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TheEffectofTongxiePrescriptionontheExpressionof
Intestinal5-HTand5-HT4 ReceptorofVisceralHypersensitivityRats
WANGJian-wei, QIDe-ying, JINYing-hui, ZHAOWen-jing, SUIFang-yu, JIANGHong, XUFeng-hua
(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine, Harbin150040, China)
Abstract:Objective:Bystudyingtheefectonbowelsensitivityandexpresionof5-HTand5-HT4 receptor, toinves-
tigatetheefectofTongxieprescriptiononvisceralhypersensitivityrats.Methods:EstablishIBSmodelsofvisceralhy-
persensitivityratsbymilkmicecoloniritation, tostudytheefectofTongxieprescriptiononbowelsensitivitybyobserv-
ingcapacitythresholdandthetimeofcontractofabdomenmusclecausedbyvariouscapacity, andexpressionof5-HT
and5-HT4 receptorinintestinaltissue.Results:Afterthemodelwasestablished, thebowelsensitivityincreased, and
theexpresionof5-HTwasenhancedand5-HT4 wasreduced.AfterintervenedbyTongxieprescription, thesensitivi-
tyofbowelwasreduced, andtheexpressionof5-HTwasreducedand5-HT4 wasenhanced.Conclusions:Tongxie
prescriptioncanreducethebowelsensitivityofvisceralhypersensitivityratsbyreducingtheexpressionof5-HTanden-
hancingtheexpressionof5-HT4 inintestinaltissuetoincreasethethresholdofvisceralpain.
Keywords:Tongxieprescription;Visceralhypersensitivity;IBS;5-HT;5-HT4 receptor;Bowelsensitivity
蝙蝠葛酚性碱对 BxPC-3荷瘤裸鼠细胞凋亡
相关基因 P53蛋白表达的影响
周忠光 1 ,白云1 ,赵鑫1 ,范越 1 ,王怀刚 1 ,朱丹 2 ,朱孝娟 3 ,苏云明 1＊
(1.黑龙江中医药大学 ,黑龙江 哈尔滨 150040;2.齐齐哈尔市中医院 ,黑龙江 齐齐哈尔 161000;
3.哈尔滨医科大学 ,黑龙江 哈尔滨 150000)
摘　要:目的:观察蝙蝠葛酚性碱(PAMD)对胰腺癌(BXPC-3)荷瘤裸鼠肿瘤组织中 P53蛋白表达的
影响。方法:通过蛋白印迹技术(Westernbloting)观察 PAMD对胰腺癌细胞株 BxPC-3皮下异位移植
瘤细胞凋亡相关基因 p53蛋白表达的影响 。结果:PAMD能够显著降低胰腺癌细胞株 BxPC-3裸鼠皮
下异位移植瘤组织中 p53蛋白表达量 。结论:PAMD对胰腺癌细胞株 BxPC-3裸鼠皮下异位移植瘤表
现出明显抑制作用 ,能够有效的抑制肿瘤生长 ,其机理可能与 PAMD能够诱导细胞凋亡及影响凋亡相
关基因 P53蛋白的表达有关 。
关键词:蝙蝠葛酚性碱(PAMD);P53;BXPC-3;抗肿瘤作用
中图分类号:R285.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-2392(2011)02-0031-03
收稿日期:2010-12-28　　修回日期:2011-02-21
基金项目:黑龙江省自然科学基金项目 (编号:D200675);哈尔滨市科
技创新人才研究资金项目 (青年科技创新人才)(编号:
2010RFQXS050)
作者简介:周忠光(1957-),男 ,教授 ,博士研究生导师, 主要研究方向:
中药现代药理毒理学研究。
＊通讯作者:苏云明(1949-),男 ,教授 , 博士研究生导师 , 主要研究方
