全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY分析检测 2015年 第40卷 第07期
· 314 ·
收稿日期：2015-01-21 *通讯作者
基金项目：国家自然科学基金项目(51262031，51462036)；云南省绿色化学与功能材料研究创新团队项目(2011HC008)；云南省高校绿色化
学新能源与材料科技创新团队项目(2011UYN09)。
作者简介：白红丽(1962—)，女(哈尼族)，副研究馆员，研究方向为生物无机化学和锂离子电池正极材料研究。
白红丽1,2，焦立响2，李文娟2，黄相中2，郭俊明2*
(1.云南民族大学图书馆，昆明 650500；
2.云南民族大学民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室，昆明 650500)
摘要：采用HPLC法研究了不同溶剂对云南青牛胆提取物清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)
自由基测定的方法。实验结果表明，云南青牛胆提取物具有良好的自由基清除能力，其顺序
为：乙醇>乙酸乙酯>正丁醇>丙酮。其中，乙醇提取物(IC50为0.69 mg/mL)的清除能力最大，除
丙酮提取物(IC50为1.93 mg/mL)外，其他提取物的自由基清除能力均大于香草酸(IC50为1.82 mg/
mL)的清除能力；相关分析结果表明，各提取物在一定浓度范围内与自由基清除率呈现良好的
线性关系，DPPH自由基浓度c在0.1~1.0 mg/mL的浓度范围内与峰面积A呈线性相关，A=11146c-
1083.3，r=0.9991。
关键词：云南青牛胆；DPPH自由基；HPLC；抗氧化活性
中图分类号：O 657.7 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2015)07-0314-04
DPPH radical scavenging activity of the extract from Tinospora
sagittata var. yunnanensis
BAI Hong-li1,2, JIAO Li-xiang2, LI Wen-juan2, HUANG Xiang-zhong2, GUO Jun-ming2*
(1.Yunnan Minzu University Library, Kunming 650500; 2.Key Laboratory of Chemistry in
Ethnic Medicinal Resources, State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education,
Yunnan Minzu University, Kunming 650500)
Abstract: DPPH (1,1-pheny-2-picrylhydrazyl) radical scavenging activities of the extracts of Tinospora
sagittata var. yunnanensis in different solvent were analyzed by HPLC methods. The experimental
results showd that the extracts have a good ability of DPPH radical scavenging activities, and the order is
ethanol>ethyl acetate>n-buoh>acetone. Among them, the ethanol extract (IC50 was 0.69 mg/mL) removal
capacity is the largest, in addition to the acetone extracts (IC50 was 1.93 mg/mL), the DPPH radical
