全 文 ：［收稿日期］ 20150104( 016)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目( 81360568) ;新疆维吾尔自治区高校科研计划重点项目( XJEDU2012I25)
［第一作者］ 袁芳，博士，副教授，从事维吾尔药物的应用基础研究，Tel: 0991-4362465，E-mail: yuanfang398@ 163． com
［通讯作者］ * 胡汉华，博士，教授，从事维吾尔医药药理机制的研究，Tel: 0991-4362225，E-mail: huhanhuaster@ gmail． com
琐琐葡萄多糖对阿尔茨海默病细胞模型 APP表达的影响
袁芳，周勇，盛磊，胡汉华*
( 新疆医科大学 基础医学院，乌鲁木齐 830011)
［摘要］ 目的:观察琐琐葡萄多糖( polysaccharide from Vitis viniferal，VTP) 对 β-淀粉样蛋白25-35 ( Aβ25-35 ) 诱导 PC12 细胞 β-
淀粉样前体蛋白( beta-amyloid precursor protein，APP) 基因表达的影响，探讨 VTP 在阿尔茨海默病( Alzheimers disease，AD) 发
病机制中的作用。方法:体外培养 PC12 细胞，分为对照组，AD模型组( 20 μmol·L －1Aβ25-35作用 24 h) ，VTP低、中、高剂量组质
量浓度分别为 20，40，80 mg·L －1。VTP作用 24 h后，检测细胞活性、超氧化物歧化酶( SOD) 活力、丙二醛( MDA) 含量和细胞
超微结构，采用实时荧光定量 PCＲ( real-time PCＲ) 检测 APP mＲNA表达。结果:与正常组比较，模型组细胞活性及 SOD 活力
降低( P ＜ 0. 01) ，MDA含量及 APP mＲNA表达增高( P ＜ 0. 01 ) ，细胞超微结构明显异常; 与模型组比较，给药组细胞活性及
SOD活力增强( P ＜ 0. 05) ，MDA含量及 APP mＲNA表达下降( P ＜ 0. 01) ，减轻神经细胞损伤。结论: VTP对 Aβ25-35诱导的氧化
损伤有保护作用，通过抗氧化和调节 APP mＲNA表达，抑制 Aβ形成，保护神经细胞，起到防治 AD的作用。
［关键词］ 阿尔茨海默病; 琐琐葡萄多糖; PC12 细胞; 氧化损伤; β-淀粉样前体蛋白
［中图分类号］ Ｒ285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903( 2015) 18-0107-04
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2015180107
Effect of Polysaccharide from Vitis viniferal on Expression of APP in Alzheimers Disease Cell Model
YUAN Fang，ZHOU Yong，SHENG Lei，HU Han-hua* ( College of Basic Medicine，Xinjiang Medical
University，Urumqi 830011，China)
［Abstract］ Objective: To investigate protective effect of polysaccharide from Vitis viniferal ( VTP) on
expression of beta-amyloid precursor protein ( APP) in PC12 cells induced by β-amyloid protein25-35 ( Aβ25-35 ) ，in
order to discuss the mechanism of VTP in pathogenesis of Alzheimers disease ( AD ) ． Method: Alzheimers
disease ( AD) cell model was established by inducing PC12 cells with 20 μmol·L －1 Aβ25-35 for 24 h and intervened
with different concentrations of VTP ( 20，40，80 mg·L －1 ) ． Cell viability was detected by CCK-8. The activities of
dismutase superoxide ( SOD) and malondialdehyde ( MDA) were measured． The expression of APP mＲNA was
quantified by real-time PCＲ． Ｒesult: Compared with the normal group，the model group showed decreases in cell
viability and SOD activity ( P ＜ 0. 01 ) and increases in MDA content and APP mＲNA expression ( P ＜ 0. 01 ) ．
