全 文 ：药学学报 A et ap h ar m a e e ut i e a s i ni e a 1 9 9 3 ;2 8 ( 5 ): 2 36一 3 3 1
毛菌试体外细胞毒活性及其机制
李润沼 ` 籍秀娟
(中国医学科学院药物研究所 ,北京 1 0 0 05 0)
提要 研究表明 , 毛莫贰对 KB 细胞 、 eB 坛。 :细胞的 IsC 。分别为 0 . 21 和 0 . 35 卜m of L/ ;对细胞大分
子物质的生物合成以抑制 D N A 合成最强 (I sC 。 ~ 0 . 35 协m of / )L 。 作用机制研究表明 ,至少有两种机制
参与毛莫贰的体外细胞毒作用 :抑制 D N A 聚合酶作用下的 D N A 合成 ;促进超氧阴离子自由基的生
成 。
关健词 毛莫贰 ; 抗肿瘤作用
毛莫贰 (r an un cu il n ; R A N )化学名 5一轻甲基 一 2 , 5 二氢吠喃酮 ( 2关任毗喃葡萄糖贰 , 广泛存
在于多种毛莫科植物中 ,化学结构如图 1 。
C H 2 0 H 。一 C l`讯划`,八H、J卜子lǎU三妇r氏fo
H
F i g 1 T h e e h e m i ca l s t r u e t u r e o f r a n u n e u l in
.
国外曾报道 R A N 类似物有抗肿瘤作用 ` ” ; 徐州医学院用天然 R A N 治疗肿瘤认为有一定
疗效 ` 2 , 。 本所全合成 R A N 成功 ,合成的 R A N 为白色粉末状结晶 ,易溶于水 ,理化性质与天然毛
菌贰相同 ` 3 , 。 本文观察了合成毛莫贰的体外细胞毒活性 , 并从分子水平探讨其作用机制 。
实 验 材 料
毛食贰由本所合成室合成 ;小牛胸腺 ND A 、 四氮哇兰 ( N BT ) 、 超氧物歧化酶 (S oD )为 is gm a产品 ; 蛋白酶 K 、 二琉基苏糖醇 ( D T T )及过氧化氢酶 (C A )T 为 eM r ck 公司产品 ; D N A 聚合酶 l 为
rP o m ega 产品 ;三尖杉醋碱 ( H A R )为本所实验药厂生产 ; 柔红霉素 ( D N R )为西德产品 ; 阿霉素
( A D )R 由汕头蛇滨制药厂生产 ; K 2 0 ; 由北京医科大学药学院制备 。 闪烁液为 P p o 及 P o p o p 的
甲苯溶液 , P OP 和 P o p o p 均为上海试剂一厂生产 。 dcr P , dT P 及 d A PT 为 , 笼 hr i gn e r 公司生
产 ; ’ H一 d CT p 为 A m e r sha m 产品 , ’ H 一dT R ( 6 . 6 x 1 0 , ’ qB / m m ol )及 , H 一 u R 由中国科学院原子能研
究所生产 ; 3 H一 T y R ( 16 x 1 0 ’ ` qB / m m o l )由上海原子能所生产 。
本文 于 1 99 2 年 6 月 2 2 日收到 。
· 现工作单位 :北京医科大学 天然药物及仿生药物国家重点实验室 , 北京 1 0 0 0 8 3
DOI : 10. 16438 /j . 0513 -4870. 1993. 05. 002
药学学报 ^e a t P ha rm ae e o ti e aS一 ns e a 29 9 3 ; 5 2 (5 ) :3 2 6~3 5 2
K B细胞及 e B l, ,02 肝癌细胞生长于 R P M I 1 6 4 0完全培养基液 ( io bC O 产品 ,含 10 %小牛血
清 ,青霉素 1 0 IU / m l 、 链霉素 1 0 林g / m l ) 3 7 oC , 5% e o : 常规培养 。
方 法 与 结 果
一一 ~ 对 BK 及 elB 、 ” 细胞克隆形成的影响取对数生长期细胞 ( K B , eB l 7 ; 。 2 ) , 用 R P M I 1 6 4 0 培养液分别按 3 0 , 3 0 0 及 3 0 0 0 个细胞 / m l
制成细胞悬液 ,每培养皿 s ml 接种于 60 m m 平皿内 , 每组 3 皿 ,于 37 ℃ , 5% c 0 2 条件下培养 ,
6 h 后加入不同浓度的 R A N ,终浓度分别为 0 . 0 5 , 0 . 1 , 0 . 5 , 1 . 0 及 2 . 0 协m o l / L 。 继续培养 1 0
天 ,以 eG rm on ys ` 液固定 , G le ~ 染色
,计克隆数 (5 O个细胞以上者为克隆 ) 。以给药组与对照组
相 比 , 计算克隆存活率 。 结果表明 R A N 对 K B 及 eB vl’ o 2细胞的生长抑制起效浓度均为 0 . 1
