全 文 ：中国药事 2016 年 3 月 第 30 卷 第 3 期 297
摘要 目的：建立测定蒙药材刺柏叶中 4 种黄酮含量的一测多评法。方法：采用高效液相色谱法，以穗
花杉双黄酮为内标物，建立其与槲皮苷、竹柏双黄酮 A、扁柏双黄酮的相对校正因子，通过校正因子计
算槲皮苷、竹柏双黄酮 A、扁柏双黄酮的含量，并与外标法计算值进行比较。结果：一测多评法和外标
法的计算值基本一致，相对误差均小于 1.08%。结论：一测多评法用于刺柏叶中 4 种黄酮的含量测定是
可行的。
关键词： 刺柏叶；相对校正因子；一测多评法；槲皮苷；竹柏双黄酮 A；扁柏双黄酮
中图分类号：R284.1; R927.2 文献标识码：A 文章编号：1002-7777(2016)03-0297-06
doi:10.16153/j.1002-7777.2016.03.019
Simultaneous Determination of Four Flavones in Mongolian Medicinal
Materials Juniperus rigida Leaves by QAMS
Wu Shanshan1, Lin Yan2* (1. Pharmaceutical College of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110,
China; 2. Inner Mongolia Food and Drug Inspection, Hohhot 010011, China)
Abstract Objective: To establish a quantitative analysis method of multi-components by single marker（QAMS）
for the simultaneous determination of four flavones in Juniperus rigida leaves. Methods: By using Amentoflavone
as an indicator, the relative correction factors (RCF) of Quercitrin, Podocarpusflavone A and Hinokiflavone
were established. Then, the RCF was used to calculate the contents of Quercitrin, Podocarpusflavone A and
Hinokiflavone. Meanwhile, the calculated value was compared with that of external standard method. Results: The
calculated value of QAMS was basically the same as that of external standard method, and the relative error was
less than 1.08%. Conclusion: QAMS is feasible for the simultaneous determination of 4 flavones in Juniperus
rigida leaves.
Keywords: Juniperus rigida leaves; relative correction factors; quantitative analysis method of multi-
components by single marker (QAMS); quercitrin; podocarpusflavone A; hinokiflavone
作者简介：吴珊珊，硕士生；研究方向：民族药的成分分析及质量标准研究；E-mail：674415501@qq.com
通信作者：林燕，硕士研究生导师，主任药师；研究方向：民族药的成分分析及质量标准研究；E-mail：linyan-60@163.com
一测多评法测定蒙药材刺柏叶中 4 种黄酮的含量
吴珊珊 1，林燕 2*（1. 内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010110；2. 内蒙古自治区食品药品检验所，
呼和浩特 010011）
刺 柏 叶 为 柏 科（Cupressaceae） 植 物 刺 柏 属
（Juniperus） 杜 松（Juniperus rigida Sieb.et Zucc.）
的干燥嫩枝叶，为蒙医临床常用药材，具有清肾
热、利尿、燥“协日乌素”、愈伤止血等功效 [1-2]。
刺柏叶中含有黄酮类、苯丙素苷类、萜类等丰富的
化学成分，具有抗炎、抗癌、抗病毒、抗氧化等许
