全 文 ：抗松材线虫病赤松家系的抗性测定及组织病理学观察
张　艺 ,吴小芹* ,王　钰 ,叶建仁
(南京林业大学森林资源与环境学院 ,江苏　南京　210037)
摘　要:对自日本引进的赤松(Pinus densi f lora)27 个抗病家系进行人工抗病性测定 ,结果发现抗病各家系对
3 个不同来源的松材线虫(Bursaphelenchus xy lophilus)虫株都表现出不同程度的抗病性 ,且差异明显。 综合
3 次接种试验结果发现 , 引进赤松中有 13个家系(1、4、5、6、7、8、13、14 、15、17 、20 、23 和 25 号)抗病表现较好。
对 5 号抗病家系接种松材线虫后 ,分别按时间进程(4、8、12 、24、36、48 、72 、96、120 h)进行茎段取样 , 组织病理
学观察发现松材线虫在引进的抗病赤松体内的迁移速度较普通赤松慢 , 且松树茎内木射线细胞和树脂道泌
脂细胞周围的薄壁细胞出现病变较普通赤松晚 , 病变程度也比普通赤松轻。
关键词:赤松;松材线虫;抗病性测定;组织病理学
中图分类号:S432;S763　　　文献标识码:A 　　　文章编号:1000 - 2006(2007)04 - 0110 - 05
Resistance Determination and Histopathological Observation of Induced
Pinus densi f lora Families from Japan to Bursaphelenchus xy lophilus
ZH ANG Yi , WU Xiao-qin * , WANG Yu , YE Jian-r en
(C ollege of Forest Resources and En vi ronmen t Nanjing Forest ry University , Nanjing 210037, C hina)
Abstract:The resistance o f 27 wi lt-resistant P inus densi f lora fami lies induced from Japan to
3 isolates o f Bursaphelenchus xy lophi lus was determinated. The resul t indicated that all 27
Pinus densi f lora families had resistance to the 3 iso lates , and there w ere signif icant differ-
ences f rom each other. It w as found by bark inoculat ion that 13 families(No. 1 ,4 , 5 , 6 ,7 ,8 ,
13 , 14 ,15 ,17 ,20 , 23 and 25)were more resistant than o thers. The histopatho logical observa-
tion o f No. 5 fami ly sampled at 4 , 8 ,12 ,24 , 36 ,48 ,72 , 96 ,120 h af ter ino culation show ed that
B. xy lophi lus migrated much slower in the induced pine seedling s than in the contro l. Patho-
lo gical changes in parenchyma radial cell and the parenchymatous cells around resinosis cells
occured later in w ilt-resistant pine seedling s than in the control. In addit ion , the pathological
change s occured mo re gently in the induced pine seedling s than in the control.
Key words:Pinus densi f lora ;Bursaphelenchus xy lophi lus;Resistance determination;His-
topatho logy
　　　收稿日期:2007 - 01 - 05　　　　修回日期:2007 - 05 - 15