“ m ol / L , cI s。分别为 0 . 2 1 林m ol / L (K B )及 0 . 3 5 砰m ol / L ( eB l ; ; 。 : ) , 在 2 林m ol / L 浓度时两种细胞均
无克隆形成 (图 2) 。
R A N 对 L o .l 细胞大分子生物合成的影响
1 取对数生长期的 1L 210 细胞 , 以无血清 R p M I 1 6 4 0培养基液配成 1 . 5 x 1 0e 个细胞 /ml 悬
一 ,一 液备用 . 分装 1 m l/管 ,各管加入不同浓度的 R A N 50 泌 ,终浓度分别为 0 . 1 , 0 . 5 , 5 . 0 , 巧 及 30帅 ul L/ ,并设对照 , 37 ℃轻摇 Z h , 反 应终止前 30 m in 加入标记前体 ( , H - T d R , 3H 一 U R 或 3 H -
yT )R L 85 x 10’ qB /ml ,冰浴终止反应 , 以纸片法测定各前体掺入之放射性强度 。 结果表明 ,
R A N 在浓度为 0 . 1 , 。 . 5 及 5帅 ul L/ 时 ,分别对 1L 2 ,。细胞 D N A , NR A 及蛋白质产生轻微抑制作
用 ,但无显著性差异 ; R A N 在 15 林m ul / L 时 ,使 D N A , R N A 及蛋白质的合成抑制分别为 87 . 18
( p ( 0
.
0 5 )
,
5 6
.
2 1伊 ( 0 . 0 1 )及 1 1 . 7 2% (尸) 0 . 0 5 ) ,见表 1 。
T的 1 E f ec t of 彻 u n c u 】I n on t h e i n c o 耳目 r a 此叻 of , H 一 h be lde n cu 】e i c ac id p r ce uso 比
ot . 通 e r o m o 】ce u 】份 in 1L 2l o Cd 加
R AN O Q I , C. n妞翻 i o n D P M (公 土 s , n = 3 )
(侧m d L/ ) H一了UR 3H 一 U R 组一 yT R
0
0
。
l
0
。
5
5
.
0
15
3 0
5 8 6 9士 2乏7
34 6 7士 1 18
2 0 3 1士 7 3 4 ’
5 5 6土 69 3 .
7 5 2士 63 5 .
8 4 2土 18 6 .
3 3 4 8士 3 5 3
4 1 2 0士 6 1 4
2 4 62士 5 6 7
1 8 74士 1 6 0 ’ ,
1 46 6士 2 3 9二
15 6 0土 3 6 0 ` .
2 9 5 0士 5 2 5
3 9 6 5土 5 4 1
3 8 7 3士 6 1 1
2 6 8 1士 2 3 3
2 6 0 4土 7 0 6
1 9 72 土 5 8 3
.
P < 0
.
05
, 二 P < 0 . 0 1 璐 c o n tr O I
Z R A N 抑制 D N A 合成的作用方式 : 参照方福德等人的方法 (4) , 取 lL 。 。细胞悬液 (1 , S X
10
.
/m l )
, 每管 1 m l ,分组后分别加入 R A N ( 5 0 拌m ol / L ) , D N R ( 2 7 p m of / L )及 H A R ( 5 6 协m ul / L ) ,
于 37 ℃温孵 l h 。 冰浴终止反应 ,以冰 s s c 液 ( 0 . 1 m ol / L N a cl , 0 . 5 m ul / L 柠檬酸钠 )4 ml 洗去
药物 , 随即于 3 7℃继续保温 , 于 。 川 i n (立即 ) , 3 0 , 6 0 , 9 0 及 1 2 0 m i n 加入 3 H一 dT R I · 8 5 X 1 0`
qB 加 l , 掺入 30 而 n 后 , 冰浴终止反应 , 计数放射强度 。 结果显示 , 在洗去药物后随时间延长 ,
H A R 组的掺入呈递增型 ,即洗去药物后 3 H - T d R 的掺入可逐渐恢复到用药前水平 。 D N R 组的掺
人呈递减型 , 即洗去药物后 sH 一dT R 掺入始终处于低水平 。 R A N 组的掺入亦呈递减型 ,洗去药
药学学报 A eta P ha rm a e eu ti ea si ni ea1 9 9 3; 2 8 (5 ) : 32 6~1 3 3
物后 3H一 Td R掺入 由 40%继续下降至近于零 〔图 3)。
少 。 一一一一一一一。— 自— 么 o一 。 氏17 刁 0 2c el ls .一 .K B沈1坛 【 ) N RRA N八 .一一, 自 H A R 2 7 协阴i / L5 0 协m o l / L56 林m ul / LJ飞es才..J604ǎ次àQ\卜
tO
.取叫州八叹à称叫吕一。习>ū`,的
0
.
