全 文 ：琐琐葡萄多糖对 β淀粉样蛋白诱导 PC12 细胞凋亡的影响
袁 芳 徐 琦 盛 磊 刘 涛1 (新疆医科大学基础医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)
〔摘 要〕 目的 探讨琐琐葡萄多糖( VTP) 对 β淀粉样蛋白( Aβ25 ～ 35 ) 诱导 PC12 细胞凋亡的影响及作用机制。方法 Aβ25 ～ 35诱导 PC12 细胞
建立阿尔茨海默病( AD) 细胞模型，VTP( 20、40、80 mg /L) 作用于细胞模型，CCK-8 法检测各组细胞活性，流式细胞术检测细胞凋亡率，Ｒeal-time PCＲ
检测凋亡相关基因 Bcl-2 和 Bax表达。结果 VTP可提高 PC12 细胞活性，降低细胞凋亡率，增强 Bcl-2 mＲNA 表达，抑制 Bax mＲNA 表达。结论
VTP对 Aβ25 ～ 35诱导的 PC12 细胞凋亡具有明显的保护作用，其机制可能是通过增强 Bcl-2 mＲNA表达、降低 Bax mＲNA表达，抑制细胞凋亡。
〔关键词〕 阿尔茨海默病;琐琐葡萄多糖; PC12 细胞; Aβ25 ～ 35 ; 细胞凋亡
〔中图分类号〕 Ｒ965. 1 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202( 2015) 19-5372-02; doi: 10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2015. 19. 002
基金项目: 国家自然科学基金项目( 81360568) ;新疆维吾尔自治区高校
科研计划重点项目( XJEDU2012I25)
1 新疆医科大学公共卫生学院
通讯作者:刘 涛( 1974-) ，女，博士，教授，主要从事食品毒理研究。
第一作者:袁 芳( 1976-) ，女，博士，副教授，主要从事维吾尔药物的应
用基础研究。
The effects of polysaccharides from Vitis viniferal L on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25 ～ 35
YUAN Fang，XU Qi，SHENG Lei，et al.
College of Basic Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，Xinjiang，China
【Abstract】 Objective To investigate protective effects of polysaccharide from Vitis viniferal L( VTP) on apoptosis of PC12 cells in-
duced by Aβ25 ～ 35 ．Methods Alzheimer＇s disease( AD) cellmodel was established by Aβ25 ～ 35 inducing PC12 cells，then，the cells were divid-
ed into control，model( 20 μmol /L Aβ25 ～ 35 ) and VTP groups( 20，40，80 mg /L) ． Cell viability was detected by CCK-8 method． The apoptotic
rates were examined by Annexin V-FITC． The mＲNA expressions of Bcl-2 and Bax were quantified by real-time PCＲ． Ｒesults Compared
with that of model group，cell viability was improved，the apoptotic rate was reduced in VTP groups( P ＜ 0． 05) ，while the expression of Bcl-2
was increased and Bax expression was decreased( P ＜ 0． 05) ． Conclusions VTP inhibits apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25 ～ 35，which
might be involved adjust Bcl-2 and Bax gene expression in the mechanism of anti-apoptosis．
