全 文 :·生物技术· 北方园艺2015(10):104~107
第一作者简介:童俊(1980-),女,湖北黄冈人,硕士,工程师,现主要
从事园林植物遗传育种与栽培技术等研究工作。E-mail:vivian7484
@126.com.
基金项目:武汉市晨光计划资助项目(201271031407)。
收稿日期:2015-01-22
DOI:10.11937/bfyy.201510025
鸢尾属部分园艺品种遗传多样性的ISSR分析
童 俊1,周 媛1,毛 静1,2,董 艳 芳1,2,徐 冬 云1,陈 法 志1
(1.武汉市林业果树科学研究所,湖北省园林植物工程技术研究中心,湖北 武汉430075;2.华中农业大学 园艺林学学院,湖北 武汉430070)
摘 要:以34份鸢尾属园艺品种为试材,采用ISSR分子标记方法,研究鸢尾属园艺品种的
遗传特性及亲缘关系。结果表明:10个ISSR随机引物检测到153个多态位点,多态性条带比例
为100%,表明供试材料具有丰富的遗传多态性。各品种之间的DICE遗传相似系数在0.148~
0.657之间,平均相似系数为0.365。由聚类分析可知,当遗传系数为0.354时,可将供试材料分
为4个品种群。其中Ⅰ群有21个品种,全部为须毛状附属物亚属的德国鸢尾。Ⅱ群有4个品种,包
括无附属物亚属的西伯利亚鸢尾和2个花菖蒲品种。Ⅲ群有4个品种,包括2个花菖蒲品种以及
2个从荷兰引进的德国鸢尾。Ⅳ群为无附属物亚属的路易斯安那鸢尾品种群。主坐标分析所反
映的关系和UPGMA聚类图相似。
关键词:鸢尾品种;ISSR;遗传多样性;亲缘关系
中图分类号:S 682.1+9 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2015)10-0104-04
鸢尾属鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属(Iris L.)植物,世界
著名宿根花卉,花型多样,花色艳丽,花期较长,叶片优
美,素有“宿根皇后”的美誉。鸢尾观花观叶的双重价值
使其广泛用于园林绿化、庭院种植、湿地景观及切花等。
鸢尾属是鸢尾科中最大的一个属,全世界鸢尾野生种约
280种,我国约有60个种、13个变种及5个变型[1-2]。因
受到数量与观赏性以及栽培特性等方面的制约,鸢尾原
种在世界各地园林中用于栽培观赏的却不多。目前,在
园林中广泛应用的是鸢尾园艺品种,鸢尾园艺类群包括
根茎类无髯鸢尾、根茎类有髯鸢尾和球根鸢尾。其中有
髯鸢尾花型和花色最为丰富,是欧美园林中最为盛行的
一类鸢尾。而无髯鸢尾生态类型一般为湿生或中生型,
适应性相对较广,随着现代育种工作的开展,鸢尾品种
也日渐丰富,逐渐受到人们的青睐,其中以西伯利亚鸢
尾、路易斯安那鸢尾和花菖蒲等最为著名[3-4]。
国内外一直在积极开展鸢尾属植物系统分类学、细
胞发育学、繁殖生物学、分子生物学及植物化学等多方
面的研究,采用分子标记和序列分析等手段分析鸢尾属
植物的系统发育学与种类亲缘关系也是现代鸢尾属植
物研究的新焦点。牟少华等[5]对我国鸢尾属植物的地
理分布、种质资源保存状况及园林应用情况进行了概
述,并提出了今后研究的4个主要方向。王瑞芬[6]利用
SSR和SRAP分子标记对新疆喜盐鸢尾居群遗传多样
性进行了研究,从10对SSR引物和120对SRAP引物
中分别筛选出6对和18对引物对新疆喜盐鸢尾自然居
群进行遗传多样性分析,2种标记技术对新疆野生喜盐
鸢尾自然居群的遗传多样性的分析具有较高的一致性。
张敏等[7]利用ISSR分子标记对鸢尾属国内分布的25
个野生鸢尾种(变型、变种和居群)和6个国外分布种的
37份材料进行了遗传分析,多态性比例达99.7%,说明
鸢尾属物种间有丰富的遗传多样性。利用15个有效引
物可以较好地将鸢尾属供试37份材料分为6组,其中矮
紫苞鸢尾和单苞鸢尾单独划为一组。随着鸢尾类植物
的园艺品种的增多,其遗传背景愈发复杂。但目前尚鲜
见对鸢尾园艺品种进行遗传多样性的研究报道。
ISSR技术由于多态性好,稳定重复性好,操作简
便,广泛运用于遗传多样性、遗传稳定性和遗传分化及
亲缘关系等方面的研究,在多种植物中已见报道[8-10]。
为了有效区分鸢尾不同品种类型,深入了解其遗传背
景,该试验利用ISSR分子标记对该课题组所收集的德
国鸢尾、路易斯安那鸢尾、西伯利亚鸢尾和花菖蒲的一
些栽培品种开展多样性评价及亲缘关系的分析,以期为
鸢尾属植物的遗传改良和种质创新工作提供科学指导
和理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试鸢尾属植物材料共34份(表1),主要是从北京
401
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植物研究所、南京、上海、以及荷兰等地引进的鸢尾属植
物品种,包括德国鸢尾、路易斯安那鸢尾、西伯利亚鸢
尾、花菖蒲的一些栽培品种,所有品种种植于武汉市林
业果树科研所武湖科技园鸢尾资源圃内。
表1 34份鸢尾属材料名称
Table 1 The 34 Iris L.materials and their origins
