全 文 ：洋桔梗高频再生系统的建立及其卡那霉素敏感性测定
杨燕燕 , 陈崇顺 , 瞿大枞 , 王　轶 , 曹伟杰
(南京师范大学生命科学学院 ,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室 ,江苏南京 210097)
　　摘要:以 Doub le M ariachi P ink洋桔梗叶片为外植体 ,研究了切割方式 、培养基中 6 -BA与 NAA配比对其不
定芽分化的影响以及叶片不定芽分化对卡那霉素(Km)的敏感性。结果表明:五刀切与三刀切对不定芽分化数量
的影响无显著性差异;M S+1. 0 mg /L 6 - BA为叶片不定芽分化的最适培养基 , 不定芽分化率达 100%, 在 1. 0 cm
×1. 0 cm叶块上的不定芽分化数平均达 25. 4;25 mg /L Km为抑制叶片不定芽分化的最低浓度。
　　关键词:洋桔梗;叶片;不定芽分化;高频再生系统;卡那霉素敏感性
　　中图分类号:S685.9903. 6　　文献标识码:A　　文章编号:1002 - 1302(2007)02 -0098 - 03
收稿日期:2006 - 10 - 19
作者简介:杨燕燕(1982— ),女 ,山西霍州人 ,硕士生 ,主要从事植物
生物技术与分子生物学研究。 E - m ail:yyyab c432100@ 126. com。
通讯作者:陈崇顺 , 博士 , 硕导。 E - m ail:chenchongshun@ n jnu.
edu. cn。
　　切花洋桔梗 (Eustoma grand iflorum)为龙胆科草
本观赏植物 ,原产北美洲 ,花姿清雅 、花色丰富 ,茎秆
光洁颀长 ,现已跻身世界十大切花 ,是切花生产中地
位上升最快的种类 [ 1] 。一直以来 ,人们总期望获得
更丰富和奇美的洋桔梗新品种 , 分子育种新技
术 ———植物基因工程可定向 、高效地实现此目的 ,其
中洋桔梗离体培养高频再生系统的建立是以农杆菌
介导基因高效转化的重要前提 。迄今国内外有关洋
桔梗离体再生的研究不多 ,所涉及的品种仅有 Dwarf
Purple
[ 2] 、B ico lo r Pu rple[ 3] 、Lisa B lue[ 4] 、Deep B lue[ 5]
等少数;且再生不定芽的增殖倍数也不高 ,大多不超
过 10倍 [ 4 - 6] 。 Doub leM ariach i P ink洋桔梗花粉色 、
重瓣 ,花形似玫瑰 (月季 ),是目前市场上较流行的
品种之一 ,目前尚未见其离体再生方面的研究报道 。
本研究以该品种的叶片为外植体 ,比较了不同切割
方式 、培养基中 6 - BA与 NAA的配比等对其不定
芽增殖倍数的影响 ,建立了该品种的高频再生系统 ,
并在此基础上测定了叶片不定芽再生对卡那霉素
(Km)的敏感性 ,为进一步以农杆菌介导目的基因
对其转化 、创建新种质奠定了重要基础。
1　材料与方法
1. 1　材料
从昆明缤纷园艺有限公司购得日本 SAKATA
公司生产的 Doub leM ariachi P ink洋桔梗 F1代种子 ,
以经过种子萌发 [ 1] 和生长两个月左右的种苗为试
验材料。
1. 2　方法
1. 2. 1　外植体的消毒　选取生长良好的洋桔梗植
株 ,切取带有第二 、第三对叶片 (从顶芽数起 )的茎
段 ,用纱布包好 ,流水下冲洗 1 h。在超净工作台上 ,
用 75%乙醇消毒 30 s,再在含 0. 15%活性氯的次氯
酸钠溶液中浸泡 17 m in,最后用无菌水冲洗 6次。
消毒完毕后 ,将茎段上的叶片切下 ,用无菌滤纸吸干
水分 ,供接种。
1. 2. 2　叶片的不同切割方式对不定芽再生的影响
　按图 1的 3种方法分别将叶片切成一对 (两个 )
叶块 ,每块大约 1. 0 cm ×0. 5 cm (因第三种切割方
式两叶块之间不切断 ,为了便于比较分析 ,故以一对
叶块为研究对象 ),将切好的叶块背面向下接种于
MS基本培养基 +0. 5 mg /L 6 -BA上 ,每瓶接 2对 ,
每种切法接 4瓶。定期观察 , 1个月后统计不定芽
数。MS基本培养基含蔗糖 30 g /L、琼脂 6 g /L, pH
值 6. 0±0. 2;培养条件为光强 1 500 ～ 2 000 lx、温度