scavenging capacity of other extract is greater than the vanillic acid (IC50 was 1.82 mg/mL). There are good
linear relationships between the extracts in the certain concentration range and scavenging free radicals.
Similarly, the mass concentration of DPPH radical in the range of 0.1~1.0 mg/mL and the peak area also
has a good linear relationship, the regression equation and the correlation coeffi cient is A=11146C-1083.3
HPLC法测定云南青牛胆清除DPPH
自由基活性能力
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2015.07.068
食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 分析检测2015年 第40卷 第07期
· 315 ·
云南青牛胆(T i n o s p o r a s a g i t t a t a v a r .
yunnanensis(S.Y.Hu)H.S.Lo)系防己科青牛胆属植
物，为一变种。该属植物全世界约34种，我国有6
个种2个变种，集中分布在西南和南部各省区[1]。
民间以其块根入药，有清热解毒、止痛、利咽之
功效[2]。青牛胆属植物的药理活性主要有抗炎镇痛
活性[3]、抗过敏活性、抗应激活性、免疫调节作
用、抗高血糖作用、抑菌作用[4]、抗肿瘤活性、抗
溃疡活性、保肝等作用，同时也具有一定的抗氧
化活性[5-7]，而对云南青牛胆的抗氧化性研究未见
报道。
目前测定植物抗氧化活性的方法主要有分光
光度法[8-10]和HPLC法[11-14]等。采用HPLC法评价清
除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的原理
是利用DPPH自由基在517 nm下有吸收峰，而当有
自由基清除剂存在时，清除剂会与DPPH自由基单
电子配对从而使其在此波长下的吸收峰减弱甚至
消失，表现为HPLC图谱上峰面积的减少，在一定
的范围内其峰值减少程度与其接受的电子数有定
量关系，抗氧化能力可以通过DPPH被清除的量来
评价。本文采用HPLC法研究了云南青牛胆提取物
清除DPPH自由基的能力，以期为评估云南青牛胆
的药效提供一定的指导价值。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
云南青牛胆：经云南大学生物系马绍宾教
师鉴定为(Tinospora sagittata(Oliv.)Gagnep.var·
yunnanensis(S.Y.Hu)Lo)，烘干，粉碎，过筛备用；
DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，纯度>99.0%)：
梯希爱上海化成工业发展有限公司；甲醇(分析
纯，色谱纯)；二次去离子水；其他化学试剂均为
分析纯。
Agilent1200高效液相色谱仪：包括四元泵，
自动进样器，二极管阵列检测器DAD，柱温箱，
Che-mstation色谱工作站；色谱柱Agilent Eclipse
XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)。
1.2 样品的配制
1.2.1 样品储备液的配制 按照文献[15]的方法配
制样品储备液：分别称取青牛胆粉末50 g分别用乙
醇、丙酮室温浸提，得到乙醇、丙酮萃取部分；
乙醇提取浸膏分别用乙酸乙酯、正丁醇进行萃
取，得到乙酸乙酯、正丁醇萃取部分的样品。
准确称取DPPH标准品3.0 mg，用甲醇定容至
10 mL容量瓶，浓度为0.30 mg/mL。香草酸配制成5