编号 材料名称 拉丁名 编号 材料名称 拉丁名
Code Material name Latin name Code Material name Latin name
1 德国鸢尾‘黑骑士’ Iris germanica‘Black knight’ 18 德国鸢尾‘不朽白’ I.germanica‘Immortality’
2 德国鸢尾‘金娃娃’ I.germanica‘Gold boy’ 19 德国鸢尾‘魂断蓝桥’ I.germanica‘Blue Staccato’
3 德国鸢尾‘皇家十字军’ I.germanica‘Royal Crusades’ 20 德国鸢尾‘守夜者’ I.germanica‘Night Ruler’
4 德国鸢尾‘洋娃娃’ I.germanica‘Doly’ 21 德国鸢尾‘血石’ I.germanica‘Bloodstone’
5 德国鸢尾‘黄莲’ I.germanica‘Zipper’ 22 德国鸢尾‘Gala Madrid’ I.germanica‘Gala Madrid’
6 德国鸢尾‘紫边白’ I.germanica‘Stitch Witch’ 23 德国鸢尾‘Nibelungen’ I.germanica‘Nibelunge’
7 德国鸢尾‘音箱’ I.germanica‘Music Bor’ 24 西伯利亚鸢尾‘堇四褶’ I.sibirica‘Fourfold Lavendel’
8 德国鸢尾‘笛声’ I.germanica‘Tantara’ 25 西伯利亚‘红光’ I.sibirica‘Sparkling Rose’
9 德国鸢尾‘短梦’ I.germanica‘Little Dream’ 26 路易斯安那1号 I.louisiana‘No.1’
10 德国鸢尾‘杰西之歌’ I.germanica‘Jesse’s Song’ 27 路易斯安那2号 I.louisiana‘No.2’
11 德国鸢尾‘Lliny Charm’ I.germanica‘Lliny Charm’ 28 路易斯安那3号 I.louisiana‘No.3’
12 德国鸢尾‘Queen’ I.germanica‘Queen’ 29 路易斯安那4号 I.louisiana‘No.4’
13 德国鸢尾‘White’ I.germanica‘White’ 30 路易斯安那5号 I.louisiana‘No.5’
14 德国鸢尾 I.germanica 31 花菖蒲1号 I.ensata‘No.1’
15 德国鸢尾‘Party dress’ I.germanica‘Party dress’ 32 花菖蒲2号 I.ensata‘No.2’
16 德国鸢尾‘法国回声’ I.germanica‘Echo de France’ 33 花菖蒲3号 I.ensata‘No.3’
17 德国鸢尾‘蓝瀑布’ I.germanica‘Blue waterfal’ 34 花菖蒲4号 I.ensata‘No.4’
1.2 试验方法
1.2.1 DNA提取 采用改良CTAB法提取叶片基因
组总DNA[11]。总DNA经RaseA酶解纯化后,用等体积
的氯仿和异戊醇(体积比为24∶1)混合液抽提。用无水
乙醇沉淀后溶于TE,用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA
的分子质量并根据荧光强度确定DNA浓度,将DNA浓
度调到20ng/μL待用。
1.2.2 ISSR检测 选取叶片纤维发达程度不同的鸢尾
材料4份(德国鸢尾‘黑骑士’、西伯利亚‘红光’、路易斯
安那1号、花菖蒲1号),从38个ISSR随机引物(英骏生
物技术有限公司合成)中筛选出条带清晰、多态性高、重
复性好且稳定性强的引物10个。在对鸢尾属植物ISSR
分析及PCR扩增体系优化后,确定反应总体积为20μL,
其中TaqDNA聚合酶(Thermo scientific公司)1U、10×
PCR Bufer 2μL、1.5mmol/L的氯化镁、0.2mmol/L
dNTP、0.5μmol/L引物、20ng模板DNA,其余用蒸馏
水补充。PCR扩增反应程序为:94℃预变性3min,94℃
变性30s,60℃复性45s,72℃延伸1.5min;梯度降温进
行复性,7个循环后稳定,在53℃复性,进行39个循环,
循环结束后,72℃延伸5min,4℃保存。扩增产物于2%
的琼脂糖凝胶中电泳检测,85V电压,电泳100min,溴
化乙锭染色后在凝胶成像仪上观察并照相记录。
1.3 数据分析
PCR扩增产物的电泳位置在凝胶的某个相同迁移
率位置上有DNA条带记为1,无DNA条带记为0。利
用NTSYS-PC软件计算种质间DICE遗传相似系数,采
用SHAN程序中的UPGMA法进行聚类分析,构建聚
类图。采用DCENTER程序对相似系数矩阵进行转换,
再用EIGEN程序进行主坐标分析。
2 结果与分析
2.1 ISSR扩增多态性分析
由表2可知,10个ISSR随机引物在供试材料中共
扩增出153条带,全部条带均为多态性条带,多态性条带