向:中药现代药理学研究。 E-mail:suyunming@ 126.com
　　胰腺癌的发病率有明显的地区差异 ,在发达国家
和工业化程度较高的国家 ,其发病率较高 ,而非洲和亚
洲国家的发病率较低 。根据世界卫生组织公布的统计
资料(GLOBOCAN2002)[ 1] , 2002年全球胰腺癌新发
病例232306例 ,占全部恶性肿瘤新发病例的 2.1%,居
第 13位 ,同年胰腺癌死亡例数为 227023,与发病例数
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Vol.39, No.2, 2011 　　　　　　　　　
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接近 ,占全部恶性肿瘤死亡的 3.4%,位居恶性肿痛死
亡的第 8位 。蝙蝠葛酚性碱是从中药北豆根中提取的
多种脂溶性生物碱的混合物 。研究发现 PAMD具有
较好的抗心肌缺血 、保护脑缺血 -再灌注损伤的作用 ,
及对人肿瘤细胞 PC-3、BT5637增殖的影响等 [ 2 -6]作
用 。本实验采用胰腺癌 BXPC-3细胞株建立裸鼠胰
腺癌模型 ,观察 PAMD对凋亡相关基因 P53蛋白表达
的影响 ,并进一步探讨 PAMD抗肿瘤作用机制 。
1　实验材料
1.1　实验动物
裸鼠 48只 ,体重(20 ±2)g,雌雄各半 ,由黑龙江
中医药大学药物安全性评价中心提供 ,合格证:SCXK
(京)2007-0001。在黑龙江中医药大学药物安全性
评价中心饲养。
1.2　实验瘤株
胰腺癌瘤株(BXPC-3)购自中国科学院上海生
命科学院细胞资源中心。
1.3　药物
蝙蝠葛酚性碱(PAMD)由黑龙江中医药大学药学
院提供;用环磷酰胺(CyclophosphamideForInjection),
江苏恒瑞医药股份有限公司。
1.4　仪器及试剂
MDF-U50V型低温冰箱 (日本三洋);AL204电
子天平(英国 METTLEYTOLEDO);超净工作台(苏州
净化设备厂);DYY-7C型电泳仪(六一仪器厂);水
平电泳槽(Sigma公司);DYCZ-24D型垂直板电泳槽
(六一仪器厂);电泳凝胶图象分析系统(Backman公
司);PVDF膜(美国 Pal公司);NC膜(美国 PALL公
司);滤纸(Whatman3mm);丽春红(武汉博士德);封
闭用脱脂乳(sigma公司);抗体:{santa公司 b-action
(sc-47778)Sigma公司 DPC-4(S3934)};HRP羊抗
兔二抗(sigma公司);超敏发光液(鑫丰生物材料公
司)。
2　实验方法
2.1　胰腺癌 BXPC-3裸鼠模型的建立
取冻存的胰腺癌细胞株 BxPC-3 ,立即投入 37℃
水中 , 1min内融化 ,然后离心去除冻存液 ,用约 10倍
的冷 RPMI1640完全培养液洗 1次 ,接种于培养瓶中 ,
待细胞贴壁后更换培养液。肿瘤细胞株培养在 RP-
MI1640完全培养液中 ,置于 37℃、饱和湿度 、5%CO2
培养箱中 ,隔日换液 ,细胞长成单层后 , 用 0.25%胰
酶 、EDTA消化 、传代。待细胞进入对数生长期后 ,收
集细胞调整浓度为 5×106个 /mL的细胞悬液备用 ,接
种于 40只裸鼠右腋窝皮下 ,每只鼠接种 0.2mL(含瘤
细胞数 1×106个)。另取 8只裸鼠作为空白对照组 ,
右腋窝皮下注射等体积的生理盐水。
2.2　实验分组及给药
除空白对照组外 ,将造模裸鼠于造模 24h后随机
分为 5组 ,每组 8只 ,分别为 PAMD高 、中 、低剂量组 ,
模型对照组 ,阳性对照组。其中 PAMD高剂量组给予
PAMD20mg·kg-1 , PAMD中剂量组给予 PAMD10mg·
kg-1 , PAMD低剂量组给予 PAMD5mg·kg-1 ,模型对照
组及空白对照组每日给予同等容积生理盐水 ,每日 1
次 ,阳性对照组给予注射用环磷酰胺 156 mg·kg-1 ,每
周 1次 ,各组均腹腔注射给药 ,连续 21d。
2.3　Westernbloting检测 p53蛋白表达
(1)蛋白样品制备:将少量瘤组织块进行匀浆;离
心 ,取上清液;(2)蛋白含量测定;(3)SDS-PAGE电
泳:电泳时间一般 1 ～ 2h,电压浓缩胶时用 80 ～ 100V;
(4)转膜;(5)免疫反应:①将上述 NC膜放入含 1%明
胶的封闭液中 ,于平缓摇动的摇床上 37℃温育 2h;②
一抗与 NC膜上转印蛋白结合;③NC膜与酶标二抗结
合 。(6)显影 ,定影酶标抗体的显色反应;(7)分析方
法胶片采用 Alphaimage2000凝胶成像系统扫描 ,所
得图形使用 Image-proplus分析。
2.4　统计学分析
结果采用 SPSS11.5forWindows统计软件分析处
理 ,组间比较采用 t检验。
3　实验结果
3.1　PAMD对胰腺癌细胞株 BxPC-3裸鼠皮下异位移
