全 文 ：山西农业科学 2011，39（12）：1239- 1242 Journal of Shanxi Agricultural Sciences
大花萱草 ISSR-PCR最佳反应体系的建立
曹冬梅，康黎芳，赵 艳，张 超，段九菊，王云山
（山西省农业科学院园艺研究所，山西太原 030031）
摘 要：ISSR标记能揭示出种间、种内遗传变异情况，更好地揭示亲缘关系和遗传多样性。以大花萱草的
5个品种为试材，研究了影响大花萱草 ISSR- PCR扩增效果的各项因素，建立了适合大花萱草 ISSR- PCR
的最佳反应体系：20 μL反应体系中，10×buffer 2 μL，dNTP 0.2 mmol/L，Mg2+浓度 1.5 mmol/L，引物浓度
0.5 mmol/L，Taq酶 10.002 nkat，DNA模板 20 ng。大花萱草的最佳 ISSR扩增反应程序为：94℃预变性 5 min；
94℃变性 40 s，50℃退火 45 s，72℃延伸 1.5 min，共 40个循环；最后 72℃延伸 10 min。通过该反应程序进
行的大花萱草 ISSR扩增可获得清晰、稳定的条带。
关键词：大花萱草；ISSR；最佳反应体系
中图分类号：S682.1＋9 文献标识码：A 文章编号：1002- 2481（2011）12- 1239- 04
Establishment of the Optimum ISSR-PCR Reaction System in Hemerocallis spp.
CAODong- mei，KANGLi- fang，ZHAOYan，ZHANGChao，DUAN Jiu- ju，WANGYun- shan
（Institute of Horticulture，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）
Abstract：Inter- simple sequence repeat（ISSR）method was applied to detect inter- and intra- specific genetic variation, and
better reveal genetic relationship and genetic diversity. The factors which affect the inter- simple sequence repeat（ISSR）analysis
were studied through 5 daylily cultivars. The optimal ISSR- PCR reaction conditions for daylily were established as follows: in a
volume of 20 μL containing 2 μL 10×buffer, 0.2 mmol/L dNTP, 1.5 mmol/L Mg2+, 0.5 mmol/L primer, 10.002 nkat Taq DNA
polymerase, and 20 ng template DNA. The optimal amplified procedure was as follows: after a pre- denaturing of 5 min at 94 ℃,
40 cycles were performed with denaturing of 40 s at 94℃, annealing of 45 s at 50℃, extension of 1.5 min at 72℃, a final exten-
sion of 10 min at 72℃. The clear and stable amplified bands might be obtained with the above ISSR- PCR reaction conditions.
Key words：Hemerocallis spp.; ISSR- PCR; the optimal reaction system
收稿日期：2011- 09- 09
基金项目：山西省科技攻关项目（20110311017- 2；20080311010- 1）
作者简介：曹冬梅（1971-），女，山西应县人，研究员，博士，主要从事园林植物生物技术研究工作。王云山为通讯作者。
doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2011.12.01
ISSR（Inter- simple sequence repeat）技术是
1994年由加拿大蒙特利尔大学的 Zietkiewicz等
提出的，是建立在 PCR技术上的一种分子标记
技术。该技术具有操作简单、成本低、条件稳定、
快速、灵敏、检测多态能力强、所需 DNA模板量
少等优点，目前已被广泛应用于植物品种鉴定、
遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生
态学研究[1]。ISSR标记能产生丰富的多态性位点，
从而可以揭示出种间、种内遗传变异情况，更好
地揭示亲缘关系和遗传多样性[2]。
萱草属（Hemerocallis spp.）植物是百合科多
年生宿根草本花卉，其花色艳丽，适应性强，在国