0 5 0 0
.
1 0 0 1
.
00 0
o r u g e o n e e n t r a t io n (阱咖 l / L , L o G )
F ig 2 C y to to x ie i t俪 o f r a n u n e u l in o n
Be l
7 ; 0 2 a n d K B e e l ls
.
F i g 3 A n a ly s is o f t h e m od e o f a e t io n of r a n u n
-
e u li n on D N A b i os y
n th es is i n L
一Z xo .
波谱移动法观察 R A N 对 D N A 的直接作用
于 l m m o l / L T r is 一 H e l 缓 冲液 ( p H 7 . 7 ) 中 , 加 入小牛 胸腺 n N A ( 2 8 件g / m l ) 及 R ^ N ( 3 6
林m o l / L , 1 4 4 协m o l / L )或 A n R ( 27 卜m o l / L , 6 8 砰m o l / L ) ,每实验管均设参比管 。 在 2 0 0一 3 0 0 n m
范围 ,从零时起每小时进行一次紫外吸收光谱扫描 ,观察 D N A 吸收峰的强度与位移 。结果显示
嵌入剂 A D R 作用使 D N A 峰出现红移和减色效应 ,与文献 (5) 一致 ;而 R A N 36 及 1 4 林m of / L 均
未使 D N A 吸收峰发生变化 (图 4 ) 。
2 5 0
.
0 3 0 0
.
0 2 5 0
.
0 3 0 0
.
0
钱 / 护
万一门, 、 、 l
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一一r 一一
2 5 0
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0
W a v e le n g t h ( n m ) W a ve l e n g t h ( n m )
F ig 4 hT
e U V s pe
e t r a o f D N A t r ae t de w i th r a n u n e u li n ( A ) a n d A D R ( B )
. 一 D N A o n ly ( 2 8
” g / m l ) ; 一 D N A十 R ^ N ( 3 6 协m o l / L ) or A D R ( 1 7 件m o l / L ) ; 一 · 一 o N A 十 R A N ( 1 4 4 件m o l / L ) or
A D R ( 6 8 “ m o l / L )
.
药学学报 A et aP ha rm a e e ut i e a s in i e a 1 9 9 3 ;28 ( 5 ): 36 2~ 3 3 1
R A加 对 DN A聚合酶 I作用下N D A合成的影响
取活化小牛 胸腺 DN A6 阳 , D N ^ 聚合酶 1 2 0 1 , d N T p 2 5 林m o l / L , d c T p 2 . 5 件m ol / L ,
3H
一
dCT P 3
.
7 X 1 0
`
qB
, D T T 1 m m of / L
,
M gS O
; 1 0 m m o l / L 及 BS ^ 5 0阳 / m l置于 5 0 协m o l / L T r is -
HCI 中 , 加入 R A N 的终浓度分别为 0 (对照 ) 、 l , 5 , 2 5及 5 0 件m o 一/ L , 总反应体积为 3 0 协l , 3 7 `C 温
浴 Z h ,冰浴终止反应 。 将反应液转移至玻璃纤维膜上测定其放射性 。 结果显示 , RA N 对 ND A
二一 聚合酶 I 作用下的 D N A 合成的抑制呈量效相关 , R A N 50 卿ol / L 对 D N A 聚合酶 I 的抑制达
6 1
.
0 2% (表 2 ) 。
aT b 2 E f f ec t ot arn
u n c u il n on D N A 加 l y . 岭到” 姆 I 诬朴 碗 t r o ( x 士 s , n = 3 )
T r朗七m e n t
( R A N con 咖 t r a t ion 砰mo l/ L )
17 9 8 0土 4 85 8 1 39 3 0士 2 6 3 8 1 0 7 7 0土 16 5 8 7 7 4 4土 17 6 0 . 7 0 7 7士 4 26 .
,
P < 0
.
05 绍 伪 n tr ol
R A N 对 D M s o es OK , 系统 O,’ 生成的影响
, 二一 D M s o 3 lm 含 N BT (终浓度 19 . 2 件m ol / )L 做指示剂 , 以及不同浓度 R A N ,加入 K o Z (终浓度
10 m m ol / L )启动反应 ,于反应 30 m in 以紫外分光光度计分别测定各管在 5 30 n m 处的吸收度 ,
以此计算 。孑生成的促进率 (T C/ 一 1) % 。 结果显示 , R A N 10 o m ol / )L ,使厉 生成增加 2 . 42 %
( p < 0
.
