全 文 ：萱草 ISSR-PCR最佳反应体系的建立
黎海利 , 董丽＊ , 谭飞理　(北京林业大学国家花卉工程研究中心 ,北京 100083)
摘要　[目的]为利用 ISSR标记研究萱草的遗传多样性和和辅助育种奠定基础。[方法]从萱草中提取基因组DNA , 建立萱草的 ISSR-
PCR反应体系 ,并通过正交试验对其进行优化。[结果]萱草的最佳 ISSR-PCR反应体系为:ddH2O 16.8μl、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μl、10×
buffer 2.5μl、10μmol/LPrimer 0.3μl、50 ng/ LDNA 3μl、Taq 酶1 U ,总体积 25μl。萱草的最佳 ISSR扩增反应程序为:94 ℃变性5 min , 94 ℃
变性 45 s、48.3 ℃退火 1min、72 ℃延伸 2min ,共 38个循环 ,最后 72 ℃延伸 7min。该反应程序下进行的 ISSR扩增 ,扩增产物最多 ,银染的
效果最好。[结论]该研究建立了萱草 ISSR-PCR的最佳反应体系和反应程序 ,通过 ISSR扩增可获得清晰 、稳定的条带。
关键词　萱草;ISSR;最佳反应体系
中图分类号　S682.1+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)12-04884-02
Establishment of theOptimum Reaction System for ISSR-PCR of Hemerocallis fulva L.
LI Hai-li et al　(National Research Center of Floriculture Engineering , Beijing Forestry University , Beijing 100083)
Abstract　[Objective] The research aimed to lay the foundation for studying the genetic diversity and the assistant breeding of Hemerocallis fulva L.by
using ISSRmarkers.[ Method] The genomic DNA was extracted from H.fulva.ISSR-PCR reaction system of H.fulva was established and optimized in
the orthogonal test.[ Result] The optimum reaction system for ISSR-PCR of H.fulva was as follows:ddH2O 16.8μl , 2.5 mmol/L dNTP 2.0 μl , 10×
buffer 2.5μl , 10μmol/L Primer 0.3μl , 50 ng/LDNA 3μl , Taq enzyme1U , with the total volume of 25 ul.The optimum reaction procedure for ISSR am-
plification of H.fulva was as follows:denaturation for 5 min at 94 ℃, 30 cycles of denaturation for 45 s at 94 ℃, anneal for 1 min at 48.3 ℃、extension
for 2 min at 72 ℃, finally extension for 7 min at 72 ℃.Through ISSR amplification under this reaction procedure , the amplified products were most and
the sliver-staining effect was best.[Conclusion] The optimum reaction system and reaction procedure for ISSR-PCR of H.fulva was established in this
research and clear and stable bands could be obtained though ISSR amplification.
Key words　 Hemerocallis fulva L.;ISSR;Optimum reaction system
基金项目　国家林业局 948项目[ 2002-08(2)] 。
作者简介　黎海利(1981-),女 ,广西宜州人 ,博士研究生, 研究方向:
园林植物与观赏园艺。 ＊通讯作者 ,博士生导师 ,教授。
收稿日期　2008-02-27
　　ISSR标记技术是Zietkiewicz于 1994年提出的 ,该技术具
有操作简单 、成本低 、条件稳定 、快速 、灵敏 、检测多态能力
强 、所需 DNA模板量少等优点 ,目前已广泛用于植物品种鉴
定 、遗传作图 、基因定位 、遗传多样性 、进化及分子生态学
研究[ 1] 。
萱草花色艳丽 、适应性强 ,在园林绿化中极受欢迎 ,而我
