全 文 ：基金项目:国家自然科学基金 (20772105, 21062027, 20502021);云南省应用基础研究基金 (2007C019M);云南省中青年学术技术带头人后
备人才基金 (2008PY028)
作者简介:苗翠苹 ,女 ,硕士 ,研究实习员　　研究方向:微生物学　　＊通讯作者:吴少华 , 女 , 研究员 , 硕士生导师　　研究方向:天然药物
化学　　Tel:(0871)5032423　　E-mail:shwu123@126.com
滇牡丹内生真菌的分离及其抑菌活性研究
苗翠苹1 ,余莹1 ,陈有为 1 ,王皎 1, 2 ,吴少华1＊(1.云南大学云南省微生物研究所,昆明 650091;2.云南中医学院中药学院 ,昆明 650500)
摘要:目的　研究滇牡丹内生真菌的种群组成及其代谢产物的抑菌活性 ,获得抗菌活性较好的菌株 , 以寻找新型抗菌物质。
方法　采用内生菌常规分离法对健康滇牡丹植株的根 、茎 、叶进行内生真菌的分离鉴定。以 11种指示菌 , 采用纸片扩散法对
分离获得的内生真菌进行抑菌活性实验。结果　从滇牡丹植物中分离到 81株内生真菌 ,经形态鉴定 , 分属于 19个属。抑菌
实验表明 , 有 46株内生真菌对至少 1种指示菌有抑制作用 , 占分离总菌株的 56.8%。结论　滇牡丹内生真菌中存在着丰富的
抗菌天然活性物质 , 可为寻找新型抗菌物质提供资源。
关键词:滇牡丹;内生真菌;抑菌活性
中图分类号:R282　　　文献标志码:A　　　文章编号:1001-2494(2011)10-0738-04
StudyonIsolationofEndophyticFungifromPaeoniadelavayiandTheirAntimicrobialActivity
MIAOCui-ping1 , YUYing1 , CHENYou-wei1 , WANGJiao1, 2 , WUShao-hua1＊(1.YunnanInstituteofMicrobiology,
YunnanUniversity, Kunming650091, China;2.SchoolofTCM, YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine, Kunming
650500, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　ToisolateendophyticfungifromPaeoniadelavayiandtoscreentheantimicrobialactivitiesofthesec-
ondarymetabolites.METHODS　Endophyticfungiwereisolatedfromtheroots, stemsandleavesofhealthyPaeoniadelavayiandi-
dentifiedbyconventionalmethod.Theantimicrobialactivitiesofendophyticfungiwerescreenedagainst11microbesbypaperdiscdif-
fusionmethod.RESULTS　Eighty-onestrainsofendophyticfungiwereisolatedfromPaeoniadelavayi.Theywereidentifiedtobelong
to19genera.Antimicrobialexperimentshowed46strains(56.8% ofthetotalstrainsisolated)wereactiveagainstoneormoreof11
pathogenicmicrobes.CONCLUSION　DiverseantimicrobialnaturalproductsexistinendophyticfungifromPaeoniadelavayi, which
canbetheresourcesfornewantimicrobialproducts.
KEYWORDS:Paeoniadelavayi;endophyticfungi;antimicrobialactivity
　　植物内生真菌是指在生活史的一定阶段或全部
阶段生活于健康植物组织内部或细胞间隙 ,不引起
植物表现出(至少暂时不表现出)明显病症的真菌 ,
并可通过组织学方法和严格地表面消毒从植物组织
中分离到或从植物组织内直接扩增出其 DNA的方
法来证明其内生 [ 1] 。植物内生真菌在植物组织中
普遍存在 ,并具有丰富的物种多样性 ,它们是一类相
对未开发的新资源 ,很有可能是新物种和新基因的
丰富资源 ,而新基因和新物种通常又意味着产生新的
天然产物 ,目前已经受到越来越多研究者的关注[ 2] 。
近年来的统计发现 ,分离自内生真菌的生物活性物质
有 51%是新的 ,而分离自土壤微生物的活性化合物
仅有 38%是新化合物 [ 3] ,因此植物内生真菌的代谢