　基金项目:国家林业局“ 948”创新项目(2003- 4- 38);江苏省农业“三项工程”资助项目(SX(2002) 091)
　作者简介:张　艺(1979 -),女 ,硕士生。
*通讯作者(Corresponding Author):吴小芹 ,女 ,教授 ,博士生导师。
　　松材线虫病(Bursaphelenchus xy lophilus)是发生在松属树种上的一种毁灭性森林病害 。该病已
对中国森林资源和生态环境造成严重的威胁[ 1-2] 。选育具有抗松材线虫病的松树品种 ,是提高松树抗性
品质 、保存松树资源 、从根本上抵御松材线虫为害的有效途径之一。笔者对自日本引进的 27个赤松优
良抗病家系进行抗病性测定 ,并在此基础上选用较抗病的家系 ,就其组织和细胞受松材线虫侵染后的病
理学反应进行了观察 ,以探讨抗病赤松与普通赤松之间的差别 ,从而为进一步弄清抗病赤松的抗病机理
提供依据 。
1　材料与方法
1. 1　供试松材线虫与抗病赤松
　　选择来自日本和中国经致病性比较试验 ,分别表现为强毒和中强毒的共 3个松材线虫虫株作为供
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2007 年 7 月 　
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版)
Journal of Nanjing Forest ry University(N atural Sciences Edition) 　
Vo l. 31 , No. 4　
Jul. , 2007　
试线虫。其中松材线虫 10号来自中国浙江黑松(Pinus thunbergi i),致病性表现为中强毒;松材线虫 19
号来自中国安徽黑松 ,致病性表现为强毒;来自日本黑松上松材线虫唐津 3号的致病性表现为强毒 。经
贝尔曼漏斗法分离纯培养保存的松材线虫 ,将获得的线虫用 0. 1%的硫酸链霉素表面消毒3 min ,无菌
水洗涤 3次后 ,分别移至培养 5 d的灰葡萄孢(Botry t is cinerea)的 PDA 平板上 ,25℃下培养 4 ～ 5 d ,待
线虫大量繁殖后 ,再用贝尔曼漏斗法分别分离线虫 ,用于接种试验。
从日本已选择出的抗松材线虫病赤松(Pinus densi f lora)家系中选择 27个优良家系(2004年 2月
从日本引种)。种子产地分别来自日本茨城县 、冈山县 、熊本县和高知县。引进的抗病赤松和普通赤松
均在相同条件下室内播种 ,在生长季于野外培育 0. 5 a后移置温室统一管理。各供试松树苗龄为 1. 5 a。
1. 2　松材线虫的接种及松树抗病性观测
松材线虫的接种量为 1 000条 /株 。采用人工皮接法接种 。对引进自日本的赤松 27个抗病家系分
别用 3个供试松材线虫接种(中强毒性松材线虫 10号为处理 1 ,强毒性松材线虫 19号为处理 2 ,强毒性
松材线虫唐津 3号为处理 3),然后置 28 ～ 30℃温室中。以普通赤松为对照。每天观察松苗发病情况 ,
统计发病级值 ,计算感病率 、感病指数[ 3] 。病株分级标准为:0 ,健康;Ⅰ ,少数针叶褐变;Ⅱ ,半数针叶褐
变死亡;Ⅲ ,大部分针叶褐变死亡 ,只剩少数绿叶;Ⅳ,所有针叶全部失绿褐变 ,全株枯萎。
采用 SAS软件统计分析 27个家系对 3个不同来源的松材线虫虫株的抗病性差异。
1. 3　接种松材线虫后抗病赤松的组织病理学观察
选择抗病性测定中表现较好家系的 1. 5年生实生苗 ,以普通赤松作为对照。供试的松材线虫为中
国安徽 19号虫株。接种方法与接种量与 1. 2节中的相同。
从松苗接种后第 4小时开始定期(4 、8 、12 、24 、36 、48 、72 、96 、120 h)取样。将切取的茎段迅速投入
FAA 固定液(V福尔马林∶V冰醋酸∶V70%酒精 =1∶1∶18)中固定 , 5h后取出脱水 、透明 、浸蜡和包埋。将包埋好的
材料经修块 、粘块后进行切片 。采用 Leica 旋转切片机横切茎段面(厚 7μm),再将切片粘到载玻片上 。
切片干燥后 ,用番红 -固绿双重染色 ,最后用中性胶封片 。将抗病赤松组织切片在 Leica DMLB2
显微镜下观察 , Canon Pow ershot S50摄影。描述颜色为染色后细胞和组织的颜色。
2　结果与分析
2. 1　引进抗病赤松优良家系的抗病性测定
　表 1　引进赤松各家系对 3 个松材线虫虫株抗病性方差
分析
　Table 1　Variant analyses in resistant of 27 families of P.
