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[收稿日期] 2008-09-05
[ 基金项目] 国家自然科学基金(编号:30470193)　[ 作者简介] 孙颖桢 ,女 ,硕士 ,助教 ,电话:15162773776;E-mail:oisu nyz@163.com　[ 通讯
作者] 陈科力 ,男 ,教授 ,电话:027-62326589;E-mai l:k elichen@126.com
细叶卷柏双黄酮化合物对肝癌细胞 Bel-7402的抑制作用
孙颖桢1 , 2 ,陈科力2 ,殷丹2 ,徐嘉成2 　(1.紫琅职业技术学院生物技术系 , 江苏 南通 226002 , 2.湖北中医学院药学院 ,省
部共建中药资源和中药复方教育部重点实验室 , 湖北 武汉 430065)
[ 摘要] 　目的:研究细叶卷柏中双黄酮化合物可能的抗肿瘤作用 , 并阐明其作用机制。方法:培养人肝癌细胞 Bel-7402 , 观察
各组双黄酮化合物对肝癌细胞的形态改变;应用 MT T 法计算出各种样品不同浓度 、不同作用时间对细胞生长的抑制率 ,分析
其对癌细胞增殖的影响;用流式细胞术(FCM)检测其诱导癌细胞凋亡的能力。结果:发现细叶卷柏中 5 种(组)双黄酮化合
物对肝癌细胞有显著抑制作用 ,抑制强度与时间 、浓度呈正相关。流式细胞术检测发现诱导细胞凋亡是其抗癌机制之一。结
论:细叶卷柏中某些双黄酮类化合物可抑制 Bel-7402 细胞的生长 ,诱导其凋亡。
[ 关键词] 　细叶卷柏;双黄酮;抗肿瘤;四甲基偶氮唑蓝;流式细胞术
[中图分类号] R285.6　　[ 文献标识码] A　　[文章编号] 1001-5213(2009)14-1156-03
Inhibiting action of bisflavones from Selaginella labordei on Bel-7402 cells
SUN Ying-zheng1 , 2 , CHE Ke-li2 , YIN Dan2 , XU Jia-cheng2(1.Bio technology Depar tment , Zilang P ro fessiona l Col-
lege o f Technolgy , Jiang su Nantong , 226002 , China;2.Hubei Co llege of TCM , Key labo rato ry o f T raditional Chine se Medicine
Resource and Compound M inistr y o f Educa tion , Hubei Wuhan , 430065 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To investig ate the anti-tumo r activ ity of differ ent compounds from medicinal plants Selaginella
labordei and to elucidate the mechanism.METHODS　Experiments we re ope rated in Bel-7402 ce ll.The morphological change of
the cells wa s observ ed by microscope.MTT assay w as used to evaluate the effect of each g r oup compounds on inhibiting ce ll
prolifera tion.F low cy tometry wa s used to detect cell apoptosis.RESULTS　Experiment re sults showed that some bisflav ones of
Selaginella labordei had rela tively stronger activities , which depended on do se and acting time.Flow cy tometr y further con-
firmed tha t inducing cell apoptosis w as one of anti-tumo r mechanisms.CONCLUSION　Some bisflav one s f rom Selaginella
labordei have strong action on inhibiting cancer cell pro life ration and inducing apoptosis.