国萱草的育种相对落后 ,大部分品种引自国外。培育具有自
主知识产权的萱草品种成为当务之急 ,而揭示萱草的遗传背
景是育种的重要前提。国内用分子标记对萱草进行遗传多
样性分析的研究较少 ,笔者试图建立适合萱草的 ISSR-PCR
反应体系 ,为萱草 ISSR标记进行遗传多样性分析 、揭示亲缘
关系 、研究萱草属植物分类和系统发育 、种质资源的开发利
用及辅助育种等奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料　栽培品种 Hemerocallis `Holiday Delight 、` All
American Baby 、` Purple Waters ,取新鲜叶片 ,以上品种来自
北京植物园种苗繁育基地。
1.2　DNA的提取及检测　用天根公司植物基因组 DNA提
取试剂盒(DP305)进行 DNA的提取。DNA的检测用 0.8%琼
脂糖凝胶 ,电泳缓冲液 1×TAE ,上样量 7μl ,电压80V , 1h ,最
后在Gel Doc2000TM型凝胶成相系统上拍照 ,用Quatity One系
统软件进行处理分析 。
1.3　ISSR扩增体系的建立及优化　用于 ISSR-PCR反应的
Taq 酶(500 U)购自泽星公司 , dNTP(2.5 mmol/L each)购自天
根公司 , ISSR引物由奥科公司合成(参考哥伦比亚大学引
物[ 2])。经初步筛选出的引物[ UBC864 ,即(ATG)5]作为此次
正交试验的固定引物 ,标准分子量(Marker)100 bp ladder 购自
天根公司 ,模板DNA稀释为 50 ng/L。
为确定PCR反应中各因素的最佳水平 ,采用正交设计
L9(34)对萱草 ISSR-PCR反应体系的4因素 3水平进行优化试
验(表 1)。
1.4　PCR产物的检测　产物中加入 5 μl Loading buffer , 95 ℃
变性 10 min后立即置于冰浴中待用 ,取 6 μl变性产物在 6%
变性聚丙烯酰胺上电泳 ,预电泳电压 2 000 V ,恒定功率 100
W约 30min ,70 W电泳 1.5 h ,电泳结束后 ,对胶板进行固定 、
脱色 、水洗 、银染 、冲洗 、显影 、定影 、干燥等银染程序。
表1　PCR正交设计
Table 1 The orthogonal design for PCR
编号
No.
Taq E∥U
Taq DNA
polymerase
DNA∥μl
DNA template
dNTP∥μl 引物∥μl
Primer
1 0.5 1.0 1.0 0.3
2 0.5 2.0 1.5 0.4
3 0.5 3.0 2.0 0.5
4 1.0 1.0 1.5 0.5
5 1.0 2.0 2.0 0.3
6 1.0 3.0 1.0 0.4
7 1.5 1.0 2.0 0.3
8 1.5 2.0 1.5 0.5
9 1.5 3.0 1.0 0.4
2　结果与分析
2.1　最佳体系(25 μl)　试验表明 ,PCR各成分分别为 ddH2O
16.8μl ,dNTP(2.5 mmol/L each)2.0μl ,10×buffer 2.5μl ,Primer
(10μmol/L)0.3μl ,DNA(50 ng/L)3μl , TaqE 1U时所获取的条
带最清晰 ,亮度最大 ,条带数量多。其余均出现不同程度的
拖带及条带不清晰现象。
2.2　最佳退火温度的确定　对萱草 ISSR-PCR最佳反应体系
进行梯度退火 ,得到最佳退火温度为 48.3 ℃。此时得到的
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008 , 36(12):4884-4885　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　罗芸　责任校对　李洪
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.12.117
扩增产物量大 ,电泳后的条带多 ,整齐。
2.3　ISSR扩增反应程序　94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 45
s ,48.3 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸 2 min ,38个循环;72 ℃延伸 7
min。此程序下进行的扩增 ,产物最多 ,银染效果最好 。
3　讨论
模板 DNA的质量与浓度是试验成败的关键之一 ,该试
验采用DNA 浓度为 150 ng/25μl ,可取得较理想的结果。
Taq DNA聚合酶是PCR反应中不可缺少的 ,浓度过高会
引起非特异性扩增 ,过低则合成产物量减少 ,一般用量为每
25 μl 0.5 ～ 2.5 U ,但不同公司或不同批次的产品常有很大差
异 ,由于酶的浓度对 PCR反应影响极大 ,因此需进行一定的
探索性试验 ,找出适合试验的用量 ,该体系中以 1 U为最佳
用量。
引物是PCR特异性反应的关键 ,PCR产物的特异性取决
于引物与模板 DNA 互补的程度。要保证PCR反应能准确 、
特异 、有效地对模板 DNA进行扩增 ,试验要选出与试验材料