mg/mL的溶液、乙醇提取样品配制成3 mg/mL的溶
液，其余各个萃取样品均配制成6 mg/mL的溶液。
样品均用甲醇溶解。
1.2.2 供试溶液的配制 准确吸取100 μL的甲醇与
100 μL的DPPH储备液，混匀后为空白溶液，每
次进样前重新配制。
准确吸取25、50、75、100 μL的样品溶液分
别与100 μL的DPPH储备液混匀；并补加乙醇至
200 μL，置于黑暗处，室温下反应30 min。
1.3 HPLC法色谱条件
色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150
mm，5 μm)，流速为1.0 mL/min，检测波长517
nm，柱温箱温度为25 ℃，进样体积20.0 μL，流
动相见表1。
表1 流动相梯度
时间/min 二次去离子水/% 甲醇/%
0 50 50
10 20 80
18 20 80
18.1 50 50
2 结果与分析
2.1 清除DPPH自由基能力的计算
将供试品溶液置于HPLC中，在1.3色谱条件
下分别记录空白的DPPH的峰面积PA空白、样品的
DPPH的峰面积PA样品，色谱图见图1，空白溶液的
出峰时间为14.199 min、乙醇提取物的出峰时间
14.169 min，并按下式计算样品的清除能力[11]。
清除能力(%)=(PA空白-PA样品)/PA空白×100
标准品香草酸及各个萃取部分样品的IC50见表
2。结果显示云南青牛胆对DPPH自由基有较好的
清除能力，尤其是乙醇和乙酸乙酯萃取物具有良
好的抗氧化能力，丙酮萃取物抗氧化能力稍差。
and 0.9991, respectively.
Key words: Tinospora sagittata var. yunnanensis; DPPH radical; HPLC; antioxidative activity
食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY分析检测 2015年 第40卷 第07期
· 316 ·
各溶剂萃取物抗氧化能力顺序为：乙醇>乙酸乙酯
>正丁醇>香草酸>丙酮。
表2 萃取物及标准品的清除自由基的能力
溶剂萃取物 IC50/(mg/mL)
乙醇萃取 0.69
乙酸乙酯萃取 0.88
正丁醇萃取 1.59
香草酸 1.82
丙酮萃取 1.93
高，乙酸乙酯提取物的抗氧化能力次之。乙醇提
取物浓度为0.36 mg/mL时，对DPPH自由基的清
除率为33.7%，而浓度为1.45 mg/mL时，其清除
率为73.4%，显示出乙醇提取物具有优良的抗氧
化活性。
各溶剂提取物与DPPH自由基清除率之间存
在着良好的剂量依赖关系，结果见表3(y为清除率
%；x为各组分的质量浓度mg/mL)。
表3 萃取物、标准品的线性回归方程、
相关系数及线性范围
溶剂萃取物 线性回归方程 相关系数/r 线性范围/(mg/mL)
乙醇萃取 y=46.617x+18.025 0.9935 0.4~1.0
乙酸乙酯萃取 y=31.947x+21.898 0.9996 0.6~2.0
香草酸 y=23.226x+7.7153 0.9953 0.5~3.0
正丁醇萃取 y=31.109x+0.3437 0.9969 0.8~2.5
丙酮萃取 y=24.574x+2.5838 0.9999 0.8~2.5
2.3 DPPH线性范围的考察
准确称取50.0 mg的DPPH标准品，用甲醇定
容至10 mL容量瓶，为DPPH储备液。将DPPH储备
液分别稀释5、20、25、50倍，将稀释好的DPPH
标准溶液，在1.3所述色谱条件下，进行HPLC分
析，色谱图见图1(a)。分别以各标准溶液浓度C与
其对应的峰面积A进行线性回归，其线性回归方
程及相关系数为：A=11146C-1083.3，r=0.9991，
其DPPH浓度范围为0.1~1.0 mg/mL，其标准曲线
见图3。
图1 空白溶液(a)和乙醇提取物(b)的HPLC图
图2 不同浓度的萃取物溶液对DPPH自由基清除能力的
影响
          