Compared with the model group，cell viability and SOD activity were increased ( P ＜ 0. 05) ，MDA content and APP
mＲNA expression were decreased in VTP groups ( P ＜ 0. 05 ) ， indicating the relief in neuronal injury．
Conclusion: VTP has a protective effect in the oxidative injury induced by Aβ25-35 and plays a role in preventing
and treating AD by resisting oxidation，adjusting APP mＲNA expression，inhibiting Aβ formation and proteting
neurocytes．
［Key words］ Alzheimers disease; polysaccharide from Vitis viniferal; PC12 cells; oxidative damage;
beta-amyloid precursor protein
阿尔茨海默病 ( AD) 亦称老年痴呆，以慢性进
行性不可逆记忆减退、认知障碍和人格改变为主要
临床特征。随着老龄化社会的进程，老年痴呆、帕金
森病等神经退行性疾病严重威胁着老年人的身体健
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康和生活质量，给社会和家庭带来了沉重的负担。
因此，对于 AD 的预防与治疗是当前老年人群保健
急需解决的问题。随着对 AD 发病机制的深入研
究，天然药物预防和治疗 AD的作用成为研究热点。
琐琐葡萄( Vitis vinifera) 在我国主产于新疆吐鲁番、
和田等地，是药用葡萄品种之一。本课题组从琐琐
葡萄提取了多糖、黄酮、三萜等活性物质，研究其抗
突变、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等医药保健功
能［1-3］。本研究采用 Aβ25-35 ( beta-amyloid protein25-35 )
诱导 PC12 细胞氧化损伤建立 AD细胞模型，探讨琐
琐葡萄多糖 ( VTP ) 通过调节 β-淀粉样前体蛋白
( APP) 表达对 AD的保护作用及机制。
1 材料
1. 1 药物与试剂 琐琐葡萄购自新疆维吾尔自治
区吐鲁番维药市场，新疆药物研究所张彦福研究员
鉴定为 Vitis vinifera的成熟干燥果实，刘涛教授提取
及纯化 VTP ( 葡萄多糖及其提取方法和应用，马龙
等，发明专利 200710201354 ) ，含量为 8. 19%，VTP
批号 20101025。Aβ25-35 ( 美国 Sigma 公司，批号
108k4794，Aβ25-35溶于超纯水浓度为 10
－3 mol·L －1，
37 ℃老化 7 d，临用前稀释) ，DMEM 高糖培养液
( Hyclone公司) ，胎牛血清( 杭州四季青公司) ，超氧
化物歧化酶( SOD) 试剂盒( 批号 20120706) ，丙二醛
( MDA) 试剂盒( 批号 20120703) 由南京建成生物研
究所提供，CCK-8 检测试剂盒 ( 武汉博士德生物工
程有限公司，AＲ1160 ) ，Trizol ( Invitrogen，批号
50175111) ，逆转录试剂盒( TaKaＲa，批号 D6110A) ，
荧光定量试剂( Invitrogen) 。
1. 2 仪器 3110 型水套系列二氧化碳培养箱( 美
国 Thermo公司) ，Heraguard ECO 型超净工作台( 美
国 Thermo 公司) ，680 型全自动酶标仪 ( 美国 Bio-
Ｒad公司) ，DU800 型紫外-可见分光光度计 ( 美国
Beckman公司) ，9700 型 PCＲ 仪 ( 美国 ABI 公司) ，
7700 型 Ｒeal Time PCＲ System ( 美国 ABI 公司 ) ，
JEOL1230 型透射电镜( 日本 JEOL公司) 。
1. 3 细胞 PC12 细胞 ( 高分化) 具有神经内分泌
细胞特性，为大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤的细胞株，
购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。细
胞培养液含 10%灭活胎牛血清 1%双抗的 DMEM
高糖培养液，培养条件 37 ℃ 5%CO2，隔天换液，2 ～
3 d传代。
2 方法
2. 1 Aβ25-35诱导 PC12 细胞损伤建立 AD 模型 培
养 PC12 细胞至对数生长期，接种于 96 孔板，每孔
5 × 103 个细胞，培养细胞贴壁后，加入终浓度 0，10，
20，30，40 μmol·L －1Aβ25-35，继续培养 24 h 后 CCK-8
试剂盒检测细胞活性。
2. 2 AD 模型细胞活性的测定 对数生长期的
PC12 细胞 5 × 104 /mL 接种于 96 孔板，每孔 100
μL，培养至贴壁，设对照组，模型组，实验组( 20，40，
80 mg·L －1VTP) ，各组均为 5 复孔，实验组加入 VTP