比例为100%,说明供试鸢尾属材料之间具有丰富的遗
传多态性。各引物扩增的DNA带数在12~18条之间,
平均每个引物扩增条带数和检测的ISSR多态性的平均
数均为15.3,说明供试鸢尾属植物间的异质性较高,遗
传基础差异较大。部分引物扩增出的基因组DNA指纹
图谱见图1。
表2 10个ISSR有效引物序列及
对34份鸢尾属材料扩增结果
Table 2 The sequences of 10primers and
the results of amplification on the 34 Iris L.materials
引物
Primer
序列
Sequence
总位点数
Number of
loci
多态性位点数
Number of
polymorphic loci
多态性条带比例
Polymorphic proportion
/%
N11
N13
N16
N21
N22
N32
N40
N41
N45
N46
5′-(AG)8YC-3′
5′-(AG)8YT-3′
5′-(AG)8RA-3′
5′-(GA)8YC-3′
5′-(GA)8YA-3′
5′-(AC)8RG-3′
5′-(GACA)4-3′
5′-(GTGC)4-3′
5′-(CCT)5-3′
5′-(GGGGT)3-3′
17
17
13
17
12
15
12
18
16
16
17
17
13
17
12
15
12
18
16
16
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
总计Total
平均 Average
153
15.3
153
15.3 100
注:Y:C/T;R:A/G。
Note:Y:C/T;R:A/G.
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·生物技术· 北方园艺2015(10):104~107
图1 34份鸢尾属材料在引物N32的扩增结果
Fig.1 Amplification results with ISSR primer N32of 34 Iris L.
34份鸢尾种质的DICE相似系数介于0.148~
0.657之间,平均相似系数为0.365。其中,德国鸢尾
‘White’和路易斯安那5号的相似系数最小为0.148,表
明二者亲缘关系最远,前者为有髯鸢尾,后者为无髯鸢
尾。而德国鸢尾‘蓝瀑布’和‘不朽白’的相似系数最大
为0.657,表明这2个品种亲缘关系最近,遗传相似程度
最高。
图2 34份鸢尾属材料基于ISSR标记的UPGMA聚类图
Fig.2 The UPGMA dendrogram of 34 Iris L.materials
based on ISSR markers
2.2 UPGMA聚类分析
用NTSYS-PC软件对34份鸢尾种质资源进行聚类
分析并构建出分子系统树(图2),从聚类图上可以反映
出物种间亲缘关系的远近。为了便于分析,在聚类图的
遗传距离0.354处划结合线,将供试鸢尾属的34份材料
划分为4个品种群。其中Ⅰ群有21个品种,全部为须毛
状附属物亚属的德国鸢尾。Ⅱ群有4个品种,包括无附
属物亚属的西伯利亚鸢尾和2个花菖蒲品种。Ⅲ群有4
个品种,包括2个花菖蒲品种以及2个从荷兰引进的德
国鸢尾。Ⅳ群有5个品种,全部为无附属物亚属的路易
斯安那鸢尾。
2.3 主坐标分析
进一步进行主坐标分析发现,在横坐标轴-0.02处
将图3分为二部分,德国鸢尾中的21个品种位于图右边
(对应图2的Ⅰ群),其中矮生德国鸢尾品种分布在右下
部,中高生德国鸢尾品种分布在右上部。路易斯安那鸢
尾集中分布在左下部(对应图2的Ⅳ群),西伯利亚鸢尾、
花菖蒲以及2个从荷兰引进的德国鸢尾‘Gala Madrid’
和‘Nibelungen’分布在左上部(对应图2的Ⅱ群和Ⅲ群)。
德国鸢尾‘Gala Madrid’和‘Nibelungen’(22和23号品
种)位于图左上方中间位置,在图2中与花菖蒲品种群
聚到了一起。主坐标二维图所反映的关系和UPGMA
聚类图的相似。
图3 34份鸢尾属材料基于ISSR标记的主坐标二维图
Fig.3 The principal coordinates two-dimensional diagram of
34 Iris L.materials based on ISSR markers
3 结论与讨论
10个有效引物共检测到153个位点且全部为多态
位点,多态性条带比例为100%。ISSR分子标记本身具
有多态性高的特点,该结果与张敏等[7]利用ISSR分子
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标记对德国鸢尾种内部分的栽培品种间进行了遗传分
析检测得到的多态性位点百分率(99.7%)相当,也进一
步证实了供试鸢尾种质资源具有较高的遗传多样性。
依据10个有效引物所产生的153个ISSR标记所
建立的鸢尾34个品种UPGMA聚类图,将供试鸢尾属
的34份材料划分为4个品种群,基本将该试验的34份
材料分为德国鸢尾、路易斯安那鸢尾、西伯利亚鸢尾、花
菖蒲四大类。其中,4个花菖蒲品种分别聚到了2个不