(24±2) ℃、光周期 18 h /d。下同 。
1. 2. 3　6 - BA和 NAA的不同配比对洋桔梗不定芽
再生的影响 　设计了 6 - BA (0、 0. 1、 0. 5、 1. 0
mg /L)和 NAA(0、0. 01、0. 05、0. 1 mg /L)各浓度的
完全试验组合 ,采用三刀切将叶片切成 1. 0 cm ×
—98— 江苏农业科学　2007年第 2期DOI牶牨牥牣牨牭牳牳牴牤j牣issn牣牨牥牥牪牠牨牫牥牪牣牪牥牥牱牣牥牪牣牥牫牴
1. 0 cm左右的叶块 ,每个组合接 5瓶 ,每瓶接 4个
叶块。定期观察 , 2个月后统计不定芽数。
1. 2. 4　芽苗的增殖及生根　将叶片再生出的不定
芽接于 MS基本培养基中均一化生长 ,将长高的芽
苗切成带一对腋芽的茎段 ,转接于 MS +0. 1 mg /L
6 - BA +0. 05 mg /L NAA培养基中增殖 [ 7] ,再将获
得的芽苗(2 cm左右 )接于 1 /2M S+0. 1 mg /L NAA
培养基中生根[ 8] 。
1. 2. 5　抑制叶片不定芽再生的卡那霉素 (Km)最
低浓度的确定　根据待用转化载体的抗性标记基因
种类 ,确定 Km为选择性抗生素 。在筛选转化体之
前对受体材料进行抗生素敏感性测定是必要的 [ 7] 。
本试验参照相关文献首先设计了较大跨度的 Km浓
度梯度 (0、20、40、50、60、70、80、90、 100、120、150
mg /L),以测定抑制叶片不定芽再生的 Km浓度范
围;在此基础上 ,按相同方法在 MS +1. 0 mg /L 6 -
BA中添加了不同浓度的 Km (0、5、10、 12、15、20、
25、40mg /L),以确定抑制叶片不定芽再生的 Km最
低浓度 。因组培苗叶片大小不一 ,为了尽可能减少
误差 ,故采用五刀切将均一化的组培苗叶片切成1. 0
cm ×0. 5 cm左右的叶块 ,每个处理接 3瓶 ,每瓶接
10个叶块 。定期观察 , 1个月后统计不定芽数。
1. 2. 6　试验数据的统计分析　用 SPSS13. 0统计软
件对相关试验数据进行方差分析。
2　结果与分析
2. 1　叶片不同切割方式对不定芽再生的影响
接种 8 d后 ,大多外植体上有黄绿色愈伤组织
长出。 10 d后在五刀切处理中 ,即可看到与主脉垂
直的切口处的愈伤组织明显比与之平行的切口处
多 。 13 d后所有外植体上都显现芽点 ,有些是经过
愈伤组织分化而来 ,有些是直接分化而来。 20 d后
经愈伤组织分化的不定芽大多为颜色亮绿 、有透明
感的绿芽 ,而未经愈伤组织直接分化的不定芽为颜
色灰绿 、外被白粉的灰绿芽 ,灰绿芽比绿芽出现要
早 。 1个月后 ,所有处理的不定芽分化率都达到了
100%,且一对叶块上不定芽的分化数大多在 20个
以上。如表 1所示:在不定芽分化个数方面 ,五刀切
与三刀切之间并无显著性差异 。
2. 2　6 - BA和 NAA不同配比对不定芽再生的影响
　　从图 2和表 2可以看出 ,当 6 - BA浓度从 0到
1. 0mg /L逐渐增高时 ,不定芽数也相应增多;当 6 -
BA浓度为 0. 5mg /L或 1. 0mg /L时 ,不定芽分化率
表 1　不同切割方式对不定芽再生的影响
切割方式 不定芽分化均值(个) 显著水平(0. 05)
五刀切 27. 0 a
三刀切 22. 0 ab
三刀切,中间不切断 19. 2 b
　　注:不定芽分化均值 =外植体上不定芽总数 /外植体个数。
都达 100%。对不定芽数进行了方差分析 ,结果(表
3)表明:6 - BA和 NAA两个因子对不定芽分化个
数都具有显著性影响 ,且两个因子之间存在交互作
用 ,在此基础上对两个因子的各个处理进行了多重
比较分析 ,结果 (表 2)表明:在试验浓度范围内 , 6 -
BA对不定芽再生有促进作用 ,而 NAA的作用相反;
当 6 -BA浓度为 1. 0 mg /L, NAA为 0时 ,不定芽平
均分化数最多 ,高达 25. 4个。由此 ,确定叶片不定
芽再生的最适培养基为 MS+1. 0mg /L 6 -BA。
表 2　6 - BA和 NAA的不同配比对不定芽再生的影响
处理 6 - BA(m g /L)
NAA
(m g /L)
不定芽分
化均值(个)