植瘤 p53蛋白表达进行定性分析　结果见图 1,图 2。
图 1　β -actin蛋白表达
图 2　p53蛋白表达
G:PAMD高剂量组　Z:PAMD中剂量组　D:PAMD低剂
量组　Y:阳性对照组　M:模型对照组
　　实验对 p53蛋白表达程度进行定性分析后显示 ,
模型组 p53蛋白表达显著升高 , PAMD高 、中 、低及阳
性对照组 p53蛋白的异常表达较模型组显著降低。
3.2　PAMD对胰腺癌细胞株 BxPC-3裸鼠皮下异位
移植瘤 p53蛋白表达进行定量分析　结果见表 1。
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表 1　PAMD对 p53蛋白表达的影响( x±s)
组别 例数(n)
给药剂量
(mg·kg-1)
p53蛋白相对表达量
(IODp53/IODβ -actin) 比值
模型对照组 4 等体积 6.8539±0.1067 100.00%
PAMD高剂量组 4 20.0 3.0163±0.1186＊＊ 44.01%
PAMD中剂量组 4 10.0 3.5852±0.0684＊＊ 52.31%
PAMD低剂量组 4 5.0 4.4477±0.1134＊＊ 64.89%
阳性对照组 4 156.0 3.5338±0.0454＊＊ 51.52%
　　注:表格中的结果表示以模型组的IOD与 actin的 IOD的比值设定
为 100%,然后各组与模型组的比定为各组相对的表达量比值。 actin的
作用就是内参 ,标定各组蛋白含量 ,即保证在同样浓度的蛋白含量情况
下 ,目的蛋白的条带的深浅才能作为表达量高低的依据。与模型对照
组比较 , ＊＊P<0.01。
实验结果表明 , PAMD高 、中 、低剂量组及阳性对
照组分别同模型对照组比较 , p53蛋白相对表达量明
显降低 ,差异具有统计学意义(P<0.01)。
4　讨论
p53基因对肿瘤抑制作用的发挥非常复杂 ,其生
物学效应主要包括细胞周期负调控 、DNA复制与修
复 、细胞凋亡 、抑制血管生成以及应答细胞胁迫
等 [ 7-10] 。p53基因失活与胰腺癌的发生发展密切相
关 。其中 p53突变是其失活的主要原因 ,在胰腺癌中
其突变率高达 50% ～ 70%, 在晚期胰腺癌中尤为多
见 [ 11] 。p53基因的表达产物 p53蛋白在正常细胞中
半衰期较短(6 ～ 20min),含量极微 ,而在癌细胞和转
化细胞中可高达 100倍 。当细胞 DNA损伤后 ,野生型
p53基因过度表达 ,使受损伤细胞停顿在 G1-S期修
复或发生凋亡 ,并激活 BAX基因 ,进一步解除 Bcl-2
基因对细胞凋亡的抑制。突变型 p53基因表达产物突
变型 p53蛋白不仅失去对细胞异常增殖的抑制作用 ,
而且部分表现出癌基因的作用 ———促进细胞异常增
殖 ,使细胞的全部表型出现恶化。有研究结果表
明 [ 12] , p53基因突变可能与胰腺癌发生有关 。 p53表
达与肿瘤生物学特性相关 。突变型 p53基因表达产物
突变型 p53蛋白不仅失去对细胞异常增殖的抑制作
用 ,而且部分表现出癌基因的作用———促进细胞异常
增殖 ,使细胞的全部表型出现恶化。在低分化 、转移 ,
TNM分期 II与 IV期胰腺癌患者的 p53蛋白表达显
著高于高分化 、未转移和 TNM分期 I与 II期患者的肿
瘤细胞的 p53表达 ,而与患者的性别 、年龄 、部位 、大小
和浸润无关 [ 13] 。p53阳性的胰腺癌恶性程度高 、易转
移 、预后差 ,提示 p53基因与胰腺癌进展和预后相关 。
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双向固体发酵后雷公藤菌质的急性毒性研究
刘霞 ,王军永 ,张佐
(江西中医学院 ,江西 南昌 330004)
摘　要:目的:研究雷公藤菌质的急性毒性的变化。方法:运用双向固体发酵的原理与技术 ,将药用真菌G接种到带皮的雷公藤基质上 ,在特定条件下进行发酵 ,得到不同发酵天数的菌质。用 Blis法计算不
同发酵天数的雷公藤菌质的半数致死剂量(LD50),测定其急性毒性。结果:不同发酵时间的雷公藤菌质组 LD50均高于雷公藤生药组 ,其中发酵 20 ～ 30d菌质的 LD50较高 。结论:通过双向性固体发酵可以使雷公藤的急性毒性降低 ,并保持一定的免疫抑制作用 。
关键词:雷公藤;急性毒性;双向性固体发酵
中图分类号:R285.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-2392(2011)02-0033-01
收稿日期:2010-11-15　　修回日期:2011-01-10
作者简介:刘霞(1979-),女 ,讲师 ,主要从事中西医结合基础 、营养学研究。
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