多药理活性 [3-6]。刺柏叶的现行质量标准为《中华
人民共和国卫生部药品标准 • 蒙药分册》[2]，该标
准中只收载性状和鉴别项。本试验为提高刺柏叶的
质量控制标准，对其中槲皮苷、穗花杉双黄酮、竹
柏双黄酮 A 和扁柏双黄酮 4 种黄酮类成分进行含
量测定研究，因 4 种黄酮类成分基本母核相同，且
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存在对照品难求的问题，故采用一测多评法，仅通
过测定 1 个成分，实现多个成分的同步监控 [7]。通
过系统适用性考察，探讨一测多评法的适用性、可
靠性；并与外标法进行比较，进一步探讨用于刺柏
叶多成分含量测定的可行性。
1 试验材料
1.1 仪器
岛津低压四元 LC-20A 型高效液相色谱仪、岛
津 LC-20A 型高效液相色谱仪、戴安 U3000 高效
液相色谱仪、Retsch MM400 混合研磨机（德国莱
驰公司）、PL203 型千分之一电子天平（瑞士梅特
勒 - 托利多公司）、AE100 型万分之一电子天平
（瑞士梅特勒 - 托利多公司）、ME5 型百万分之
一天平（德国赛多利斯公司）、HH-D4 型数显恒
温水浴锅（金坛市双捷实验仪器厂）。
1.2 试剂和试药
色谱乙腈（Sigma-Aldrich）、二次蒸馏水、甲
醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、磷酸
（分析纯，天津市盛奥化学试剂有限公司）。
槲皮苷（批号：111538-200504，中国食品药
品检定研究院）、穗花杉双黄酮（批号：111902-
201102，中国食品药品检定研究院）、竹柏双黄酮
A（产品编号：E-0263，上海同田生物技术股份有
限公司）、扁柏双黄酮（产品编号：E-1882，上
海同田生物技术股份有限公司）；刺柏叶药材经内
蒙古食品药品检验所康双龙、周凯两位主任中药师
鉴定，确认为杜松（Juniperus rigida Sieb.et Zucc.）
的干燥嫩枝叶，药材来源见表 1。
表 1 刺柏叶药材来源
编号 产地来源
1 林东郊区
2 集宁西郊
3 锡盟正蓝旗
4 扎旗罕山
5 锡盟蒙医研究所
6 阿盟药检所
7 阿拉善盟蒙医院
8 内蒙古中蒙医院
9 集宁青年广场
10 集宁白泉山生态大道
11 集宁区委院
12 呼和浩特郊区
2 方法与结果
2.1 色谱条件 [8-10]
色 谱 柱：Thermo C18 柱（250 mm×4.6 mm
5 μm）；流动相：乙腈 -0.1% 磷酸溶液；梯度洗
脱程序见表 2；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；
检测波长：337 nm；进样量：10μL。HPLC 色谱
图见图 1。
表 2 梯度洗脱程序
时间 /min 乙腈 /% 0.1% 磷酸 /%
0 → 25 12 → 40 88 → 60
25 → 30 40 → 45 60 → 55
30 → 60 45 → 60 55 → 40
60 → 70 100 0
70 → 80 12 88
1
1
2
2
3
3
4
4
A
B
20 30 40 50
20 30 40 50
t/min
t/min
1. 槲皮苷；2. 穗花杉黄酮；3. 竹柏双黄酮 A；4. 扁柏双黄酮；
A. 混合对照品；B. 刺柏叶供试品。
图 1 HPLC 色谱图
2.2 检测波长的选择
本试验通过二极管阵列检测器对 4 种黄酮自
190~800 nm 进 行 光 谱 扫 描， 槲 皮 苷、 穗 花 杉 双
黄酮、竹柏双黄酮 A、扁柏双黄酮分别在 348、
337、333、337 nm 有吸收，各吸收波长相近，故
结合各成分的峰形、吸收强度、基线噪音等因素，
选择 337 nm 作为检测波长。
2.3 供试品溶液的制备
取本品 1 号粉末（过 2 号筛）约 0.4 g，精密
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称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 50 mL，
密塞，称定重量，加热回流 2.5 h，放冷，再称定
重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜
（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。
2.4 对照品溶液的制备
分别取槲皮苷、穗花杉双黄酮、竹柏双黄酮
A、扁柏双黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇溶
解，制成每 1 mL 含 77.72、71.36、243.5、46.4 μg