内外园林绿化方面颇受欢迎。国内外在大花萱草
种质资源创新方面已进行了大量研究工作[3- 11]。
我国萱草种质资源丰富，共分布有 11个种，
占世界总种数的绝大部分[12]，但我国在萱草育种
的研究领域相对落后，多数品种引种于国外[12]。
针对这一现状，培育我国自主萱草品种刻不容
缓，为了使萱草属的育种工作能有一个新的突
破，必须利用新的种质资源，因此，深入探讨萱草
种质资源的遗传背景、评价其遗传多样性具有重
要意义。建立萱草属部分种及栽培品种的 ISSR
标记指纹图谱，可望从分子水平进一步揭示现代
栽培萱草品种的遗传多样性、亲缘关系和遗传差
异，为阐明萱草的起源演化关系，解决萱草分类
学上存在的分歧、萱草品种分类及为今后新品种
保护、鉴定、登录奠定分子水平的基础。
本研究以萱草属植物为材料，对影响 ISSR-
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PCR反应的各项因素进行了筛选，旨在建立适合
萱草属植物的 ISSR- PCR最佳反应体系，为进一
步利用 ISSR标记研究大花萱草的遗传多样性奠
定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料为萱草属金娃娃、香宝、红运、香妃
和金针等品种，均采自山西省农业科学院园艺研
究所花卉中心试验田。取植株幼嫩叶片，低温条
件下带回实验室备用。
Taq酶，dNTPs，100 bp DNAMarker均采用大
连 Takaer生物工程有限公司生产的产品。CTAB，
PVP，β- 巯基乙醇，琼脂糖等均为国产分析纯试
剂。引物由 Takaer生物工程有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取及检测 采用 CTAB法提取
DNA[13]。用 0.8％琼脂糖凝胶（含 EB）电泳检测
DNA质量，同时取稀释液 200μL在紫外分光光
度计上测定 OD230，OD260，OD280的值，根据 OD260
值估测 DNA浓度（1 OD260≈50μg/μL），根据
OD260/OD280与 OD260/OD230估测其纯度。样品存放
于 - 20 ℃冰箱中备用，用时将样品稀释为 10
ng/μL，用于 ISSR反应条件优化试验。
1.2.2 大花萱草 ISSR反应体系优化 首先本试
验以 UBC843引物为主，对影响萱草 ISSR反应
的主要因素——Taq 酶，Mg2+，dNTPs，DNA模板
量，引物浓度进行试验（表 1）。试验中，除了所试
验的成分改变外，其他成分都保持不变，在 20μL
基本反应体系中含有的成分这：Taq 10.002 nkat，
2μL 10×buffer，0.2 mmol/L dNTP，0.5 mmol/L引
物，30 ng DNA模板，1.5 mmol/LMg2+，最后加双蒸
水补足。
表 1 试验用反应成分与反应浓度
4
40
45
5
50
反应成分
Taq酶 /nkat
Mg2+/（mmol/L）
dNTPs/（mmol/L）
引物 /（mmol/L）
模板 DNA/ng
循环次数
1
8.335
1.3
0.1
0.4
10
30
2
10.002
1.5
0.2
0.5
20
35
3
11.669
1.8
0.3
0.6
30
40
浓度梯度
1.2.3 退火温度的选择 在单因素筛选确定反
应条件后，设置退火温度为 40，45，50，55℃进行
梯度退火试验，选择最佳条带的温度条件。
1.2.4 反应产物的电泳与检测 用 2％琼脂糖
凝胶（含 EB），电泳缓冲液为 0.5×TBE，电泳电
场强度为 4 V/cm2，2 h，100 bp Marker进行分子量
标记，用紫外凝胶成像系统、Quanity One软件观
察并照相、记录。每次试验至少重复 2遍，仅记录
和分析重复出现的条带。
2 结果与分析
2.1 Taq酶浓度对 ISSR-PCR 反应的影响
Taq DNA聚合酶的浓度是影响 PCR反应的
重要因素。酶浓度过高可引起非特异性扩增，产
生弥散带，背景加重；浓度过低则会使合成产物
量减少，因此，选择适合的酶浓度，对 PCR反应
至关重要。本试验在 20μL反应体系中分别加
入 3个不同浓度梯度的 Taq DNA聚合酶，图 1
结果显示，3个浓度梯度的 Taq DNA聚合酶对扩
增条带的数量及清晰度没有太大的影响，这可能
是因为试验所设梯度太小，不足以影响扩增效
果。本试验最后每 20 μL体系加 10.002 nkat
Taq DNA聚合酶。
2.2 Mg2+浓度对 ISSR-PCR 反应的影响
Mg2+浓度对 ISSR- PCR 反应的特异性及产
量有显著影响，一般以 1.5～2.0 mmol/L为好，浓
度过高，反应特异性降低；浓度过低，产物减少。
一般地，在一定的浓度范围内，随着 Mg2+浓度的
增高，扩增的特异性减弱，但扩增的谱带数增加。
从图 2可以看出，Mg2+浓度在 1.5 mmol/L时所扩
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曹冬梅等：大花萱草 ISSR- PCR最佳反应体系的建立
增的谱带数目最多，条带清晰且效果稳定，而其
他浓度梯度的扩增效果相对较差，因此，最终选
择Mg2+浓度为 1.5 mmol/L。
