全 文 ：第 35 卷 第 5 期
2011 年 9 月
南京林业大学学报(自然科学版)
Journal of Nanjing Forestry University (Natural Science Edition)
Vol． 35，No． 5
Sept．，2011
http:/ /www． nldxb． com［doi:10． 3969 / j． issn． 1000 － 2006． 2011． 05． 007］
收稿日期:2010 － 07 － 13 修回日期:2010 － 12 － 27
基金项目:国家林业局林业公益性行业科研专项项目(200704026) ;国家林业局“948”项目(2011 － 4 － 69)
作者简介:秦莉(1984—) ，硕士生。* 吴小芹(通信作者) ，教授。E-mail:xqwu@ njfu． com． cn。
引文格式:秦莉，吴小芹． 激素和光照对抗松材线虫病赤松丛生芽离体保存的影响［J］． 南京林业大学学报:自然科学版，2011，35
(5) :31 － 34．
激素和光照对抗松材线虫病赤松
丛生芽离体保存的影响
秦 莉，吴小芹*
(南京林业大学，江苏省有害生物入侵预防与控制重点实验室，江苏 南京 210037)
摘要:为了保存通过抗病性测定表明具优良抗性的抗松材线虫病赤松丛生芽，笔者研究了不同激
素和光照处理对其离体保存的影响。结果表明:17 ℃条件下，暗培养不适合抗病赤松丛生芽的
离体保存;而在培养基中仅添加 1. 0 mg /L ABA 或添加 0. 2 mg /L 6 － BA + (0. 1 ～ 0. 2)mg /L
NAA的组合对丛生芽限制生长保存具有较好效果。二者均可使丛生芽离体保存后存活率高于
94 %且恢复生长后芽体增殖率为 100 %，植株生长健壮。
关键词:赤松;松材线虫病;激素;光照;离体保存
中图分类号:S722． 3 文献标志码:A 文章编号:1000 － 2006(2011)05 － 0031 － 04
Effects of hormone and light on in vitro preservation of axillary buds of
Pinus densiflora resistant to pine wilt disease
QIN Li，WU Xiaoqin*
(Jiangsu Key Laboratory for Prevention and Management of Invasive Species，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China)
Abstract:In order to preserve axillary buds of the Pinus densiflora with excellent resistance against Bursaphelenchus xy-
lophilus，the effects of different treatments of phytohormones and light on bud preservation were studied． It showed that
dark condition was not favorable to in vitro bud preservation at 17 ℃ ． On the contrary，addition of 1． 0 mg /L ABA or
0. 2 mg /L 6-BA plus 0． 1 － 0． 2 mg /L NAA under light-dark alteration had a positive effect on the bud preservation． In
this condition，survival rate of the axillary buds was 94 % or higher and all survived buds proliferated well．
Key words:Pinus densiflora;pine wilt disease;hormone;light;preservation in vitro
赤松(Pinus densiflora)是高度感染松材线虫病
(Bursaphelenchus xylophilus)的树种［1］。目前，利用
从日本引进的抗病种子［2］，通过器官发生途径已
成功建立抗松材线虫病赤松无性快繁再生体
系［3］。为了有效地保存珍贵的种质资源、避免优
良抗病种质在长期继代培养中产生衰退现象，有必
要对现存的抗病赤松丛生芽进行离体保存。以中
期保存为目的的限制生长保存技术已经成功应用
于多种被子植物［4］，有研究表明 17 ℃是抗病赤松
丛生芽离体保存的最佳温度［5］。此外减少光照或
添加生长调节剂等途径也可以减缓种质老化过程
从而达到限制生长保存种质资源的目的。笔者对
抗病赤松丛生芽离体保存相关因子如光照、激素等
因素进行了研究，以期为抗病赤松种质资源的中期
离体保存提供理论依据和技术支撑。
1 材料与方法
1． 1 供试抗病赤松苗
所用材料源于抗松材线虫病赤松成熟种胚萌
发的胚苗，截取带子叶顶芽(高 0. 5 ～ 0. 8 cm)进行
继代增殖［3］，经过前期培养现已增殖至第 15 代的
抗病赤松 1# － A无性系丛生芽。
1． 2 光照与激素处理
将高为 1. 5 ～ 2. 0 cm 处于生长阶段的抗病赤
