加桑农收入,具有良好的社会
效益和经济效益。果酒生产中菌种是影响果酒品质的关键因
素之一[7],目前多数果酒生产菌种采用葡萄酒酿酒酵母,尚
缺乏桑葚酿酒专用酵母。本试验从自然环境中分离、筛选桑
葚酿酒酵母,并在四川省阆州圣果酒业有限公司进行生产中
试,期望得到适合桑葚果酒生产用的优良酵母。
1 材料与方法
1. 1 材料
新鲜桑葚:购于农贸市场(四川自贡产) ;干桑葚:四川省
阆州圣果酒业有限公司提供;对照菌种:高活性葡萄酒酵母
(实验室保存)。
1. 2 试剂与仪器
1. 2. 1 试剂 柠檬酸(上海试剂一厂产品,分析纯) ;偏重亚
硫酸钾(上海试剂四厂产品,分析纯) ;其他试剂均为分析纯。
1. 2. 2 培养基 麦芽汁琼脂培养基[8]
1. 2. 3 仪器 手持糖量计:成都格纳丝商贸有限公司生产;
蒸汽灭菌锅:上海三申医疗器械有限公司生产;AR1140 电子
分析大平:奥克斯国际贸易有限公司生产;酸度计:热电(上
海)仪器有限公司生产;722S 型分光光度计:上海精密科学
仪器有限公司生产;榨汁机:广州旭众有限公司生产;HH - 6
电热数显恒温水浴锅:江苏金坛市医疗器械厂生产;
OLYMPUS CX21 生物显微镜:南京麦迪森仪器有限公司生
产;LRH - 250 生化培养箱:上海齐欣科学仪器有限公司生
产;生产中试设备:四川省阆州圣果酒业有限公司提供。
1. 3 方法
1. 3. 1 桑葚果汁的制备 选取新鲜成熟桑葚,榨取果汁,在
桑葚汁中加蔗糖调糖度至 15%,用柠檬酸调节 pH 值至 4. 0,
然后添加 K2S2O5 使有效 SO2 含量达到 70 mg /L。
—942—江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 5 期