的对照品溶液，再分别精密移取 2.5、2.0、3.0、
置 10 mL 容量瓶中，即得混合对照品溶液，
于 4 ℃冰箱中保存，备用。
2.5 校正因子的计算 [11-13]
精密吸取混合对照品溶液 2、4、6、8、10、
15、20 μL，注入高效液相色谱仪测定，以穗花杉
双黄酮（s）为内标物，计算槲皮苷（h）、竹柏双
黄酮 A（z）和扁柏双黄酮（b）的相对校正因子，
RSD 均小于 5%。结果见表 3。
表 3 刺柏叶中黄酮类成分间的相对校正因子
进样体积 /
μL
槲皮苷
fsh
竹柏双
黄酮 A fsz
扁柏双黄酮
fsb
2 2.017 1.384 1.092
4 2.059 1.403 1.097
6 2.069 1.393 1.084
8 2.089 1.389 1.076
10 2.101 1.373 1.067
15 2.109 1.375 1.070
20 2.114 1.367 1.055
平均值 2.080 1.383 1.077
RSD/% 1.65 0.91 1.37
注：相、对校正因子 fsi=fs/fi=（As/Ws）/（Ai/Wi），其中
s 为内参物对照品，i 为待测成分对照品，A 为峰面积，W
为质量或浓度。
2.6 校正因子的耐用性考察 [13]
试验考察了岛津低压四元 LC-20A 型、岛津
LC-20A 型、戴安 U3000 3 种高效液相色谱仪，并
在岛津低压四元 LC-20A 型高效液相色谱仪上考察
了 3 种色谱柱：Thermo C18 柱（250 mm×
5μm）、Unitary C18 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）
和 Kromasil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。
精密吸取混合对照品溶液 2、4、6、8、10、15、
20 μL 注入高效液相色谱仪，采用不同仪器和色
谱柱，以穗花杉双黄酮为内参物，测得槲皮苷、
竹柏双黄酮 A 和扁柏双黄酮的相对校正因子，RSD
均小于 5%。结果见表 4、5。
表 4 不同仪器对相对校正因子的影响
仪器 fsh fsz fsb
岛津低压四元 LC-20A 型 2.080 1.383 1.077
岛津 LC-20A 型 2.056 1.414 1.082
戴安 U3000 1.925 1.436 1.158
平均值 2.020 1.411 1.106
RSD/% 4.13 1.89 4.10
表 5 不同色谱柱对相对校正因子的影响
色谱柱 fsh fsz fsb
Thermo 2.080 1.383 1.077
Unitary 2.075 1.466 1.084
Kromasil 2.119 1.405 1.045
平均值 2.091 1.418 1.069
RSD/% 1.15 3.03 1.94
2.7 待测组分色谱峰定位 [13-14]
采用不同仪器和色谱柱，以穗花杉双黄酮为内
参物，得槲皮苷、竹柏双黄酮 A 和扁柏双黄酮的
相对保留时间，RSD 均小于 5%。结果见表 6、7。
表 6 刺柏叶中黄酮类成分在不同仪器中的相对保留时间
仪器 RRTsh RRTsz RRTsb
岛津低压四元 LC-20A 型 0.559 1.254 1.303
岛津 LC-20A 型 0.554 1.258 1.305
戴安 U3000 0.523 1.278 1.332
平均值 0.545 1.263 1.313
RSD/% 3.53 1.03 1.21
注：相对保留时间 RRTsi=RTi/RTs，其中 RTs 为内参物保
留时间，RTi 为待测成分保留时间。
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表 7 刺柏叶中黄酮类成分在不同色谱柱中的相对保留时间
色谱柱 RRTsh RRTsz RRTsb
Thermo 0.559 1.254 1.303
Unitary 0.555 1.239 1.290
Kromasil 0.553 1.233 1.273
平均值 0.556 1.242 1.289
RSD/% 0.57 0.88 1.16
2.8 方法学考察
2.8.1 线性范围
精密吸取混合对照品溶液 2、4、6、8、10、
15、20 μL，注入高效液相色谱仪，测定，以进样
量（X）对峰面积积分值（Y）进行回归分析，所
得结果见表 8，4 种黄酮在所测定范围内呈良好的
线性关系。
表 8 回归方程及线性范围
成分 回归方程 r 线性范围 /μg
槲皮苷 Y=1988.6X+1564.9 0.9999 0.0389~0.389
穗花杉双黄酮 Y=4230.5X-5457.9 0.9999 0.0285~0.285