KEY WORDS:Selaginella labordei ;bisflavones;anti- tumo r;M TT;FCM
　　卷柏属药用植物是我国一个重要的药用植物类
群 ,其分布广泛 ,资源较为丰富 ,多具有清热解毒 、活
血止血等功效 ,其中一些在我国广泛地应用于治疗
病毒性肝炎 、癌症等多种疾病 ,并且在该属植物中已
发现了大量具有抗肿瘤 、抗病毒作用的活性成分[ 1] 。
细叶卷柏S elag inel la labordei Hieron.ex Christ是
在我国民间使用的一种抗病毒药用植物。前期研究
中 ,发现其提取物具有较强的抗氧化 、清除自由基的
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作用 ,并且能显著下调结肠癌细胞中表达环氧化酶
Ⅱ(COX-2)的基因 mRNA[ 2] ,说明其可能具有潜在
的抗肿瘤作用。通过活性部位的筛选 ,发现细叶卷
柏中抗黄嘌呤氧化酶和脂氧化酶的活性部位集中在
醋酸乙酯提取部位[ 3-4] 。因此在细叶卷柏醋酸乙酯
提取部位活性成分分离 、分析的基础上 ,通过四甲基
偶氮唑蓝(MT T)法及流式细胞术调查醋酸乙酯部
位发现的双黄酮化合物对人肝癌细胞 Bel-7402 系
生长的影响。
1　材料
1.1　细胞系　肝癌 Bel-7402细胞系 ,购自武汉大
学中国典型培养物保藏中心(China Cente r for
Type Cul ture Co llection)。 RPM I-1640 加 10%新
生牛血清 ,加青霉素和链霉素 ,使其终质量浓度达到
100 μg·L-1 ,常规条件培养(5%CO2 ,37 ℃,下同)。
1.2　仪器及试剂　洁净工作台(上海博迅实业有限
公司);倒置显微镜(O LYMPUS);二氧化碳培养箱
(Sheldon);酶标仪(上海迅达医疗仪器公司);流式
细胞仪(美国 BD公司);新生牛血清(武汉三利生物
技术公司);RPMI-1640 、MT T(Sigma);二甲亚砜
(DMSO , Amresco);碘化丙啶(洛阳华美公司)。
1.3　药物样品　细叶卷柏 Selaginella labordei Hi-
eron.ex Christ 2006年 9月采集于江西庐山 ,原植物
由陈科力教授鉴定 ,标本留存于湖北中医学院标本
室。各种细叶卷柏双黄酮类化合物样品为本实验室
从细叶卷柏中提取分离 ,其中单体化合物结构经作者
鉴定 ,纯度大于 97%,各化合物样品储备液每 1 mg
用 10 μL DMSO溶解使其质量浓度为 100 g·L-1 。
2　方法
2.1　各组药物作用后细胞形态学观察　肝癌细胞
Bel-7402以含 10%新生牛血清的 RPMI-1640 为培
养液 ,常规条件培养。将对数生长期细胞分别加入
各组样品 100 mg·L-1作用 24 h后于倒置显微镜下
观察细胞生长状态 ,用数码相机分别照相记录各组
细胞的形态。
2.2　抗肿瘤活性组分的筛选　采用 MT T 法 。取
对数生长期细胞稀释至 5×105·mL-1 ,接种于 96孔
板 ,200μL/孔 ,常规培养 24 h后 ,加入用培养液稀
释的各样品储备液 ,使其终质量浓度均为 50 mg·
L
-1 ,每组 4复孔 ,继续培养 48 h ,采用快速倾倒法
去除培养液 ,加入 MTT 5 g·L-1 , 20 μL/孔 ,再培养
4 h ,加入 DMSO 150 μL/孔 ,振荡使结晶溶解均匀 ,
570 nm 测各孔吸光度(A)。重复实验 3 次 ,取均
值 ,计算抑制率 。抑制率 =(1-A给药孔/ A对照孔)×
100%。以抑制率高于 30%者评价为有较强抗肿瘤
活性 ,继续做浓度梯度和时间梯度 。
2.3　药物对细胞生长的抑制作用　采用 MT T 法 ,
基本操作同“2.2” 。选取经上述筛选有较强抑制活
性的样品 ,分别做 4 个质量浓度梯度 100 , 50 , 25 ,
12.5 mg·L-1和 3个时间梯度 24 , 48 ,72 h ,分别计
算抑制率和半数抑制浓度 IC50(抑制一半细胞生长
所需的药物浓度)。
2.4　药物对细胞凋亡率的影响　采用流式细胞术
(FCM)法。取对数生长期细胞稀释至 5 ×105 ·
mL-1 ,接种入 20 mL 的小培养瓶内 ,2 mL/瓶 ,常规
培养 24 h ,加入样品溶液使其终质量浓度为 50 mg·
L -1 ,继续培养 24 h ,收集细胞 , 2 000 r·min-1离心
15 min ,PBS洗 2次 ,加 70%冰乙醇 4 ℃固定过夜。
2 000 r·min-1离心 15 min , PBS 洗 2次 ,用0.4 mL
PBS重悬细胞 ,加 PI 染液 1 mL/管 ,室温避光染色
30 min 。用 300目(孔径 40 ～ 50 μm)尼龙网滤过 ,
上机检测 。用 Cellquest 软件程序获取细胞 , 用
Modif it软件程序分析结果 。
2.5　统计学处理　用 SPSS 13.0统计软件进行统
计处理 , OD值以 x±s表示 ,组间比较采用 t检验 。
3　结果
3.1　光镜下观察细胞的凋亡形态　在倒置显微镜
下观察 ,可见未用药的肝癌细胞生长良好 ,表现为细
胞梭形或多角形 ,胞体透亮 ,并且融合成片;加入各
药物组作用 24 h 后观察 , 可见加入样品组 4104 ,