对应的引物进行有效扩增 ,试验初步选出引物 UBC864 ,另
外 ,ISSR分析应选出更多的引物 ,揭示物种的遗传多样性。
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温
度快速冷却至 40～ 60 ℃,可使引物和模板发生结合。由于
模板DNA比引物复杂得多 ,引物和模板之间的碰撞结合机
会远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间取决于
引物的长度 、碱基组成及其浓度 ,还有靶基因序列的长度。
不同引物退火温度不同 ,该试验所用引物 UBC864 的最佳退
火温度为 48.3 ℃,时间为 1 min。
Mg2+浓度对反应的特异性及产量有显著影响。一般以
1.5～ 2.0 mmol/L为好 ,浓度过高 ,反应特异性降低;浓度过
低 ,产物减少。10×Buffer 一般随 Taq DNA聚合酶供应 。该
试验直接采用 Taq DNA聚合酶供应的缓冲液就能满足要求 ,
提高了试验效率。
高浓度 dNTP易产生错误掺入 ,过高则可能引起非特异
性扩增;但浓度过低 ,将降低反应产物的产量。dNTP能与
Mg2+结合 ,使游离的Mg2+浓度降低。因此 , dNTP 的浓度直
接影响到在反应中起重要作用的Mg2+浓度 。
利用正交设计方案 ,初步建立了萱草 ISSR标记的 PCR
反应体系。这一反应体系受各种因素的影响 ,包括 DNA的
浓度 、Taq 酶的用量 、dNTP浓度 、引物 、退火温度 、扩增循环的
周期数等 ,均会影响扩增产物的数量和质量 。因此要优化反
应体系和反应程序 ,增强试验的可重复性。该试验为萱草建
立最佳反应体系和反应程序 ,能对萱草进行有效的 ISSR扩
增 ,获得清晰稳定的条带以及为萱草的相关分子研究打下
基础 。
参考文献
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出版社, 2005:145.
(上接第 4835页)
(Pa.S)对标准浓度(μg/ml)进行线性回归 ,得到线性回归方程
和相关系数 。
在样品中加入 10种农药混合标准溶液 ,使样品中添加
农药标准样品的浓度为 0.01 mg/kg ,然后按“1.2.2”条件处理
样品 ,以 DB-17获得的色谱图按信噪比 3倍条件计算方法检
出限。10种有机磷农药保留时间 、线性回归方程 、相关系数
及方法检出限测定结果见表 1 。
表 2　有机磷农药回收率测定结果
Table 2 Recovery test for organophosphorus pesticides
农药
Pesticide
添加水平 0.05
Addition level
平均值
Mean
RSD
添加水平0.10
Addition level
平均值
Mean
RSD
添加水平 0.50
Addition level
平均值
Mean
RSD
乐果 112.60 　4.27 116.88 2.26 110.50 5.20
敌敌畏 90.13 5.74 96.23 2.97 95.33 5.38
对硫磷 98.52 6.07 97.95 3.80 102.50 4.21
甲拌磷 89.02 10.99 97.00 1.48 98.49 2.00
倍硫磷 110.00 10.69 100.60 0.98 101.20 3.20
乙酰甲胺磷 98.20 10.27 111.20 4.41 98.98 5.33
甲胺磷 94.36 4.22 101.60 8.13 92.51 7.21
久效磷 110.00 3.75 109.30 7.20 107.50 9.02
甲基对硫磷 104.10 1.50 112.90 4.67 109.44 5.00
喹硫磷 87.18 5.74 101.80 5.08 103.30 4.98
　注:添加水平单位均为mg/ kg(n=3)。
Note:Units of addition level are all mg/ kg(n=3).
2.2　10种有机磷农药在水果中回收率的测定　在苹果等样
品中添加标准工作液 ,添加水平分别为 0.05、0.10、0.50
mg/kg ,充分混匀放置 0.5 h 后按“1.2.2”步骤进行测定 。每
个添加水平测定 3次(表 2)。
由表 2可知 ,添加水平 0.05、0.10、0.50 mg/kg的 3次平
行测定的回收率为 87.18%～ 116.88%,变异系数为 0.98%～
10.99%,说明该试验方法具有较好的准确度和精确度。为了
得到较好的回收率 ,氮气浓缩乙腈是关键 ,最好不要完全吹
干 ,还剩 2～ 3滴乙腈时即取出 ,使剩余乙腈在室温下自然挥
发掉 。如果完全吹干或吹干一段时间后再取出 ,对测定回收
率有影响 ,特别对测定敌敌畏 、甲拌磷的回收率影响较大 ,使
其测定值偏低 。
3　结论
试验结果表明 ,采用乙腈提取 ,气相色谱法测定水果中
有机磷农药残留量的方法 ,试剂用量少 ,分析速度快 ,操作简
便 ,特别适合批量样品的检测分析。
参考文献
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488536卷 12期　　　　　　　　　　　　　　　　黎海利等　萱草 ISSR-PCR最佳反应体系的建立