densif lora to 3 isolates of B. xy lophilus
变异来源
S ou rce of varian ce
平方和
SS
自由度
d f
均方
MS
F0 P
线虫 54. 81 2 27. 40 25. 75 <0. 000 1
家系 122. 63 27 4. 54 4. 27 <0. 000 1
线虫×家系 62. 77 54 1. 16 1. 09 0. 314 8
机误 391. 68 368 1. 06
总变异 631. 88 451
　　引进的赤松 27个优良家系对 3种不同来源毒
性松材线虫表现出不同程度的抗病性 ,60%以上家
系的感病率低于普通赤松。其余 40%家系中的大
部分家系虽在感病率上与普通赤松相近 ,但在感病
指数上却低于普通赤松 ,表现出良好的抗病性 。
统计分析表明 ,抗性赤松对 3个不同来源松材
线虫虫株的抗病性存在极显著的差异 ,且 27个抗性
家系间的抗病性差异也极显著(表 1)。
尤其对日本唐津 3 号松材线虫 ,抗性赤松的抗
性明显。27个家系中有 25个家系表现出较好的抗
病性(除 9 、19号家系外)。对中国浙江松材线虫 ,有 15个家系(1 、2 、4 、6 、8 、13 、14 、16 、17 、19 、20 、23 、24 、
25 、26号)的抗病性表现较好 ,其余 12个家系在感病率上与普通赤松相近 ,但多数家系的感病指数均远
低于普通赤松。对中国安徽松材线虫 ,有 7个家系(4 、5 、6 、7 、13 、14和 17 号)表现出一定的抗病性 ,有
8个家系(3 、15 、19 、22 、23 、24 、25和 26号)表现次之 ,而其余家系未表现出抗性(图 1)。
2. 2　松材线虫在抗病赤松与普通赤松中的迁移与扩散比较
选用抗病性表现较好的赤松 5号家系接种 19号松材线虫。接种 4 h 后每隔一定时段取样观察 。
接种后 4 h ,在抗性赤松组织切片未观察到松材线虫 ,而在对照赤松皮层内已见有许多松材线虫。
接种后 8 h ,抗性赤松接种点附近的皮层树脂道发现松材线虫 ,此后 28 h内 ,少量线虫迅速横向沿木射
线向髓部蔓延 ,纵向沿树脂道向上向下扩散。观察表明 ,松材线虫在普通赤松内无论是向下还是向上扩
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散速度始终比抗性赤松快 。普通赤松接种点处线虫在 48 h 即侵染至髓心处 , 72 h 扩散至向上 1. 5 cm
和向下 3. 5 cm 的髓心;而抗性赤松接种点处线虫接种后 96 h 才侵染至髓心部位 ,到 120 h时 ,远离接种
点部位的髓心细胞仍较正常。引进的抗性松苗与普通松苗在受害程度上表现出明显的不同。
2. 3　抗病赤松受松材线虫侵染后的组织病变
接种 4 h后 ,抗病赤松接种点细胞结构完整 ,未发生明显的病变 。在所取茎段中未发现松材线虫
(图 2A)。普通赤松的皮层树脂道发现松材线虫(图 2a)。在番红 、固绿双重染色下 ,线虫虫体染成深绿
色 ,取样部位细胞未见明显病变;接种 8 h后 ,抗病赤松接种点及接种点上 1. 5 cm 处皮层树脂道发现线
虫(图 2B),但线虫数量较少 。普通赤松中 ,线虫在接种点及接种点上 1. 5 cm 处皮层树脂道内大量繁殖
(图 2b),皮层薄壁细胞染色不均匀 ,染色质凝集成颗粒状;接种 12 h 后 ,抗病赤松接种点及接种点上
1. 5 cm 处皮层发现线虫 ,线虫破坏了皮层的薄壁细胞(图 2C),木质部树脂道周围细胞增生 、破裂。普
通赤松木质部围绕树脂道泌脂细胞的薄壁细胞和木射线细胞变形 、破裂 ,木树脂道周围细胞增生(图
2c),形成层部分细胞死亡 ,皮层与木质部剥离。接种点下 3. 5 cm 处 ,抗病赤松与普通赤松皮层薄壁细
