全 文 ：云南大学学报 (自然科学版 ), 2008, 30 (S2):398 ～ 402 CN53-1045/N　ISSN 0258-7971
JournalofYunnanUniversity
基于 ISSR的披针莲座蕨居群遗传多样性分析＊
王　玲 1, 2 , 和兆荣 1
(1.云南大学 生命科学学院生态学与地植物学研究所 ,云南 昆明　650091;2.信阳师范学院 生命科学学院 , 河南 信阳　464000)
摘要:采用 ISSR分子标记对披针莲座蕨的 6个自然居群 97个样品进行了 DNA多态性分析.从 38个随机
引物中筛选出 11个有效引物 , 扩增共产生 81条 DNA片段 ,其中 79条为多态性条带 ,多态位点百分比(PPB)
为 97.5%.与其他蕨类植物相比 , 披针莲座蕨居群遗传多样性水平较高.居群遗传关系聚类结果与各居群的地
理分布基本一致.
关键词:披针莲座蕨;ISSR;遗传多样性
中图分类号:Q949.366.3　　文献标识码:A　　文章编号:0258-7971(2008)S2-0398-05
　　莲座蕨科(Angiopteridaceae)属厚囊蕨纲(Eus-
porangiopsida)莲座蕨目(Maratiales),共 3属 ,分布
于亚洲热带和亚热带以及南太平洋诸群岛.我国有
莲座蕨属 (AngiopterisHofm.)和原始莲座蕨属
(ArchangiopterisChristetGies.)2个属.该科约
90%的种类为莲座蕨属植物 ,云南为莲座蕨属植物
主要分布区 [ 1, 2] .
披针莲座蕨 (AngiopteriscaudatiformisHieron)
分布于我国云南省和东南亚缅甸 、越南等邻国 ,野
外调查发现该种莲座蕨在云南境内西双版纳州分
布广泛 、形态变异显著 ,常为群落草本层优势种 ,分
布海拔范围为 350 ～ 1 200 m.此外 ,披针莲座蕨生
境多样 ,有杂木林 、常绿阔叶林 、沟谷雨林 、林缘农
田沟边等多种生境.形态变异显著 、分布范围广 、生
境多样均表明披针莲座蕨是开展居群遗传多样性
研究极好的材料.
本实验借助有效的遗传多样性检测技术和遗
传变异评估方法 ,利用 ISSRDNA分子标记方法对
披针莲座蕨自然居群遗传多样性进行研究 ,最终目
的是为了探明披针莲座蕨遗传多样性水平及其遗
传结构 ,为与该种植物相关的自然保护工作积累资
料.
1　材料和方法
1.1　材料　实验材料 2005年 6 ～ 7月采自云南南
部西双版纳州(表 1),共 6个居群 ,随机采集较嫩
的新鲜叶片 ,每一居群采 15 ～ 25个个体的叶片 ,为
了避免采集同一克隆的叶片 ,被采集的相邻植株之
间的距离大于 2m,凭证标本均收藏于 PYU.
将采集的叶片放入装有适量硅胶的封边塑料
袋中 ,室温下密封保存 ,定时检查 、更换袋中的硅
胶 ,叶片干燥后放入 -20℃冰箱冷冻保存.
本实验选取河口原始莲座蕨 (Archangiopteris
hokouensisChing)作为外类群.
1.2　方法
1.2.1　DNA的提取和扩增　DNA的提取采用改
进的 CTAB法 [ 3, 4] .PCR反应在 eppendofgradient
PCR上进行 ,按优化的反应体系和反应条件进行
扩增:本实验反应体系总体积为 25 μL,各成分的
终浓度分别为 , 模板 DNA32 ng/μL, Tag聚合酶
2U, dNTP0.2mmol/L,引物 1.3mmol/L, Mg2 + 1.5
mmol/L.扩增程序为:94 ℃, 5 min, 38个循环;94
℃, 45 s;48 ～ 58 ℃, 1 min;72 ℃, 1 min;72 ℃, 5
min, 4℃保存.PCR产物用 1.5%(含 0.5%的 EB)
＊ 收稿日期:2008-11-10
　基金资助:国家自然科学基金资助项目(30260011;O301321411).
　作者简介:王　玲 1980-　),女 ,河南人 ,讲师 ,主要从事蕨类植物系统学方面的研究.
　通讯作者:和兆荣 ,副教授 ,主要从事蕨类植物系统学方面的研究 , E-mail:zhrhe@ynu.edu.cn.
的琼脂糖凝胶电泳检测 , 70 V恒压电泳 150 min
后 ,用 UV凝胶成像系统照相(英国生产).