产物极有可能成为发现生物活性物质的重要来源 ,在
医药 、农林业等领域具有潜在的应用前景。
滇牡丹(PaeoniadelavayiFranch.)又名野牡丹 ,
属芍药科芍药属牡丹组植物 ,为中国西南地区特有
种[ 4] ,其性寒 、味酸辛 ,根皮用于清热凉血 , 治吐血 、
尿血 、血痢 、痛经等 ,也被用作丹皮药用 ,可抑制中枢
神经系统 ,有扩张冠状血管 ,降压 、抑菌 、抗炎 、抗凝
血等功能 [ 5] 。目前尚未见国内外关于滇牡丹植物
内生真菌的研究报道。本实验以云南野生的滇牡丹
为材料 ,研究其内生真菌的种群组成及其代谢产物
的抑菌活性 ,以期获得具有良好抑菌活性的菌株 ,为
进一步寻找新型抑菌物质提供基础。
1　材　料
滇牡丹新鲜健康植株于 2007年 9月采集于云
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南省嵩明县 ,全株采样后立即用保鲜袋包好 ,置于保
温盒中带回实验室 , 24 h内处理样品 ,进行内生真
菌的分离。
分离采用 PDA培养基 (加 80 μg· mL-1青霉
素);鉴定采用 PDA、促孢培养基;发酵采用 PDB培
养基;细菌指示菌采用牛肉膏蛋白胨培养基 ,真菌指
示菌采用 PDA培养基。
供试指示菌由云南省微生物研究所提供 ,包括
3株细菌:白色葡萄球菌 Ym1029 (Staphylococcusal-
bus),伤寒沙门菌 Ym1043 (Salmonelatyphi),宋内
志贺菌 Ym1046 (Shigelasonnei);8株真菌:白色念
珠菌 Ym2005 (Candidaalbicans), 紧密单孢枝霉
Ym3077 (Hormodendrumcompactum),皮炎单孢枝霉
Ym3078 (Hormodendrum dermatitidis), 黑 曲 霉
Ym3029 (Aspergilusniger),灰葡萄孢 Ym3061 (Bot-
rytiscinerea),燕麦镰孢菌 Ym3065 (Fusariumavena-
ceum),岛青霉 Ym3104 (Peniciliumislandicum),玉
蜀黍长蠕孢 Ym3076 (Helminthosporiummaydis)。
2　方　法
2.1　内生真菌的分离和纯化
选取健康滇牡丹植株 ,用自来水冲洗干净晾干 。
截取叶 、根 、茎 3个部位分别用 0.1%升汞漂洗 10 ～
30 s,然后用无菌水冲洗 ,再用体积分数 75%酒精漂
洗 0.5 ～ 1 min,最后用无菌水冲洗数次 [ 6] 。样品经
处理完毕后 ,将在无菌状态下切成 0.2 cm×0.2 cm
长段(片),置于 PDA培养基平板上 ,每皿 7个样品 。
置于 28℃条件下培养 3 ～ 7d,观察皿中材料切口处
长出菌落 ,挑取切口处菌落边缘菌丝转接到新的
PDA平板上 ,经 2 ～ 3次纯化 ,得到内生真菌 。另把
最后一次冲洗的无菌水用无菌的涂布棒涂布在
PDA平板上 ,于 28 ℃恒温培养 ,以此作为对照组。
2.2　内生真菌的鉴定
采用直接挑取制片法和插片培养法 ,将分离得
到的内生真菌显微形态观察 ,根据其孢子形态 、产孢
结构等显微特征参照真菌分类文献 [ 7-8] 进行鉴定 。
不产孢的菌株采用促孢培养基培养 、紫外照射 、黑白
光线下交替培养等方法诱导 ,定期观察产孢情况 ,
产孢后按以上方法进行鉴定 ,非产孢内生真菌根据
有无菌核 、菌核特征 、菌丝结构 、菌落形态特征等指
标将其鉴定到属 。
2.3　代谢产物的制备
将活化的内生真菌菌种接种于装有 10mLPDB培
养基的小三角瓶中 ,置于 28 ℃、200r·min-1的摇床培
养 6d取出 ,加入 15 mL体积分数 95%乙醇 ,浸提 24
h,过滤 ,滤液浓缩 ,无菌水溶解 ,定容至 2mL备用。
2.4　抑菌实验
采用滤纸片扩散法 (直径 5mm)。在无菌操作
台上分别取指示菌悬液 0.2 mL,加入相对应的固体
培养基中 ,用涂布器均匀涂布至培养基表面 ,然后将
无菌滤纸片贴到平板内 ,吸取各内生真菌发酵提取物
20μL,每个样品做 3个重复。细菌置于 37 ℃,真菌
置于 28℃,培养 24h后 ,测定抑菌圈直径大小。
3　结果与分析
3.1　滇牡丹内生真菌的多样性分析
从滇牡丹植物茎 、叶 、根中共分离到 81株内生
真菌 ,经分类鉴定 ,分属于 5目 、7科 、19属 ,可见滇
牡丹植物内生真菌种类呈现丰富的多样性 ,优势最
明显的是毛壳菌属 Chaetomium(17.3%)和拟青霉
属 Paeculomyces(14.8%),见表 1。
滇牡丹不同部位内生真菌在数量 、种群组成以
及优势种群等方面均存在较大差异 ,尤其是根和茎
部的内生真菌在数量和种类上较为丰富 。从根部分
离到内生真菌 42株 ,分属于 13属 ,从茎中分离得到
内生真菌 25株 ,分属于 12属 ,从叶中分离得到内生
真菌 14株 ,分属于 9属 ,分别占滇牡丹内生真菌总
数的 51.8%、30.9%和 17.3%。种群在各个部位的