【Key words】 Alzheimer＇s disease; VTP; PC12 cells; Aβ25 ～ 35 ; Apoptosis
随着对阿尔茨海默病 ( AD) 研究的深入，天然药物预防和
治疗 AD的作用日益受到重视。国内外研究显示，葡萄提取物
能预防老年痴呆，对原花青素、白藜芦醇等葡萄提取物的抗痴
呆作用报道较多〔1，2〕。琐琐葡萄 ( Vitis vinifera L) 主产于新疆
吐鲁番、和田等地，是《神农本草经》《维吾尔药志》等医药文献
记载的药用葡萄品种。本课题组从琐琐葡萄提取了多糖、黄
酮、三萜等活性物质，研究其抗突变、抗氧化、抗病毒、抗衰老等
作用〔3〕。本研究拟探讨琐琐葡萄多糖( VTP) 抑制神经细胞凋
亡的作用及机制。
1 材料与方法
1. 1 药 品 与 试 剂 VTP 按 照 专 利 方 法 ( 发 明 专 利
200710201354) 提取分离，刘涛教授馈赠。DMEM 培养液溶解，
0. 22 μm尼龙滤膜过滤除菌，－ 20℃避光保存，实验时用完全
培养液稀释至所需浓度。Aβ25 ～ 35 ( Sigma 公司，超纯水溶解
Aβ25 ～ 35，置于 37℃老化 7 d) ; DMEM 培养液 ( 美国 Hyclone 公
司) ;胎牛血清( 杭州四季青公司) ; CCK-8 检测试剂盒( 武汉博
士德生物工程有限公司) ; Trizol ( Invitrogen ) ; 逆转录试剂盒
( TaKaＲa) ，荧光定量试剂( Invitrogen) ，Annexin V-FITC 细胞凋
亡检测试剂盒( BioVision) 。
1. 2 仪器 二氧化碳培养箱( 美国 Thermo公司) ，垂直流超净
化台( 美国 Thermo公司) ，全自动酶标仪( 美国 Bio-Ｒad 公司) ，
流式细胞仪( BD LSＲⅡ) ，PCＲ扩增仪( Applied Biosystems) ，Ｒe-
al Time PCＲ System 7700 型( 美国 ABI公司) 。
1. 3 实验方法
1. 3. 1 细胞培养 PC12 细胞( 高分化) 购自中国科学院上海
细胞生物学研究所细胞库。细胞培养液 DMEM高糖培养基，含
10%灭活胎牛血清、105 U /L 青霉素、100 mg /L 链霉素，置培养
箱( 37℃、5%CO2 饱和湿度) ，隔天换液，3 ～ 4 d传代。
1. 3. 2 CCK-8 法测定细胞活性 对数生长期的 PC12 细胞，5
× 104 ml 接种于 96 孔板，100 μl /孔。设对照组、模型组、VTP
实验组。培养至贴壁后，实验组加入 VTP，使其终浓度为 20、
40、80 mg /L。预处理 4 h 后，除对照组外，其余各孔加入
Aβ25 ～ 35，使之终浓度为 20 μmol /L。继续培养 24 h，每孔加入
CCK-8 10 μl，继续培养 1 h。在酶标仪 450 nm 测定吸光度，计
算 PC12 细胞存活率。每组设 5 个复孔，实验重复 3 次。
1. 3. 3 流式细胞仪检测细胞凋亡 按上述方法分组，培养细
胞接种于 6 孔板，消化各组细胞后收集，1 000 r /min 离心
5 min，细胞沉淀用冷 DMEM洗涤 2 次，在缓冲液中重悬成单细
胞悬液，室温下加入 5 μl Annexin V-FITC和 5 μl PI染料，轻轻
振荡、混匀，避光孵育 15 min，流式细胞仪测定细胞凋亡率。
1. 3. 4 Ｒeal-time PCＲ检测 Bcl-2 和 Bax 基因表达 按上述方
法分组，6 孔板培养细胞，Trizol 法提取各组细胞总 ＲNA，紫外
·2735· 中国老年学杂志 2015 年 10 月第 35 卷
分光光度计分析 ＲNA 浓度和纯度。逆转录合成 cDNA。逆转
录产物 cDNA 加入荧光定量 PCＲ 反应体系。根据 GenBank 序
列，引物和探针设计软件 Primer 5. 0 设计引物序列。引物序列
β-actin: 上游引物 3-AGACCTTCAACACCCCAGCC-5，3-CGT-
CAGGCAGCTCATAGCTC-5，扩 增 长 度 362 bp; Bax: 3-CG-
GCGAATTGGAGATGAACTG-5， 3-GCAAAGTAGAAGAGGGCA
ACC-5，扩增长度 161 bp; Bcl-2: 3-GTCGCTACCGTCGTGACTT-
5，3-CAGCCTCCGTTATCCTGGA-5，扩增长度 268 bp。经过
Blast分析，引物序列具有特异性。所用的引物及内参照 β-ac-
tin引物由鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。数据采用双