竹柏双黄酮 A Y=3104.1X-4246.9 0.9999 0.0146~0.146
扁柏双黄酮 Y=4021.8X-11067 0.9999 0.0232~0.232
2.8.2 精密度试验
精密量取“2.4”节的混合对照品溶液适量，
按“2.1”节色谱条件进行测定，重复进样 6 次，
结果槲皮苷、穗花杉双黄酮、竹柏双黄酮 A、扁
柏 双 黄 酮 峰 面 积 的 RSD 依 次 为 0.92%、1.20%、
1.23%、1.03%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.8.3 重复性试验
取同一供试品（1 号样品粉末），平行取样 6
份，每份约 0.4 g，分别按“2.3”节方法制备供试
品溶液，再按“2.1”节色谱条件进行测定，按外
标法 [15] 计算槲皮苷、穗花杉双黄酮、竹柏双黄酮
A、扁柏双黄酮的平均含量依次为 2.071、1.472、
0.737、1.355 mg·g-1，RSD 依次为 0.64%、0.28%、
0.29%、0.37%（n=6），表明该方法重复性良好。
2.8.4 稳定性试验
取同一供试品溶液（“2.8.3”节中的第 1 份
样品溶液），按“2.1”节色谱条件，分别在 0、
4、8、12、16、20、24 h 进行测定，结果槲皮苷、
穗花杉双黄酮、竹柏双黄酮 A、扁柏双黄酮峰面
积 的 RSD 依 次 为 1.53%、1.50%、1.69%、1.68%
（n=7），表明该样品稳定性良好。
2.8.5 加样回收率试验
取同一供试品（1 号样品粉末），平行取样
6 份，各约 0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，
分 别 精 密 加 入 槲 皮 苷（0.0835 mg·mL-1）、 穗
花杉双黄酮（0.0834 mg·mL-1）、竹柏双黄酮 A
（0.1688 mg·mL-1）、 扁 柏 双 黄 酮（0.1114 mg·
mL-1） 对 照 品 溶 液 5、4、1、3 mL， 再 分 别 精 密
加入甲醇 37 mL。分别按“2.3”节方法制备供试
品溶液，再按“2.1”节色谱条件进行测定，按外
标法 [15] 计算槲皮苷、穗花杉双黄酮、竹柏双黄
酮 A、扁柏双黄酮的平均回收率依次为 101.2%、
101.2%、100.6%、101.2%，RSD 依 次 为 1.04%、
1.55%、1.87%、1.26%（n=6），表明该方法测定
结果准确。
2.8.6 耐用性试验
取同一供试品溶液，按“2.1”节色谱条件，
考察岛津低压四元 LC-20A 型、戴安 U3000 2 种
高效液相色谱仪，并在岛津低压四元 LC-20A 型
高效液相色谱仪上考察 3 种色谱柱：Thermo C18
柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Unitary C18 柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm） 和 Kromasil C18 柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm）。结果，4 种黄酮色
谱峰分别与相邻峰的分离度均大于 1.5，按外标
法 [15] 计算槲皮苷、穗花杉双黄酮、竹柏双黄酮
A、扁柏双黄酮的平均含量依次为 2.070、1.456、
0.716、1.357 mg·g-1，RSD 依次为 0.86%、1.85%、
1.73%、1.24%（n=4），表明该方法对于不同仪器
和色谱柱的耐用性良好。
2.9 一测多评法与外标法的结果比较
取 12 批不同来源的刺柏叶，分别按“2.3”节
方法制备供试品溶液，再按“2.1”节色谱条件进
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行测定，分别用一测多评法和外标法计算 4 种黄
酮的含量，并比较 2 种方法所得含量值的相对误
差 [16-17]，相对误差均小于 1.08%，表明 2 种方法所
得结果基本一致。结果见表 9。
表 9 不同方法测得 12 批刺柏叶中 4 种黄酮的含量
样品编号
槲皮苷
穗花杉
双黄酮
竹柏双黄酮 A 扁柏双黄酮
外标法
/(mg·
g-1)
一测多评
法 /(mg·
g-1)
相对
误差
/%
外标法
/(mg·
g-1)
外标法
/(mg·
g-1)
一测多评
法 /(mg·
g-1)
相对
误差
/%
外标法
/(mg·
g-1)
一测多评
法 /(mg·
g-1)
相对
误差
/%
1 号（重
复性试
验结果）
2.071 2.060 0.60 1.472 0.737 0.739 0.38 1.355 1.370 1.07