分布也存在一定差异 ,根部的优势种群最明显为拟
　　
表 1　滇牡丹内生真菌的种群组成
Tab.1　ThepopulationofendophyticfungifromPaeoniadela-
vayiFranch
Order Family Genus Number/DistributionStem Leaf Root
Moniliales Moniliaceae Paeculomyces 0 1 11
Trichoderma 4 0 2
Aspergilus 0 0 3
Cephalosporium 1 0 3
Penicilium 1 0 0
Humicola 0 0 1
Basipetospora 2 1 0
Dematiaceae Alternaria 3 1 1
Gilmaniela 0 0 2
Botryotrichun 0 1 0
Tuberculariaceae Fusarium 3 2 1
Mucorales Mucoraceae Rhizopus 1 0 0
Mucor 1 0 0
Sphaeriales Xylariaceae Xylaria 0 2 0
Chaetomiaceae Chaetomium 2 1 11
Sphaeropsidales Sphaeropsidaceae Pyrenochaeta 0 0 4
Agonomycetales Ectostroma 2 1 1
Ozonium 3 0 1
Phacodium 2 4 1
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青霉属和毛壳菌属 ,组丝核菌属在叶中占优势;毛壳
菌属 、组丝核菌属等 5个属内生真菌在根茎叶中均
有分布 ,而有些种群还存在器官专一性 ,如须壳孢属
和曲霉属只从根中分离到 。
3.2　内生真菌的抗菌活性及活性菌株的分布
将分离到的 81株滇牡丹内生真菌的代谢产物对
11种指示菌进行抑菌活性实验 ,实验结果发现有 46
株内生真菌对一种或多种指示菌具有不同程度的抑
制作用 ,占总分离菌株的 56.8%,见表 2,说明滇牡丹
内生真菌中存在着丰富的抗菌资源。活性菌株分属
于 16个属 ,其中 22株来自根 , 18株来自茎 , 6株来自
叶。对 5种以上指示菌均有抑制生长作用的内生真
菌有 20株 ,占总菌株的 24.7%,主要来自根和茎部 ,
其中毛壳菌属和拟青霉属各 5株 ,交链孢属 3株 ,抑
菌活性较强的菌株主要分布在拟青霉属。
菌株 PR21、PR47、PR52属于拟青霉属 ,均来自滇
牡丹的根部 , PR47的代谢产物对白色葡萄球菌 、白色
念珠菌 、皮炎单孢枝霉 、灰葡萄孢 、燕麦镰孢菌有较强
的抑制活性 ,抑菌圈直径均大于 10mm;菌株 PR21和
PR52均对 7种指示菌有抑制作用 ,其中 PR21的代谢
产物对宋内志贺菌具有抑制作用(d=13 mm), PR52
代谢产物对白色葡萄球菌有较强的抑制活性(d=18
mm)。菌株 PR35为木霉属 ,来自滇牡丹茎部 ,其代谢
产物对紧密单孢枝霉的抑制作用最强(d=20mm)。
表 2　滇牡丹内生真菌的抑菌活性
Tab.2　TheantimicrobialactivitiesofendophyticfungifromPaeoniadelavayi
Genus No. Inhibitionhalo/mm
1 029 1 043 1 046 2 005 3 077 3 078 3 029 3 061 3 065 3 104 3 076
Paeculomyces PR9 9 9
PR11 8 8 7 8 7 7
PR21 8 13 6 8 7 9 8
PR22 10 8
PR33 7 10 7 10 7
PR47 14 10 16 18 15
PR52 18 9 12 9 12 7 8
Trichoderma PR35 8 20 6 8
PR69 6 9 7
PR44 6 6 6 9 6
Aspergilus PR46 15 8 10 8 15
PR50 10 10 7 6 12
Cephalosporium PR71 8 11 6
PR79 6 8 7 7
Penicilium PR77 11 6 7 8 7
Humicola PR4 7 6
Basipetospora PR29 7 10 8
PR72 7 6 6 7 7
PR73 7 8 6 8
Alternaria PR14 8 10 6 6 10
PR38 6 7 15 6
PR39 9 6 6 8 8
PR55 10 8 6 8 9 9
Fusarium PR78 7 10 7 8 9
Xylaria PR27 8 7 11
PR30 7 8 7
Chaetomium PR6 9 7 10 8 8 8
PR7 9 6 7 8 11 6
PR15 10 9 7 7 9
PR20 8 7 7 8 10 10
PR24 12 9
PR32 7 6 10 9
PR42 7 10 6 8
PR74 8 7 8 8 7 6