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 35 卷
松单个丛生芽转接入分别添加 0、0. 5、1. 0、1. 5、
2. 0 mg /L 脱落酸(ABA)的 1 /2DCR 基本培养基
上，分别置于暗培养(0 h /d)、光暗交替培养
(12 h /d)、全光照培养(24 h /d)环境下进行保存。
每个处理重复 3 次，每个重复为 5 瓶，每瓶接种 5
个单芽。温度为 17 ℃［5］，保存 12 个月后统计其存
活率和增殖生长状况。存活率 =(存活芽数 /接种
芽数)× 100 %;增殖系数 =增殖后有效芽体数 /接
种芽体数。
将高为 1. 5 ～ 2. 0 cm 处于生长阶段的抗病赤
松单个丛生芽转接入添加不同浓度 6-苄氨基嘌呤
(6 － BA) (0、0. 1、0. 2 mg /L)与萘乙酸(NAA) (0、
0. 1、0. 2 mg /L)组合的 1 /2DCR基本培养基上。置
于 17 ℃光照培养箱中进行培养保存。每个处理重
复 3 次，每个重复为 5 瓶，每瓶接种 5 个单芽。光
照时间为 12 h /d，保存 24 个月后统计其存活率和
增殖生长状况。
保存后恢复生长培养:将保存后的抗病赤松丛
生芽置于 25 ℃温室环境下恢复培养 1 周。恢复生
长后，再转接至增殖培养基中进行增殖培养和后续
生长培养。
以上试验结果采用 SPSS13. 0 软件分析。
2 结果与分析
2． 1 不同光照及脱落酸处理对抗病赤松丛生芽保
存效果的影响
对采用 3 种光照、ABA 梯度浓度处理对抗病
赤松丛生芽离体保存的效果进行综合观察，结果表
明，在暗培养(0 h /d)光照条件下，无论培养基中是
否含有 ABA，绝大多数丛生芽针叶失水死亡，存活
率均低于 15 %且恢复后增殖率均为 0(图 1A) ;而
在光暗交替培养(12 h /d) (图 1B、图 2)、全光照培
养(24 h /d) (图 1C)条件下辅以 ABA处理，丛生芽
的存活率均高于 90 % 且恢复后增殖率均为
100 %。可见暗培养不利于抗病赤松丛生芽的离
体保存。
图 1 光照及脱落酸处理下抗病赤松丛生芽保存 12 个月后存活及增殖状况
Fig． 1 Survival rate and proliferation of axillary buds of resistant P． densiflora preserved for 12 months
on the medium with different concentration of ABA under different light time
同时，在光暗交替培养(12 h /d)和全光照培养
(24 h /d)条件下，不同浓度 ABA 处理下丛生芽离
体保存效果存在明显差异。其中当 ABA 浓度为
1. 0 mg /L时丛生芽的存活率和增殖系数均达到最
高(图 1B、1C)。但由于全光照培养会导致生产成
本的增加，综合以上结果，在 17 ℃、光暗交替培养
环境下，1 /2DCR培养基中添加 1. 0 mg /L ABA时，
丛生芽离体保存后存活率和增殖系数达到最高，芽
体长势健壮 (图 2C)。可见该处理对抗病赤松丛
生芽限制生长保存具有较好的效果。
图 2 光暗交替环境下不同浓度脱落酸处理抗病赤松丛生芽保存 12 个月后增殖状况
Fig． 2 Proliferation condition of axillary buds of resistant P． densiflora preserved for 12 months
with different concentration of ABA under light and dark alternately
注:不同处理 ABA质量浓度为 A． 0 mg /L;B． 0． 5 mg /L;C． 1． 0 mg /L;D． 1． 5 mg /L;E． 2． 0 mg /L。
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第 5 期 秦 莉，等:激素和光照对抗松材线虫病赤松丛生芽离体保存的影响
2． 2 6 － BA 和 NAA 组合对抗病赤松丛生芽保存
效果的影响
在 17 ℃、光暗交替培养(12 h /d)条件下，抗病
赤松丛生芽在添加不同浓度 6 － BA 和 NAA 组合
的培养基中可以离体保存达 24 个月以上时，存活
率仍均在 70 %以上，但各处理间增殖系数存在显
著差异(表 1)。其中，0. 2 mg /L 6 － BA +(0. 1 ～
0. 2)mg /L NAA 组合处理下，抗病赤松丛生芽增
殖系数较高，分别为 4. 8、5. 1，芽体生理状态良好，
针叶嫩绿，显 著 好 于 其 他 处 理。单 独 使 用
0. 2 mg /L 6 － BA或 0. 2 mg /L NAA 时，保存 24 个
月的抗病赤松丛生芽增殖系数分别为 3. 0、2. 8，芽
体细小，针叶轻微玻璃化(图 3) ，不利于丛生芽的
限制生长保存。可见单独使用 6 － BA 或 NAA 处
理，丛生芽增殖系数明显低于 6 － BA 和 NAA 组合
的处理。因此，在培养基中添加 0. 2 mg /L 6 － BA
+(0. 1 ～ 0. 2)mg /L NAA组合对抗病赤松丛生芽
限制生长保存具有较好效果。