1.2.2　引物筛选　本实验共选用了 38个引物 ,依
据扩增结果 ,筛选出了扩增效果良好的 11个引物 ,
其序列见表 2.
1.2.3　统计分析　每个样品的扩增带按有或无记
录.“有 ”带赋值为 1 , “无 ”带赋值为 0.POPGENE
Version软件进行遗传参数分析 ,分别计算了:多态
位点百分比(PPB),多样性指数(I)、观测等位基因
数(Ao)、有效等位基因数(Ae)、Nei基因多样性指
数(H)、居群总基因多样性(Ht)、居群内基因多样
性 (Hs)、居群间基因分化指数 (Gst)、基因流
(Nm)、Nei遗传一致度 (I)和遗传距离(D),再根
据遗传距离 ,利用 Mega3软件 ,采用 UPGMA法构
建居群遗传关系聚类图.
2　结果及讨论
11个引物在 7个居群 107个个体中扩增产生
了 81条可统计的条带 ,其中多态性条带共 79条 ,
PPB值为 97.5%.在各居群中 , PPB最高的是 P3
和 P4,最低的是 P2, P6和 P7.香农 -威纳指数指
数统计也得出了相似的结果:在各居群中 , P3和
P4的香农 -威纳指数值最大 ,为 36.3%和 35.6%,
香农 -威纳指数值最小的是 P6,为 30.6%,其次是
P5, P2, P7和 P1,分别为 30.6%, 31.7%, 33.2%和
33.4%.
表 1　实验材料及来源
Tab.1 Materialsandvouchers
居群编号 种 凭证标本
P1 Angiopteriscaudatiformis 和兆荣等 2005-9
P2 Angiopteriscaudatiformis 和兆荣等 2005-22
P3 Angiopteriscaudatiformis 和兆荣等 2005-34
P4 Angiopteriscaudatiformis 和兆荣等 2005-46
P5 Angiopteriscaudatiformis 和兆荣等 2005-48
P6 Angiopteriscaudatiformis 和兆荣等 2005-53
P7 Archangiopterishokouensis 和兆荣等 2005-66
表 2　11个引物的序列及其扩增结果
Tab.2SequencesofprimersandresultsofPCRamplification
引物 碱基序列 总带数 多态性带 多态性百分率 /%
AW23634 ACTGACTGACTGACTG 9 9 100
AW23639 CACACACACACAGG 7 7 100
W47059A CTCTCTCTCTCTCTCTAC 7 7 100
W47060A AGAAGAAGAAGAAGAAGA 7 7 100
W47061A CTCCTCCTCCTCGC 10 10 100
AW12850 CCAGAGGAGGAGGAG 4 4 100
W47062A GAGGAGGAGGAGGC 11 11 100
AW58066 GAGAGAGAGAGAGAGACTG 6 5 83.3
AW63571 GGGTGGGGTGGGGTG 6 6 100
AW63574 GAAGAAGAAGAAGAAGAA 7 6 85.7
AW12853 GAGAGAGAGAGAGAC 7 7 100
399第 S2期　　　　　　　　　　　王　玲等:基于 ISSR的披针莲座蕨居群遗传多样性分析
　　在对披针莲座蕨 7个居群的遗传多态性研究
中 ,基于条带表型频率的 Shannon多样性指数 (香
农 -威纳指数 , I)和基于 Hardy-Weinberg假设的
Nei基因多样性指数(H)(表 3)的计算获得了一致
的结果 ,各居群遗传变异从高到低的排序是 P3﹥
P4﹥ P1﹥ P2﹥ P5﹥ P6,多态位点百分率(PPB)
的计算结果稍有不同 , P3 , P4﹥ P5﹥ P1﹥ P2,
P6.
在所有居群中 , P3, P4的遗传多样性水平最高
(PPB为 75.3%, I为 36.3%, 35.6%, H为 0.24,
0.23), P1, P2次之(PPB为 69.1%, 65.4%, I为
33.4%, 31.7%, H为 0.22 , 0.21), P6, P5的遗传
多样性最低 (PPB为 65.4%, I为 30.6%, H为
0.20).作者实地考察发现 ,所有居群的生境均受
到不同程度的破坏.遗传多样性最高的 P3和 P4,
采自西双版纳植物园内 ,生境保护得最好 ,人为破
坏程度最低 ,并且居群内多是幼苗 ,成株相对较少;
P1和 P2采自雨林下的箐沟内 ,采集地植被相对较
好 ,但也已有少量人为活动 ,林下种植了大量的砂
仁 ,生境破坏较轻 ,并且幼苗比成株多;P6和 P5采
自公路边的小沟和林下 ,附近有居民居住 ,每天有
大量的人畜活动 ,生境破坏严重 ,植株仅生长在阳
光充足潮湿的地方 ,相对于其它居群成株较多 ,可
能是由于生境的破坏 , 其系统发育中的某个环节
(如配子体发育或小孢子体发育)可能受到影响 ,
进而更新出现了问题.很多物种的遗传多样性研究
结果表明 ,物种生境的破坏 ,不仅缩小了物种适宜
的生存环境 ,而且增加了相近个体的交配机会 ,这
可能是导致种群灭绝和遗传变异丢失的重要原因.