2 号 -1 3.969 3.947 0.55 1.967 0.639 0.642 0.40 2.136 2.159 1.08
2 号 -2 3.974 3.952 0.55 1.971 0.642 0.644 0.40 2.658 2.687 1.08
3 号 -1 1.979 1.968 0.55 1.826 0.472 0.474 0.40 2.041 2.063 1.08
3 号 -2 1.930 1.919 0.55 1.787 0.466 0.468 0.40 1.992 2.014 1.08
4 号 -1 1.728 1.718 0.55 2.169 0.369 0.371 0.40 1.910 1.930 1.08
4 号 -2 1.726 1.716 0.55 2.171 0.370 0.372 0.40 1.909 1.930 1.08
5 号 -1 1.963 1.952 0.55 2.171 0.259 0.260 0.40 1.613 1.630 1.08
5 号 -2 1.999 1.988 0.55 2.219 0.264 0.265 0.40 1.651 1.669 1.08
6 号 -1 2.270 2.257 0.55 2.581 0.260 0.261 0.40 2.042 2.064 1.08
6 号 -2 2.250 2.238 0.55 2.553 0.259 0.260 0.40 2.014 2.036 1.08
7 号 -1 1.684 1.675 0.55 2.112 0.250 0.250 0.40 1.918 1.939 1.08
7 号 -2 1.686 1.677 0.55 2.107 0.251 0.220 0.40 1.921 1.942 1.08
8 号 -1 2.256 2.244 0.55 1.731 0.239 0.240 0.40 1.554 1.571 1.08
8 号 -2 2.275 2.263 0.55 1.754 0.242 0.243 0.40 1.572 1.590 1.08
9 号 -1 3.782 3.761 0.55 3.031 0.355 0.356 0.40 2.505 2.533 1.08
9 号 -2 3.774 3.753 0.55 3.012 0.356 0.357 0.40 2.505 2.532 1.08
10 号 -1 3.399 3.380 0.55 2.994 0.351 0.352 0.40 2.425 2.451 1.08
10 号 -2 3.446 3.427 0.55 3.041 0.360 0.361 0.40 2.486 2.513 1.08
11 号 -1 2.413 2.400 0.55 1.603 0.342 0.343 0.40 1.557 1.574 1.08
11 号 -2 2.392 2.379 0.55 1.589 0.338 0.340 0.40 1.545 1.561 1.08
12 号 -1 1.496 1.488 0.55 1.940 0.329 0.331 0.40 1.355 1.370 1.08
12 号 -2 1.507 1.499 0.55 1.957 0.332 0.330 0.40 1.362 1.376 1.08
注：一测多评法含量计算公式：Wi=fsi×Ws×Ai/As，s 为供试品中内参物，i 为供试品中待测成分，A 为峰面积，W 为质
量或浓度；相对误差 =|Y-μ|/μ×100％，Y 为一测多评法计算值，μ 为外标法计算值。
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3 讨论
本试验采用一测多评法测定刺柏叶中 4 种黄酮
的含量，实现了在槲皮苷、竹柏双黄酮 A 和扁柏
双黄酮对照品缺乏的情况下，通过穗花杉双黄酮与
槲皮苷、竹柏双黄酮 A 和扁柏双黄酮的相对校正
因子计算后 3 者的含量，通过穗花杉双黄酮与槲皮
苷、竹柏双黄酮 A 和扁柏双黄酮的相对保留时间
进行色谱峰定位。本试验经过系统适用性考察，确
定了槲皮苷、竹柏双黄酮 A 和扁柏双黄酮的相对
校正因子依次为 2.080、1.383、1.077，相对保留时
间依次为 0.559、1.254、1.303。本试验将一测多评
法与外标法的计算值进行比较，验证了一测多评法
的准确性和可行性。
蒙药材刺柏叶化学成分复杂多样，通过同时
测定刺柏叶中多个成分可以更准确可靠地评价药材
的内在质量，且采用 1 个对照品实现对多个成分的
测定，解决了对照品缺乏问题。一测多评法，作为
一种新的质量评价模式，在蒙药材及制剂的质量控
制方面起着重要的作用，并具有广阔的发展前景。
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（收稿日期 2015 年 11 月 26 日 编辑 王雅雯）