0 5 ) ; 1 0 0 协m ol / L 时 o 2’ 生成显著增加 , 促进率达 2 0 8 . 4 8% (表 3 ) 。
T扭b 3
T r切 t m . n t
A卜幻 了加刀 eC
E f丘兔 t of ar n un c u l in on g e n e r a t ion of su p e r o x id e a in o n in D M呀 0 一 K O : s ys t e m `t 碗 t or
(协m ol / L ) 0 0
.
1 1 0 1 0 0
( 5 3 0 mn ) 0
.
16 5土 0 . 0 1 5 0 . 15 8土 0 . 0 25 0 . 20 2士 0 . 0 1 3 . 0 . 5 09士 0 . 0 1 9二
.
P < 0
,
0 5
, ’ .
P < 0
.
0 1 招 c o n t r o l
过级化氮酶 c( A )T 、超载物歧化酶 ( s 0 D )对 R A N 抑制 D N A 合成的影响
取 1L 21 。细 胞悬液 (l . 5 x l护 / m l) 每管 l ml , 除空白对照 外均 加 入 R A N , 终浓 度为 50
, m of / L
,然后分为 3组 ,即 R A N 组 、 R A N + C A T ( 3 0 0 0 I U / m l )组及 R A N + so D ( 0 . 2 5 m s / m l )组 。
于 37 ℃温浴 l h ,加入 3 H 一dT R l( . 85 x 1 0` qB /m l ) , 30 m in 后冰浴终止反应 。 结果显示 , R A N 十
c A T 组和 R A N 十 so D 组与 R A N 组相 比 ,对 sH - T d R 的掺人抑制分别降低了 37 . 57 和 50 . 26 纬
(表 4 ) 。
T a b 4
.
E f f eC at of C A T
a如d s 0 D on D N A b i翻” 山。 血 加 h i加“曲 by R AN in 1L 210 ( n ~ 3 忿士 s)
一` 一一一- 一一一一一一一一一一甲一一一一一一一一石面一一一一一一 ~ -一 - ~ 一 — ’一— 一一T t目 tm e n t R A N十 S O D
( 5 0 脚m o 】/ L )
R AN + C A T
1 4 9 2 0士 5 6 6 2 9 4 9士 4 09 7 4 4 8士 79 9△ 二 10 4 4 8土 6 2 6△二
二 P < 0 . 01 招 co n 廿 0 1 , △ P < 0 . 01 据 R A N
.一- 一~ 一~ ~ . 曰. . . . . . . . . .
药学学报 A et aPh ar m a e e ut ie a S i ni e a 1 9 9 3 ;8 2( 5 ): 6 3 2~ 3 3 1
讨 论
实验显示 RN A有较强 的细胞毒作用 , 对 K B 及 eB 坛。 2细胞的 IC : 。分别为 。. 21 及 。 . 35
协m ol / L 。 R A N 对大分子生物合成的影响 ,显示出影响 D N A 合成的靶向性 , 对 R N A 影响轻微 ,
我们不排除 R A N 对转录过程的直接影响 ,但也可能是 D N A 合成抑制的继发效应 , 而对蛋 白质
合成的影响与对照相比无显著差异 。 抑制 D N A 合成作用方式分析表 明 , R A N 作用机制不同于
单纯抑制核酸代谢的 H A R , 而与模板损伤型药物 D N R 相似 ;但实验同时表明 , R A N 并不具有
D N A 嵌入剂所特有的嵌人效应 ,这些表明 R A N 的细胞毒作用机制可能有其独特之处 。
K u pe ha n 等认为 a , 日不饱和内醋的抗肿瘤作用活性可能与某些琉基酶发生反应 有关 `“ , ,
R A N 的母核具有 a , 日不饱和内醋结构 , 实验显示其对 D N A 聚合酶 l 作用的抑制支持这一论
点 。 该靶点是 D N A 合成的重要环节 ,但仅此一点并不能解释其作用特征 ; R A N 对超氧自由基
生成的促进作用可能起一定的作用 ,超氧自由基直接或间接对 D N A 模板 的攻击可引起 D N A
损伤及细胞死亡 ` 7) , C A T 及 S o D 使 R A N 抑制 D N A 合成作用部分解除 。 这也说明超氧阴离子
也确实参与了 R A N 的细胞毒作用 , 即 R A N 促进超氧阴离子生成的作用也是其体外杀伤肿瘤
细胞的机制之一 。
参 考 文 献
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35 协m of / L r se pe c t iv e l y
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K e y w or ds aR n u
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N o w in D e Pa r tme
n t fO eC l l P h
a r m a c o 1gO y
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N a t io n ia 加 b . o f N a t u iat a dn iB o m如 e t ic tD u gS ,
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