表 1 6 － BA和 NAA组合处理下抗病赤松丛生芽保存 24 个月后存活及增殖系数
Table 1 Survival rate and multiplication coefficient of axillary buds of resistant P． densiflora
preserved for 24 months in the combination of 6 － BA and NAA
处理
treatment
c6 － BA /(mg·L －1) cNAA /(mg·L －1)
接种数 /个
number of inoculated shoots
存活率 / %
survival rate
增殖系数
multiplication coefficient
1 0． 0 0． 1 35 78 ± 7． 1abc 3． 3 ± 0． 1ab
2 0． 0 0． 2 39 89 ± 3． 2bcd 2． 8 ± 0． 2a
3 0． 1 0． 0 31 91 ± 5． 2cd 3． 3 ± 0． 3ab
4 0． 1 0． 1 31 97 ± 3． 0d 3． 6 ± 0． 1bc
5 0． 1 0． 2 32 75 ± 5． 7ab 4． 0 ± 0． 2c
6 0． 2 0． 0 32 72 ± 4． 6a 3． 0 ± 0． 1a
7 0． 2 0． 1 32 94 ± 3． 0d 4． 8 ± 0． 1d
8 0． 2 0． 2 40 100 ± d 5． 1 ± 0． 1d
图 3 6 － BA和 NAA处理下抗病赤松丛生芽保存 24 个月后增殖生长状况
Fig． 3 Proliferation of axillary buds of resistant P． densiflora preserved for 24 months on the
combination of 6 － BA and NAA
注:各处理中，A． 0． 2 mg /L NAA;B． 0． 2 mg /L 6 － BA;C． 0． 2 mg /L 6 － BA + 0． 1 mg /L NAA;D． 0． 2 mg /L 6 － BA + 0． 2 mg /L
NAA。
3 讨 论
植物的生长主要依靠光合作用，光因子对植物
的生长具有重要的影响。植物组织培养物在限制
生长保存过程中是否需要光照，各种材料要求不
一。如 Mullin等［6］在 4 ℃的黑暗条件下将离体培
养的草莓茎尖保持生活力长达 6 a 之久。该方法
在苹果、梨、猕猴桃、露叶松等植物的离体保存中也
得到了成功运用［7 － 10］。而此次试验发现在暗培养
条件下，抗病赤松丛生芽离体保存 12 个月后其针
叶失水死亡，存活率低于 15 %且恢复后增殖率为
0。笔者认为，在暗培养条件下抗病赤松由于长期
缺乏光照，生长纤弱、无法维持自身生长，因此不能
满足限制生长保存需要。但可以通过适当减弱光
照强度，缩短光照周期等措施进一步对其培养条件
进行调整。
脱落酸(ABA)是一种良好的生长抑制剂，可
以阻碍 RNA聚合酶的活性，抑制 DNA 的合成，从
而抑制组织培养物的生长活动。在培养基中添加
ABA可以减缓猕猴桃、马铃薯、甘薯、草莓等的生
长速度，从而延长相应种质在试管中的保存时
间［11 － 14］。也有研究表明，由于脱落酸具有促进植
株休眠和衰老的作用，用于其他植物保存时效果并
不理想［15］。此次试验中，在光暗交 替 培 养
(12 h /d)条件下，通过向培养基中添加不同浓度
的 ABA表明，质量浓度为 1. 0 mg /L 时，丛生芽的
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南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 35 卷
存活率和增殖系数相对较高，芽体生长健壮。因此
认为，在抗病赤松丛生芽的限制生长保存过程中添
加 1. 0 mg /L的 ABA有利于芽的恢复生长。
6 － BA和 NAA作为植物生长激素已被应用于
赤松丛生芽的增殖培养中［3］。但在进行抗病赤松
限制生长保存时，笔者发现在 1 /2DCR培养基中添
加 0. 2 mg /L 6 － BA +(0. 1 ～ 0. 2)mg /L NAA组合
使用时，丛生芽增殖系数较高，芽体生理状态良好，
保存时间可持续 24 个月之久。这与甘露醇与
6 － BA、NAA配合使用有利于魔芋的低温保存和恢
复生长的结论一致［16］。笔者认为不同激素间组合
由于浓度的差异对于组织培养物的离体保存所产
生的效果也有所差异。虽然在培养基中添加
1. 0 mg /L脱落酸对丛生芽离体保存具有较好的效
果，但通过比较发现添加 0. 2 mg /L 6 － BA +(0. 1 ～
0. 2)mg /L NAA处理更优于脱落酸处理。这可能
是由于低浓度的 6 － BA 和 NAA 在限制生长保存
过程中未抑制丛生芽的生长只是延缓代谢时间，因
此其保存后恢复生长的效果要好于 ABA处理的效
果。另外，有研究显示生长激素与其他添加物共同
使用也可以起到良好的保存效果［17 － 18］。此方法也
可以在抗病赤松丛生芽的离体保存中作进一步的
研究。
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(责任编辑 王国栋)
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