N

6
ᬢ䬠NJO

          









N

6

ᬢ䬠NJO
B
C
        









΅䚳᣼ं➕
₏̭䚳㤯ं➕
΅䚤΅䚛㤯ं➕
ͅ䚚㤯ं➕
仅㡵䚤





⌱
䮐
⢳

≿Ꮢ NHN-
2.2 浓度对清除能力的影响
不同浓度提取物对DPPH自由基清除能力见图
2。从图2可见，随着各溶剂提取物浓度增加，其
抗氧化能力均呈线性增加。在各提取物浓度较低
(<1.45 mg/mL)时，以乙醇提取物的抗氧化能力最
图3 DPPH标准曲线图


     







≿Ꮢ NHN-
2.4 DPPH稳定性的考察
将DPPH配制成0.30 mg/mL的供试品溶液，每
隔1 h进样一次，记录色谱峰的峰面积，结果见表
4，计算色谱峰峰面积的RSD，在5 h内DPPH的峰
面积RSD值为0.49%，大于5 h DPPH的峰面积RSD
值为3.26%。实验结果证明DPPH用HPLC法测定，
在5 h内稳定。
食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 分析检测2015年 第40卷 第07期
· 317 ·
地对云南青牛胆的抗氧化能力做了评价，为评估
云南青牛胆的药效提供有一定的指导价值。
参考文献：
[1]　罗献瑞,赵素云.中国防巳科资料[J].广西植物,1986,6(1-
2):49-61
[2]　江苏新医学院.中药大辞典(上册)[M].上海:上海科学技术
出版社,1986
[3]　王刚,凃自良,陈黎.金果榄抗炎作用的实验机制[J].时珍
国医药,2009,20(5):122-126
[4]　华娟,周明康,周琼珍,等.50种传统清热解毒药的抑菌实
验[J].中药材,1995,18(5):255-258
[5]　孟庆华,于晓霞,张海凤,等.天然黄酮类化合物清除自由
基机理及其应用进展[J].云南民族大学学报:自然科学版,
2012,21(2):79-83
[6]　Prince PS, Padmanabhan M, Menon VP. Restoration of
antioxidant defence by ethanolic Tinospora cordifolia root
extract in alloxan-induced diabetic liver and kidney[J].
Phytotherapy research,2004,18(9):785-787
[7]　Desai VR, Kamat JP, Sainis KB. An immunomaodulator from
Tinospora cordifolia w-ith antioxidant activity in cell-free
systems[J]. Proc.Indian Acad.Sci,2002,114(6):713-719
[8]　黄素梅,韦绍龙,韦弟,等.香蕉废弃物提取物的总酚含量
及其清除DPPH自由基能力[J].食品科技,2013,38(8):158-
162
[9]　王才立,张志国,王成忠,等.不同分子质量小麦胚芽多肽
的体内抗氧化活性[J].食品科学,2013,34(7):275-378
[10]　刘萍,高云涛,张丽珠,等.山奈酚清除DPPH自由基的新
型微量光度滴定方法研究[J].食品工业科技,2014,35(5):
53-57
[11]　Nitra Nuengchamnong, Kornkanok Ingkaninan. On-
line HPLC-MS-DPPH assay for the analysis of phenolic
antioxidant compounds in frui t wine: Antidesma
thwaitesianum Muell[J]. Food Chemistry,2010,118:147-
152
[12]　杨新周,郝志云,杨子仙,等.HPLC法研究肾叶山蚂蝗清
除DPPH自由基能力[J].分析试验室,2013,32(3):30-32
[13]　高翔,王燕,朱丹妮,等.HPLC在线检测消癌平注射液清
除ABTS·+活性[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(5):
54-57
[14]　Chandrasekar D, Madhusudhana K, Ramakrishna S, et al.
Determination of DPPH free radical scavenging activityby
reversed-phase HPLC: A sensitive screening method for
polyherbal formulations[J]. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis,2006,40:460-464
[15]　程春梅,戴云,黄相中,等.云南青牛胆块根的化学成分研
究[J].中草药,2010,41(5):689-692
2.5 DPPH重现性的考察
将DPPH配制成一定浓度的供试品溶液，每
次进样重新配制供试品，记录色谱峰的峰面积，
色谱峰峰面积的RSD值为1.33%。结果见表5，实
验结果证明DPPH用HPLC法测定，具有良好的重
现性。
表5 DPPH重现性实验结果
进样次数 DPPH峰面积A
1 2194.1
2 2259.9
3 2261.9
4 2263.8
5 2254.7
6 2209.1
平均值 2240.6
RSD/% 1.33
3 结论与讨论
本实验采用HPLC法通过对各个组分的清除
DPPH自由基的能力进行测定，表明云南青牛胆
的乙醇提取物具有良好的抗氧化活性，且各个
提取物组分与DPPH自由基清除率之间存在着剂
量依赖关系。乙醇、乙酸乙酯和正丁醇萃取物
的IC50(0.69、0.88、1.59 mg/mL)值均大于香草酸
的IC50(1.93 mg/mL)。近年来，随着对合成抗氧化
剂毒性的认识，寻找安全天然的抗氧化物质已成
为研究的一个重点。上述实验结果表明，云南青
牛胆具有一定的抗氧化活性，但是本实验只是评
价了云南青牛胆的乙醇粗提物的抗氧化活性。因
此，有必要将云南青牛胆乙醇粗提物进行单一化
合物的分离、纯化、鉴定，以期研究云南青牛胆
植物中具有抗氧化作用的化合物。从而更加全面
表4 DPPH的稳定性试验结果
进样时间/h DPPH峰面积A
1 3062.0
2 3103.7
3 3082.7
4 3077.3
5 3088.9
6 2867.4
5 h RSD/% 0.49
6 h RSD/% 3.26