因此 ,对披针莲座蕨居群来说 ,遗传多样性的降低 ,
生境的破坏很可能是一个非常重要的因素.
居群的遗传结构分析包括居群总的遗传多样
性(Ht)、居群内遗传多样性(Hs)、居群间遗传分化
指数(Gst)、基因流(Nm)等指标.
披针莲座蕨总的遗传多样性(Ht)为 0.27 ,居
群内的遗传多样性(Hs)为 0.22,表明主要的遗传
多样性存在于居群内.根据总的遗传多样性(Ht)
和居群内的遗传多样性(Hs)计算不同群体间的遗
传分化系数(Gst).所分析的 7个披针莲座蕨居群
间的 Gst为 0.18,即表明总的遗传变异中 18%的
变异存在于居群间 , 82%来自于居群内 ,进一步说
明了居群内的遗传变异水平较高(表 4).
居群间每代个体的基因流为 2.22.据报道 ,基
因流(Nm)在许多稀有植物中较低 ,有时甚至缺少
基因流.低的基因流导致物种居群间分化加大.在
本研究中 , Nm为 2.22,高于每代连续迁移的植物
物种的基因流 ,表明 2种可能性的存在 ,一是取样
不合理导致实验结果出现偏差 ,既由于取样不充
分 、不全面而使实验结果未能充分反映出披针莲座
蕨客观 、真实的遗传多样性水平;二是披针莲座蕨
居群间基因流动频繁 ,未受到限制 ,从而导致居群
间遗传多样性较低.
表 3　各居群遗传多样性分析(I, PPB, Ao, Ae和 H)
Tab.3Geneticdiversityanalysisofpopulation
居群编号 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 总计
样本数 15 13 17 19 16 17 10 107
PPB/% 69.1 65.4 75.3 75.3 70.4 65.4 65.4 97.5
平均 I/% 33.4 31.7 36.3 35.6 30.6 30.6 33.2 40.6
St.Dev 0.271 9 0.270 2 0.261 3 0.259 1 0.260 0 0.271 8 0.273 3 0.212 3
Ao 1.69 1.65 1.75 1.75 1.70 1.65 1.65 1.99
St.Dev 0.464 8 0.478 1 0.433 9 0.433 9 0.459 5 0.478 6 0.478 6 0.111 1
Ae 1.37 1.34 1.40 1.38 1.32 1.33 1.37 1.42
St.Dev 0.311 4 0.344 9 0.368 0 0.345 1 0.342 8 0.357 8 0.354 9 0.330 6
H 0.22 0.21 0.24 0.23 0.20 0.20 0.22 0.26
St.Dev 0.193 6 0.188 7 0.188 3 0.184 2 0.184 4 0.191 9 0.191 4 0.163 7
400 云南大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 30卷
表 4　各居群遗传结构
Tab.4 Populationgeneticstructure
Ht Hs Hc Gct Gst H Nm I
平均 0.27 0.22 0.05 0.81 0.18 0.26 2.22 0.41
St.Dev 0.026 5 0.018 0
　　居群遗传结构分析表明 ,披针莲座蕨居群内已
出现了一定程度的遗传分化 ,居群间的遗传分化较
小.
为了进一步分析居群之间的遗传分化程度 ,计
算了 Nei遗传距离(D)和相似系数 (I),披针莲座
蕨各居群间 Nei遗传距离(D)和相似系数(I)列于
表 5.7个群体间两两之间的 I值变化范围为
0.838 8 ～ 0.979 8,参考相关文献资料 ,发现该数值
高于植物居群间遗传相似系数平均值(0.90)[ 5] ,
即所采样的个体间均有着较高的遗传同质性.说明
本实验中的 6个居群在历史上可能是连续分布的
一个居群 ,但是由于近年来环境的片段化或人为的
破坏等因素 ,形成了几个不连续分布的居群[ 6]
图 1为根据 Nei s遗传距离 ,利用 UPGMA法
所构建的居群遗传关系聚类图.此聚类图显示:L7
个群体中 , P1和 P2两个群体亲缘关系最近 ,最先
聚合为 1支 ,接着与 P4聚位 1支 ,然后再和 P3聚
成 1大支 ,这 1大支再与 P5聚成 1支 , P6和其它
居群间的亲缘关系最远 ,最后才与其它居群聚在一
起.这个顺序反映了 P1和 P2之间亲缘关系最近 ,
依次和 P4, P3, P5, P6亲缘关系依次变远 ,外类群
与各居群间的亲缘关系最远.聚成一支的表明它们
有较近的亲缘关系.