胞均有可见的病理变化 ,细胞质凝集成颗粒状 ,但抗病赤松病变细胞间或发生 ,而普通赤松发生的细胞
连成一片;接种 24 h后 ,抗病赤松接种点 ,线虫在皮层大量繁殖 ,木射线细胞部分变形 ,木树脂道发现线
虫 ,部分树脂道周围细胞破裂;接种点下 3. 5 cm 处 ,木质部树脂道薄壁细胞与木射线细胞变形较轻(图
2D)。此时普通赤松接种点处形成层开始剥离(图 2d);接种点及距离接种点上的木质部树脂道与木射
线都出现了变形 、死亡 ,甚至严重的破裂;接种 36 h后 ,线虫侵染至抗病赤松接种点处近髓心的木树脂
道(图 2E)。在接种点及距离接种点上下 1. 5 cm 处 ,木射线细胞出现不同程度的变形 、死亡 ,部分木树
脂道周围细胞死亡 ,破裂 。线虫在引进赤松皮层中繁殖 ,皮层薄壁细胞遭到破坏 。在普通赤松接种点附
近及远离接种点部位的皮层线虫大量繁殖 ,皮层薄壁细胞被完全破坏 ,木射线破裂 ,木树脂道薄壁细胞
死亡(图 2e);接种 48 h后 ,抗病赤松接种点木质部树脂道泌脂细胞已看不到细胞核 ,树脂道薄壁细胞死
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亡 ,木射线细胞变形(图 2F)。在普通赤松接种点处线虫在木质部树脂道大量繁殖 ,髓心细胞部分破裂 、
死亡(图 2f);在距离接种点下 3. 5 cm 处可以看到大量的线虫由木射线向髓心移动 ,髓心部分细胞破裂;
图 2　抗病赤松和普通赤松接种松材线虫后的组织病理学观察
F ig . 2　Histopatho lo gy obse rva tion be tw een resistant and contro l P. densi f lora ino culated with B. xy lophilus
(A.接种 4 h抗病赤松 , ×200;a.接种 4 h普通赤松(箭头示松材线虫), ×800;B.接种 8 h抗病赤松(箭头示松材线虫), ×400;b.接种 8
h普通赤松(箭头示松材线虫), ×400;C.接种 12 h抗病赤松皮层薄壁细胞被线虫破坏 , ×400;c.接种 12 h 普通赤松围绕木树脂道的薄
壁细胞和木射线细胞变形 、破裂 , ×400;D.接种 24 h抗病赤松木质部树脂道薄壁细胞与木射线细胞轻微变形 , ×200;d.接种 24 h普通
赤松木树脂道与木射线均出现变形 、死亡 ,甚至严重破裂 , ×400;E.接种 36 h线虫侵染至抗病赤松近髓心的木树脂道 , ×200;e.接种 36
h线虫在普通赤松皮层大量繁殖 ,皮层薄壁细胞被完全破坏 , ×200;F.接种 48 h抗病赤松木树脂道泌脂细胞 、树脂道薄壁细胞 、木射线
细胞死亡 , ×800;f .接种 48 h线虫在普通赤松木树脂道大量繁殖 , ×400;G.接种 72 h 抗病赤松木质部树脂道薄壁细胞死亡 ,木树脂道
空洞 , ×400;g.接种 72 h普通赤松线虫侵染至髓心 ,髓心细胞半数死亡 , ×400;H .接种 96 h抗病赤松髓心仍可见到健康细胞 , ×400;
h.接种 96 h普通赤松髓心细胞死亡 , ×400;I.接种 120 h抗病赤松髓心部分细胞仍较正常, ×400;i. 接种 120 h 普通赤松髓心细胞死
亡,形成空洞 , ×400)
接种 72h后 ,抗病赤松接种点处木质部树脂道薄壁细胞死亡 ,木树脂道空洞 ,髓心部分细胞死亡(图
2G)。线虫侵染至近髓心树脂道;在取样茎段中木质部树脂道薄壁细胞木射线细胞半数死亡 。线虫在
皮层大量繁殖 ,皮层遭到破坏 。普通赤松接种点处 ,线虫侵染至髓心及近髓心树脂道 ,髓心细胞半数死