2.3 dNTP浓度对 ISSR-PCR 反应的影响
试验设计 3个 dNTP浓度梯度，在 0.2mmol/L
时能扩增出清晰谱带；低于或高于 0.2 mmol/L
时，出现条带微弱、条带丢失现象（图 3）。因此，
选择 0.2 mmol/L的 dNTP作为最佳试验浓度。
2.4 引物浓度对 ISSR-PCR 反应的影响
引物是 PCR特异性反应的关键，PCR 产物
的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度。
引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可
增加引物之间形成二聚体的机会。本试验中，当
引物浓度为 0.5 mmol/L时，扩增效率较高，谱带
全面、稳定，无特异性谱带；引物浓度过低时，与
模板配对结合量过少，得到的产物不足，谱带较
弱（图 4）。
2.5 模板浓度对 ISSR-PCR 反应的影响
模板核酸的量与纯化程度是 PCR成败与否
的关键环节之一。由图 5可知，20 ng的 DNA扩
增产物条带清晰，无特异性扩增，容易判读。随着
DNA浓度的升高，个别模板出现无扩增产物的
现象，因此，20 ng的模板为大花萱草 ISSR- PCR
反应的最佳模板量。
2.6 循环次数对 ISSR-PCR 反应的影响
PCR的循环次数影响着 PCR的产量，次数
太少，产物量极低；次数太多，进入到反应平台期
后，PCR产物也不会有明显的增加，反而会引起
非特异性扩增。本次试验设了 5个循环梯度，即
30，35，40，45，50次（图 6）。4个循环次数基本上
都能扩增出条带，30和 35次的 PCR产物量少，
清晰度不高；40和 45次的 PCR产物量较 30和
35次的扩增产物量高，条带清晰度高。循环时间
长会影响 Taq酶的活性，所以，选择 40次循环作
为大花萱草 ISSR- PCR反应的最佳循环次数。
2.7 退火温度的选择
在 PCR反应中，退火温度的高低会直接影响
引物与模板 DNA特异性结合。退火温度为 40℃
时，特异性比较差，且有些主带不明显甚至扩增
不出；50℃时扩增产物清晰，特异性强，主带清
晰且多态性高，条带也比较亮（图 7），因此，确定
引物 UBC843的最佳退火温度为 50℃，其他引
物也得到类似的结果。
2.8 ISSR反应体系稳定性的检测
选择 4 条引物（UBC855，UBC836，UBC856，
UBC858）5个样品的 DNA对优化好的 PCR反应
体系稳定性进行检测，结果如图 8所示。所选的
4条引物 5个样品都能扩增出比较理想的结果，
表明优化的大花萱草 ISSR- PCR 反应体系是比
较稳定可靠的。
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3 讨论
本试验建立了大花萱草 ISSR- PCR 反应体
系，在 20μL优化体系中含有 10.002 nkat Taq
DNA聚合酶，2μL 10×buffer，0.2 mmol/L dNTP，
0.5 mmol/L 引物，20 ng DNA 模板，1.5 mmol/L
Mg2+。扩增条件为：94℃预变性 5 min；94℃变性
40 s，50℃退火 45 s，72℃延伸 1.5 min，共 40个
循环，72℃完全延伸 10 min。本研究与朱云华建
立的萱草体系有较多的不同之处[14]，这可能是因
为单因素设计在确定每个因素的最佳浓度时不
涉及因素间的互作效应，同时每个人在拟定因素
水平时有差异；另外，可能大花萱草不同种也有
不同最佳浓度。
在影响 ISSR- PCR 扩增结果的因素中，Taq
DNA聚合酶为主要因素，且酶对Mg2+浓度非常
敏感，二者定量配合使用十分关键[14- 15]，不同的公
司或不同批次的产品常有很大差异，由于酶的浓
度对 PCR反应影响极大，因此，需进行一定的探
索性试验，找出适合试验的用量，本研究体系中
以 10.002 nkat为最佳用量。另外，Mg2+浓度不仅
可直接影响酶活性的发挥，还能与反应液中的
dNTPs、模板 DNA及引物结合，从而影响引物与
模板的结合效率、模板与产物的解链温度以及产
物的特异性和引物二聚体的形成[16]。本试验采用
的Mg2+浓度为 1.5 mmol/L。
退火温度是影响 PCR 特异性较重要的因
素。变性后温度快速冷却至 40～60℃，可使引物
和模板结合。由于模板 DNA比引物复杂得多，引
物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互
补链之间的碰撞。退火温度与时间取决于引物的
长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
不同引物退火温度不同，本试验对所用引物最佳
退火温度进行探索，旨在保证扩增条带清晰、多
态性好，客观反映萱草的多样性。
高浓度 dNTP可能会引起非特异性扩增；但
浓度过低，将会降低反应产物的产量。另外，
dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作
用的Mg2+浓度。
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