披针莲座蕨 ISSR分子标记结果表明 ,与其他
广布的蕨类植物 , 如蜈蚣蕨 (P=0.578, H=
0.249)、华中铁角蕨(P=0.61 ～ 0.69)、荷叶铁线
蕨(P=0.357 ～ 0.500, H-0.199)等相比 ,披针莲
座蕨居群的遗传多样性水平较高.披针莲座蕨居群
遗传分化主要存在于居群内个体间 ,居群间遗传分
化较低.上述结果尚不能排除由于不同样地之间距
离过近而居群间频繁的基因流动造成实验结果失
真的可能.GUPMA聚类结果显示披针莲座蕨 6个
居群亲缘关系与其地理位置分布基本一致.
表 5　7个群体的 Neis(1978)遗传距离(左下角)和遗传一致度(右上角)
Tab.5 Neis(1978)originalmeasuresofgeneticidentity(abovediagonal)andgeneticdistance(belowdiagonal)
popID P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7
P1 — 0.990 7 0.974 2 0.976 5 0.967 2 0.963 8 0.864 6
P2 0.009 4 — 0.970 8 0.977 7 0.953 8 0.960 7 0.850 3
P3 0.026 1 0.029 6 — 0.967 5 0.969 5 0.9387 0.870 0
P4 0.023 8 0.022 6 0.033 0 — 0.969 9 0.969 7 0.877 2
P5 0.033 4 0.047 3 0.030 9 0.030 6 — 0.939 6 0.868 7
P6 0.036 9 0.040 1 0.063 3 0.030 8 0.062 3 — 0.863 7
P7 0.145 5 0.162 1 0.139 3 0.131 1 0.140 7 0.146 5 —
图 1　披针莲座蕨居群间 Neis遗传距离的 GUPMA聚类
Fig.1GUPMADendrogramofAngiopteriscaudatiformisandArchangiopterishokouensis
401第 S2期　　　　　　　　　　　王　玲等:基于 ISSR的披针莲座蕨居群遗传多样性分析
　　生物保护的最终目标是保证物种或居群的延
续以及维持物种的进化潜力 ,种内遗传多样性是物
种适应环境变化以及物种进化的基础 ,是物种避免
灭绝而长期生存的前提 ,对于物种保护具有重要意
义.披针莲座蕨居群内遗传多样性目前处于较高的
水平 ,有着适应当前环境变化的潜能.然而 ,由于人
类的活动以及其他物种的入侵 ,使得披针莲座蕨逐
渐失去了适生生境 ,种群数量及种群规模减小 ,因
此 ,对披针莲座蕨进行保护是十分必要的.
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AssesmentofgeneticvariationofAngiopteriscaudatiformisbasedonISSR
WANGLing1, 2 , HEZhao-Rong1
(1.InstituteofEcology＆Geobotany, SchoolofLifeScience, YunnanUniversity, Kunming650091, China;
2.SchoolofLifeScience, XinyangNormalColege, Xinyang464300, China)
Abstract:Angiopteriscaudatiformisgeneticvariationsof97individualsofsixpopulationsfromYunnanprov-
incewereassesedbyISSRfingerprinting.Elevenprimerswerescreenedfrom38 arbitraryprimers.Among81
DNAfragmentsamplified79 werepolymorphicbandswerescored, thepercentageofpolymorphicbands(PPB)
inthesixpopulationsofAngiopteriscaudatiformiswas97.5%, whichindicatedthathighlevelofgeneticvaria-
tionexistedinthenaturalpopμLation.Comparedtootherferns, geneticdiversityofAngiopteriscaudatiformisis
higher, andit sgeneticdiversitymainlyexistedindiferentindividualsofsamepopulations.UPGMAofsixpop-
ulationscorespondwiththeirgeographicdistributioncharacter, thepopulationswhichdistributecloselyformone
cladfirstlyonUPGMAmap.
Keywords:Angiopteriscaudatiformis;ISSR;geneticdiversity
402 云南大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 30卷