显著水平
(0. 05)
1 0 0 0 g
2 0 0. 01 0. 13 fg
3 0 0. 05 1. 06 fg
4 0 0. 1 0. 75 fg
5 0. 1 0 5. 90 e
6 0. 1 0. 01 5. 38 e
7 0. 1 0. 05 4. 40 ef
8 0. 1 0. 1 2. 00 efg
9 0. 5 0 19. 20 b c
10 0. 5 0. 01 18. 16 c
11 0. 5 0. 05 19. 35 b c
12 0. 5 0. 1 11. 55 d
13 1. 0 0 25. 40 a
14 1. 0 0. 01 23. 17 ab
15 1. 0 0. 05 20. 25 b c
16 1. 0 0. 1 16. 38 c
表 3　6 - BA和 NAA的不同配比对不定芽再生影响
结果的方差分析(α=0. 05)
差异来源 平方和 自由度 方差 F值 概率
6 -BA 20 920. 275 3 6 973. 425 204. 746 0. 000
NAA 937. 871 3 312. 624 9. 179 0. 000
6 -BA +NAA 725. 555 9 80. 617 2. 367 0. 014
误差 9 298. 064 273 34. 059
总和 69 768. 000 289
—99—杨燕燕等:洋桔梗高频再生系统的建立及其卡那霉素敏感性测定
2. 3　芽苗的增殖及生根
观察结果表明:由灰绿芽长成的苗不玻璃化 ,而
由绿芽长成的苗中一部分出现玻璃化;且灰绿芽都
能生根 (图 3a),苗生长较快 ,叶片灰绿且舒展 (图
3b)。由此可见 ,灰绿芽比绿芽更适于增殖及生根。
2. 4　抑制叶片不定芽再生的 Km最低浓度的确定
Km 浓度为 0时 , 30 d后不定芽分化率为
100%;浓度为 20 mg /L时 ,只有 1个外植体上分化
出 1个不定芽;浓度为 40 ～ 150 mg /L时 ,外植体均
变黄 、坏死 ,没有分化出不定芽 。据此推断:抑制不
定芽再生的最低 Km浓度在 0 ～ 40mg /L之间 。在 0
～ 40 mg /L间进一步设计了 8个 Km浓度处理 。 1
个月后 ,在 Km≥10 mg /L的所有处理中 ,叶片边缘
变黄 、变褐 ,而且黄色向叶片中央逐渐扩张 (图 4),
且不定芽分化受到明显的抑制;而当 Km≥25 mg /L
时 ,则完全没有不定芽分化 。统计结果(表 4)表明:
随着 Km浓度的逐渐增高 ,外植体不定芽的分化率
和均值都逐渐下降;当 Km≥25 mg /L时 ,分化率和
均值都为 0。因此 ,确定抑制叶片不定芽再生的最
低 Km为 25mg /L。
3　结论
建立洋桔梗高频再生体系和测定其对抗生素的
表 4　不同 Km浓度处理对叶片不定芽再生的影响
处理 Km(m g /L)
不定芽分化率
(%)
不定芽分化
均值(个)
1 0 100 12. 50
2 5 75 3. 67
3 10 35 3. 00
4 12 23. 3 0. 23
5 15 13. 3 0. 07
6 20 1. 7 0. 07
7 25 0 0
8 40 0 0
敏感性是农杆菌介导基因高效转化的前提。一般而
言 ,外植体切口的线度与不定芽分化的数量呈正相
关。但从本研究结果看 ,五刀切虽然比三刀切的切
口线度长 ,却并没有得到更多不定芽 。可能是因为
本试验中绝大部分不定芽来自与叶片主脉垂直的切
口 ,而五刀切未能增加与叶片主脉垂直的切口线度。
另一方面 ,与叶片主脉平行的切口形成的愈伤组织
少 ,不定芽多为直接分化的灰绿芽 ,同时五刀切可使
外植体大小均一 ,利于研究 ,因此推荐五刀切作为研
究性试验中叶片外植体的切割方法。根据本研究结
果 , Doub leM ariach i P ink洋桔梗的高频再生体系为:
叶片不定芽最适分化培养基为 MS +1. 0 mg /L 6 -
BA;增殖培养基为 MS +0. 1 mg /L 6 - BA +0. 05
mg /L NAA;生根培养基为 MS +1. 0 mg /L 6 - BA。
抑制叶片不定芽再生的最低 Km浓度为 25mg /L。
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