Pyrenochaeta PR8 6 6 9 7
PR12 8 9
PR51 10 10 8
PR54 6 6 9 7
Botryotrichun PR26 8 7 7
Ectostroma PR34 8 10 7
PR41 7 9 6 7 8
Ozonium PR76 12 6
PR49 10 6 8
Phacodium PR36 8 9 7 7
PR57 10 7 9 8
PR58 9 7 7 6
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4　讨　论
从云南野生滇牡丹的根 、茎 、叶中共分离到 81
株内生真菌 ,分属于 5目 、7科 、19个属 ,表明滇牡丹
内生真菌的种群比较丰富 ,生态分布广泛 。不同部
位内生真菌分布的数量不同 ,内生真菌在根和茎部
分布明显高于叶 ,可能是由于根茎中含有丰富的营
养物质储备供内生真菌的生长繁殖;另外种群分布
也有所差异 ,有些内生真菌具有明显的器官专一性 ,
这表明不同类群的内生真菌在植物不同器官中占据
不同的生态位 ,可能是受到宿主不同部位微环境的
影响 ,适合不同的内生真菌类群的侵入和定殖 。
抑菌活性实验表明 ,滇牡丹内生真菌具有广泛的
抗菌活性(活性菌株占总数的 56.8%),其中菌株 PR47
对 5种指示菌均具有较强的抗菌活性 ,菌株 PR21、
PR35、PR52分别对宋内志贺菌 、紧密单孢枝霉 、白色葡
萄球菌具有较强的抑菌活性 ,这为寻找具有选择抗性
的抗菌药物提供了资源。关于上述具有高抗菌活性菌
株的有效化学成分的提取分离有待深入研究。
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gi(常见与常用真菌)[ M] .Beijing:SciencePress, 1978.
(收稿日期:2010-08-17)
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30701091)
作者简介:李友 ,男 ,硕士研究生　　研究方向:中药质量控制　　＊通讯作者:龚慕辛 , 女 ,教授　　研究方向:中药化学　　Tel:(010)
83911626　　E-mail:gongmuxin@ 126.com
板蓝根三氯甲烷提取部位抗内毒素作用的 “谱效”关系研究
李友 1 ,马莉1 ,沈芃2 ,龚慕辛 1＊(1.首都医科大学中医药学院 ,北京 100069;2.四川科伦实业集团成都市科伦药物研究所,成都 610500)
摘要:目的　分析板蓝根三氯甲烷提取部位抗内毒素作用的谱效关系 , 以阐明板蓝根药材药理活性与其物质基础间的相关
性。方法　采用动态浊度法检测不同产地板蓝根三氯甲烷萃取物抗内毒素生物活性 , 得到板蓝根对内毒素抑制的量效关系
曲线及其参数斜率(k)、半数有效剂量(IC50);采用 HPLC色谱法获取板蓝根三氯甲烷部位指纹图谱 , 运用多元线性回归等统
计方法 , 将抗内毒素活性参数 IC
50
与 HPLC指纹图谱共有峰的标准化峰面积比值关联。结果　不同产地板蓝根三氯甲烷萃取
物抗内毒素活性干扰实验最小稀释倍数为 5倍;其量效关系直线 k为 48.64 ～ 55.19, 说明各批次药材对内毒素的作用趋势相
同;IC50为 0.260 ～ 1.099g· mL-1 ,说明不同药材对内毒素的抑制作用差别较大;指纹图谱中与抗内毒素活性关系密切的峰为
3, 8和 9。结论　板蓝根三氯甲烷部位有较好的体外抗内毒素作用 ,其中苯甲酸和其他 2成分为其主要活性成分。
关键词:板蓝根;抗内毒素作用;动态浊度法;指纹图谱;谱效关系
中图分类号:R285　　　文献标志码:A　　　文章编号:1001-2494(2011)10-0741-04
Spectrum-effectRelationshipsbetweenHPLCFingerprintsandAnti-endotoxinActivityofChloroformEx-
tractfromIsatidisRadix
LIYou1 , MALi1 , SHENPeng2 , GONGMu-xin1＊(1.ColegeofTraditionalChineseMedicine, CapitalMedicalUniversity, Bei-
jing100069, China;2.ChengduKelunPharmaceuticalResearchInstituteSichuanKELUNIndustryGroup, Chengdu610500, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　Toanalyzethespectrum-effectrelationshipsbetweenHPLCfingerprintsandanti-endotoxinactivityof
·741·中国药学杂志 2011年 5月第 46卷第 10期　　　　　　　　　　　　　　 ChinPharmJ, 2011May, Vol.46No.10