亡;在取样茎段中均可见木树脂道周围薄壁细胞死亡 、破裂 ,木射线细胞死亡 ,木射线开裂(图 2g);接种
96 h后 ,引进赤松接种点处木质部树脂道形成空洞 ,但髓心仍可见到健康细胞(图 2H)。距离接种点上
1. 5 cm 处 ,木质部树脂道形成空洞 ,木射线细胞死亡 、破裂 ,髓心细胞较正常 。而距离接种点下 3. 5 cm
处木质部树脂道薄壁细胞死亡 ,部分树脂道破裂 ,但髓心细胞健康。普通赤松接种点处形成层细胞死
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亡 ,皮层与木质部剥离(图 2h);接种点处的髓心细胞均死亡 ,木射线与树脂道薄壁细胞死亡 ,形成大面
积空洞;接种 120 h 后 ,引进赤松接种点处形成层与木质部剥离 ,木射线与树脂道细胞死亡 ,髓心半数细
胞死亡(图 2I)。距离接种点上 1. 5 cm ,木射线与树脂道细胞死亡 ,形成空洞 ,髓心有部分细胞死亡;线
虫在距接种点下 3. 5 cm 处木树脂道内大量繁殖 ,近髓心树脂道形成空洞 ,但髓心部分细胞仍较正常。
普通赤松接种点及远离接种点部位 ,轴向和射线薄壁细胞都已死亡 ,形成空洞(图 2i)。
3　讨　论
引进的抗病赤松 27个家系对 3种来源不同的松材线虫的抗病性存在显著差异 ,且对来自日本的强
毒松材线虫表现出的抗病性高于对中国本土的强毒松材线虫。这可能是因为日本线虫与中国线虫在致
病力上存在差异 ,且引进的抗病赤松以往曾针对日本本土松材线虫进行了抗性筛选 。在自然条件下 ,不
同种 、同种不同种源的松树对松材线虫的抗性存在差异[ 4-8] 。在实验中 ,抗病赤松各家系间抗病性差异
明显(P<0. 000 1),其中有 13个家系(1 、4 、5 、6 、7 、8 、13 、14 、15 、17 、20 、23和 25号)表现良好 ,约占供试
家系的 50%。
试验中发现引进的抗病赤松个别家系较普通赤松早出现针叶下垂失水的情况 ,但感病后病程发展
缓慢 ,较长一段时间停留在发病Ⅰ级水平上。而普通赤松一旦出现感病症状 ,病情迅速发展 ,很快枯萎
死亡 。这表明抗性赤松具有较强的抗病性 ,可能是生理调节能力或补偿能力较强 ,而普通赤松一旦失水
就表现为茎枯 ,很快死亡 。这方面仍需进一步研究 。
所引进的抗性赤松优良家系是日本经过抗性单株选择 、穂条嫁接和两次人工接种筛选后所确定的
92个赤松无性系中的 27个 。此次抗病性测定结果表明 ,大部分家系的抗病性与其在原产地的抗病性
评价基本一致[ 9] ,也有部分与原产地结论不同 ,这可能与不同环境条件下的同种松树对松材线虫的抗性
存在差异 ,而且松树在不同立地条件 、不同生长状况和不同的生长阶段其抗病性有所不同均有关[ 10] 。
日本在进行抗病松苗抗性测定时多采用 2年生野外松苗接种 ,而此次试验供试松苗为 1. 5年生且在温
室中完成接种试验 ,加上用于接种的松材线虫及其浓度都不相同 ,试验结果也就可能存在差异 。
对引进松苗的早期组织解剖学观察表明 ,松材线虫在引进的抗性赤松内的扩散速度比在普通赤松
内要慢 ,且病程发展的进程也存在明显的差异 ,抗性赤松体内木射线细胞与围绕树脂道泌脂细胞的薄壁
细胞 ,出现病变要比普通赤松晚。因此 ,抗性赤松的受害程度明显比普通赤松轻 ,表现出一定的抗病性。
同时 ,通过组织切片观察到在松材线虫还没有大量繁殖前 ,松苗细胞已经出现了明显的内部变化 ,这可
能与松材线虫所分泌的一些物质在松苗中转导有关 ,对这方面还需进一步的研究。
[ 参 考 文 献 ]
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(责任编辑　王国栋)
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