标准曲线法处理，计算待测组目的基因相对于对照组的表达差
异倍数。
1. 4 统计学分析 采用 SPSS18. 0 软件进行 t检验。
2 结 果
2. 1 VTP对 PC12 细胞活性的影响 与对照组比较，模型组细
胞生长受到抑制，细胞活性下降( P ＜ 0. 01) ; VTP各实验组与模
型组比较，细胞活性明显增加 ( P ＜ 0. 05 ) ，呈剂量相关性。
见表 1。
2. 2 VTP对细胞凋亡的影响 对照组细胞凋亡率为 4. 58%，
模型组细胞凋亡率 ( 36. 8% ) 明显升高，加入 VTP 干预的各组
细胞与模型组相比，细胞凋亡率下降，低、中、高剂量组凋亡率
分别为 17. 05%、11. 37%、8. 96%。
2. 3 VTP对 Bcl-2 mＲNA表达的影响 模型组与对照组相比，
Bcl-2 mＲNA表达下降 ( P ＜ 0. 01 ) ; VTP 各剂量组与模型组相
比，Bcl-2 mＲNA表达升高( P ＜ 0. 05) 。见表 1。
2. 4 VTP对 Bax mＲNA 表达的影响 模型组与正常组相比，
Bax mＲNA表达增加( P ＜ 0. 01) ;与模型组相比，VTP 各剂量组
Bax表达降低( P ＜ 0. 01) 。见表 1。
表 1 VTP对 Aβ25 ～ 35诱导的 PC12 细胞活性及
Bcl-2、Bax mＲNA表达的影响 ( x ± s，n =3)
组别
吸光度值
( OD)
细胞存
活率( % )
Bcl-2
mＲNA
Bax
mＲNA
对照组 0. 610 ± 0. 017 100. 00 1. 00 ± 0. 00 1. 00 ± 0. 00
模型组 0. 415 ± 0. 0171) 68. 03 0. 58 ± 0. 031) 3. 84 ± 0. 401)
VTP低剂量组0. 483 ± 0. 0292) 79. 18 1. 08 ± 0. 252) 1. 94 ± 0. 173)
VTP中剂量组0. 521 ± 0. 0872) 85. 41 1. 22 ± 0. 083) 1. 64 ± 0. 343)
VTP高剂量组0. 555 ± 0. 0323) 90. 98 1. 49 ± 0. 083) 1. 46 ± 0. 223)
与对照组相比: 1) P ＜ 0. 01;与模型组相比: 2) P ＜ 0. 05，3) P ＜ 0. 01
3 讨 论
Aβ是老年斑的主要成分，AD 发病的起始因素是大脑中
Aβ的沉积和聚集，发病机制与 Aβ 的神经毒性作用密切相
关〔4〕。在 AD动物模型及细胞模型研究中，Aβ25 ～ 35诱导损伤建
立 AD模型是常用方法〔5，6〕。本研究采用 20 μmol /L Aβ25 ～ 35作
用于 PC12 细胞 24 h构建 AD 体外模型。实验结果表明，模型
组细胞活性下降，细胞凋亡率显著增加，显示造模成功，故此模
型可以作为评价 VTP保护作用的 AD细胞模型。
从肉苁蓉、枸杞、黄芪、灵芝等传统益智中药中提取的水溶
性多糖均具有显著的改善学习记忆功能;海洋贝类中提取的多
糖也具有神经保护活性〔7，8〕。琐琐葡萄中有含量较高的多糖，
具有较强的抗氧化能力〔9〕。本研究表明 VTP对 Aβ25 ～ 35诱导的
神经细胞凋亡具有保护作用。
神经系统病变与细胞凋亡异常密切相关，在慢性神经退行
性病变中，包括 AD、帕金森病、Huntington 舞蹈病等患者，脑组
织中大量的神经细胞丢失，其共同的病理机制是神经细胞的凋
亡。AD的发生和发展进程中，诱导异常的细胞凋亡，可导致神
经元大量丢失，加重神经细胞病理改变，可导致大脑的学习、记
忆能力受到影响〔10〕。异常聚集的 Aβ对神经元具有毒性作用，
在体内体外均可诱导神经细胞凋亡。因此，在研究 AD 的防治
作用机制时，抗神经细胞凋亡已成为重要作用靶点。与细胞凋
亡密切相关的 Bcl-2 家族基因主要分为抑制凋亡基因 Bcl-2 和
Bcl-xl基因，以及促凋亡基因 Bax 和 Bad 基因。如果促凋亡和
抗凋亡基因或相关蛋白之间的平衡被打破，可引起异常神经细
胞凋亡，可导致神经元的结构与功能损伤〔11，12〕。本研究结果显
示，VTP能减少 Aβ25 ～ 35诱导的细胞凋亡，提示 VTP通过调节凋
亡相关基因的表达抑制 Aβ25 ～ 35诱导的细胞凋亡。
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〔2014-12-29 修回〕
( 编辑 曲 莉)
·3735·袁 芳等 琐琐葡萄多糖对 β淀粉样蛋白诱导 PC12 细胞凋亡的影响 第 19 期