32914 ,41701 ,4021619A ,90501 的细胞均发现引起
细胞明显的调亡现象 ,即细胞变圆变小 、有颗粒感 、
皱缩 ,部分细胞脱落漂浮于培养液中 ,样品组 0833
和 4453调亡不明显。见图 1。
3.2　细叶卷柏中抗肿瘤活性组分的筛选　MTT 法
筛选结果见表 1 ,以样品质量浓度为 50 mg·L-1抑制
率高于 30%者认为该组药物有较强抗肿瘤活性。
表 1　各组样品(50 mg·L-1)对 Bel-7402细胞的抑制率(每
组 4复孔 ,重复实验 3次 , x ±s)
Tab 1　Inhibito ry ra te of various sample(50 mg·L-1)on Bel-
7402 cell( x±s)
样品
名称 样品说明 OD 值
抑制率
/ %
药效
评价
1 空白 0.81±0.17 / /
2 罗波斯塔双黄酮-4 -甲醚 0.62±0.09 23.25a 较弱
4′-methylether robu staf lavone
3 2′′, 3′′-dihydrooch naf lavone 0.34±0.12 57.56a 有
4 六个结构相近的双黄酮化合物 0.35±0.05 57.44a 有
5 2 , 3-dihydro-3′, 3′′-biapigenin 0.35±0.05 57.32a 有
6 4个结构相近的双黄酮化合物 0.38±0.04 53.26a 有
7 圣草酚 eriodictyol 0.47±0.16 41.82a 有
8 罗波斯塔双黄酮 robus taf lavone 0.68±0.10 16.73a 微弱
注:1-阴性对照;2-0833;3-4104;4-32914;5-41701;6-4021619A;7-
90501;8-4453;与阴性对照比较 , aP<0.05
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图 1　各组样品(100 m g·L -1)作用 24 h后 ,对 Bel-7402细胞形态的
影响(×200倍)
Fig 1　Inhibitory effect of variou s sample on the prolif eration of Bel-
7402 cell(×200)
3.3　双黄酮化合物对肝癌 Bel-7402 细胞生长的抑
制作用　选取上述对 Bel-7402 具有较强抑制活性
的 5组药物样品 ,用不同浓度对肝癌细胞 Bel-7402
作用不同时间后 ,经 MT T 法测定 OD值并计算抑
制率 ,从而得出各半数抑制浓度 IC50 ,见表 2。实验
发现 ,抑制率与时间 、浓度相关 ,随着时间和浓度的
增加 ,抑制强度相应增大 。
3.4　流式细胞仪检测细胞凋亡　细叶卷柏中混合
物 4021619A 组和单体 41701有较强的诱导肝癌细
胞调亡的作用 ,远远超过了阳性药物氟尿嘧啶对其
调亡的影响 ,见表 2 ,图 2 。
4　讨论
由于自由基涉及到炎症 、硬化 、癌症和衰老等病
理过程[ 5] ,因此药用植物的抗氧化作用与其抗病毒 、
抗肿瘤作用密切相关 。本研究在细叶卷柏具有较强
抗黄嘌呤氧化酶和脂氧化酶的活性部位分离得到的
双黄酮化合物中 , 发现了 5 个组分 4104 , 32914 ,
41701 ,4021619A和 90501能显著抑制人肝癌细胞
表 2　各组药物样品作用于 Bel-7402的半数抑制浓度 IC50
(mg·L-1)和引起的凋亡率
Tab 2　IC50 of some samples on Bel-7402 cell and Apopto tic
r atio caused by these samples
样品 IC50/mg·L-1
24 h 48 h 72 h
凋亡率
/ %
4104 73.7 65.7 56.9 1.42
32914 96.0 58.4 35.2 4.72
41701 65.2 63.6 34.5 47.12
4021619A 47.0 40.4 35.1 42.39
90501 77.4 52.1 59.9 4.27
氟尿嘧啶 7.0 43.7 3.4 14.65
图 2　几个样品作用于肝癌 Bel-7402细胞的流式图(图中蓝色为凋
亡峰 ,峰面积表示凋亡率)
A.阳性对照;B.41701;C.4021619A;D.氟尿嘧啶
Fig 2　Flow cytomet ry graph of some samples on Bel-7402 f or 24 h
A.negat ive sample;B.41701;C.4021619A;D.f luoralracil
Bel-7402的生长 ,在这些样品中单体化合物 41701和
混合组分 4021619A 被发现较显著的诱导肝癌 Bel-
7402细胞凋亡的作用 ,甚至远远超过阳性药物氟尿
嘧啶的作用 ,这说明细叶卷柏中活性成分抑制 Bel-
7402生长的作用既有直接的细胞毒作用 ,也有诱导
细胞凋亡的作用 ,可能是一种潜在的抗肿瘤药物。
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[收稿日期] 2008-04-13
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