同的品种群,追溯花菖蒲的发展史可知,花菖蒲是先由
中国传到日本,1681年以后日本对野生花菖蒲进行了选
育,确立了江户、肥后、伊势3个品种群,1852年传到欧
洲,经过美国改良,以后又回到日本,现在大概有600个
品种,分析供试材料的4个花菖蒲品种可能来源于不同
的花菖蒲品种群[12]。德国鸢尾的栽培品种遗传背景复
杂,现在栽培的德国鸢尾至少是有10个以上亲本的园艺
杂种[2]。该试验中德国鸢尾‘Gala Madrid’和‘Nibelungen’
没有与其它21个德国鸢尾品种聚到一起,表明这2个荷
兰引进的德国鸢尾较供试材料中其它德国鸢尾遗传背
景差异较大。它们与2个花菖蒲品种聚到一起,推测可
能花菖蒲参与了这2个德国鸢尾的形成。
34份材料的平均相似系数为0.365。其中,德国鸢
尾‘White’和路易斯安那5号的相似系数最小,表明二者
亲缘关系最远。而德国鸢尾‘蓝瀑布’和‘不朽白’的相
似系数最大,表明这2个品种亲缘关系最近。德国鸢尾
‘蓝瀑布’和‘不朽白’均为须毛状附属物亚属的德国鸢
尾的栽培品种,都属于中晚花期高生有髯鸢尾,且二者
形态相似,分析二者可能有相同起源。
遗传多样性和种质间亲缘关系的研究,不仅与种质
资源的收集、保存和更新密切相关,而且是种质资源创
新和品种改良的基础。物种的遗传多样性程度是物种
长期进化的产物,物种遗传多样性越高,表明种质资源
在DNA分子水平存在差异越大,对环境变化的适应能
力就越强,越容易扩展其分布范围和开拓新的环境,可
供进一步选择、保存和利用的空间就越大。改善品种综
合性状的有效途径是增大育种亲本的遗传距离和多样
性水平。由此,该研究利用ISSR分子标记的方法,在分
子水平揭示所收集的鸢尾属种质资源的亲缘关系后,结
合形态特征和园艺特性,就可以进一步在遗传多样性高
的群体筛选和保留种质,为进一步新品种选育提供优质
的亲本材料,提高保存和利用种质的效率。
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Genetic Diversity Analysis of Iris L.Germplasm by ISSR
TONG Jun1,ZHOU Yuan1,MAO Jing1,2,DONG Yan-fang1,2,XU Dong-yun1,CHEN Fa-zhi 1
(1.Wuhan Forestry and Fruit-tree Research Institute,Hubei Engineering Technology Research Center of Landscape Plant,Wuhan,Hubei
430075;2.Colege of Horticulture and Forestry Sciences,Huazhong Agricultural University,Wuhan,Hubei 430070)
Abstract:Inter-simple sequence repeat(ISSR)was used to detect the genetic diversity among 34horticultural cultivars of
Iris.The results showed that 10primers produce 153clear,polymorphic and steady bands.Al of bands were polymorphic
(100%),which indicated that the genetic diversity of Iris L.was rich.The genetic similarity coeficient among the
accessions ranged from 0.148to 0.657,and the average was 0.365.At the point of the similarity coeficient 0.354,al the
accessions might be separated into four groups.The group I consisted by the cultivars of I.germanica.The group II had
tow cultivars of I.sibiricaand tow of I.ensata.In group III,towI.ensataand tow of germanica from Holand were
included.The IV group was made up with cultivars of I.Louisiana.The results of principal coordinates showed similarity
to the UPGMA dendrogram.
Keywords:Iris cultivars;ISSR;genetic diversity;relationship
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