预处理 4 h后，除对照组外均加入 Aβ25-35，使之终浓
度为 20 μmol·L －1，继续培养 24 h，CCK-8 试剂盒检
测 PC12 细胞活性。
2. 3 细胞电镜标本制备 对数生长期 PC12 细胞
5 × 104 /mL接种到 6 孔板，每孔 1 mL，按上述方法
分组处理细胞后，收集细胞 PBS 洗 2 次，加入血清
离心，戊二醛前固定，制备电镜标本，超薄切片机切
片，电子染色，透射电镜观察、摄片，观察 Aβ25-35对细
胞超微结构的影响，以及药物对细胞损伤的保护
作用。
2. 4 SOD，MDA的测定 细胞接种于 48 孔板，1 ×
104 个 /孔，细胞培养至贴壁后，分组进行处理( n =
5) ，收集细胞上清液，按照试剂盒说明紫外分光光
度计检测 SOD，MDA。
2. 5 AD细胞模型 APP mＲNA 表达的测定 对数
生长期细胞接种到 6 孔板，每孔细胞数 5 × 104 个，
按照实验分组处理细胞 ( n = 5 ) ，胰酶消化收集细
胞，Trizol法提取总 ＲNA，紫外分光光度计检测 ＲNA
浓度和纯度。逆转录合成 cDNA，加入荧光定量
PCＲ反应体系，反应条件 94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，
57 ～ 52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃10 min，35 个循环。
通过 GenBank，应用软件 Primer 5. 0 设计引物序列，
由鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。β-actin
及 APP 引物序列分别为 5-AGACCTTCAACAC-
CCCAGCC-3， 5-CGTCAGGCAGCTCATAGCTC-3，
5-TTGAAGCCATGCTCAATGAC-3，5-GTTCATGCG
CTCGTAGATCA-3，扩增的目的基因片段分别为
362，245 bp。采用双标准曲线法，计算待测组目的
基因相对于对照组的表达差异倍数。
2. 6 数据处理 试验数据均以 珋x ± s 表示，用 SPSS
18. 0 软件进行统计处理，组间比较用 t检验，以P ＜
0. 05 为差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 Aβ25-35对 PC12 细胞活性的影响 与对照组细
胞比较，Aβ25-35与 PC12 细胞作用 24 h 后，随着
Aβ25-35浓度的增加细胞活性逐渐降低，20 μmol·L
－1
以上浓度 Aβ25-35均对细胞造成损伤( P ﹤ 0. 01 ) ，见
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图 1。AD 细胞模型建立条件为 20 μmol·L －1的
Aβ25-35作用 PC12 细胞 24 h。
与对照组相比1) P ＜ 0. 01
图 1 不同浓度 Aβ25-35对 PC12 细胞活性的影响( 珋x ± s，n = 5)
Fig． 1 Effects of different concentrations Aβ25-35 on cell viability in
PC12 cells( 珋x ± s，n = 5)
3. 2 VTP 对 PC12 细胞活性的影响 与对照组比
较，模型组细胞生长受到抑制，细胞活性下降 ( P ＜
0. 01) ;与模型组相比，VTP 各组细胞活性有明显增
加( P ＜ 0. 05) ，表现剂量相关性。见表 1。
表 1 VTP对 Aβ25-35诱导的 PC12 细胞活性的影响( 珋x ± s，n = 5)
Table 1 Effects of VTP on cell viability in PC12 cells induced by
Aβ25-35 ( 珋x ± s，n = 5)
组别 质量浓度 /mg·L －1 细胞活性 /A 细胞存活率 /%
对照 － 0. 610 ± 0. 017 100. 00
模型 － 0. 415 ± 0. 0171) 68. 03
VTP 20 0. 483 ± 0. 0292) 79. 18
40 0. 521 ± 0. 0872) 85. 41
80 0. 555 ± 0. 0323) 90. 98
注: 与对照组相比1) P ＜ 0. 01; 与模型组相比2) P ＜ 0. 05，3) P ＜
0. 01( 表 2 ～ 3 同) 。
3. 3 VTP 对 PC12 细胞超微结构的影响 对照组
PC12 细胞结构正常，模型组和对照组比较，细胞明
显损伤，细胞形态不规则，细胞皱缩，胞质内细胞器
肿胀，有空泡形成，核内异染色质增多，凝聚成块状，
细胞核固缩，核仁消失，呈现细胞凋亡初期形态改
变; VTP 组和模型组比较，损伤细胞明显减少，细胞
形态趋于正常。见图 2。
3. 4 VTP对 PC12 细胞 SOD，MDA的影响 模型组
与对照组比较，细胞的 SOD 活力降低，MDA 含量明
显增加( P ＜ 0. 01) ; VTP各剂量组与模型组相比，细
胞 SOD活力增加，MDA 含量明显降低( P ＜ 0. 05 ) 。
见表 2。
3. 5 VTP 对 PC12 细胞 APP mＲNA 表达的影响
Ｒeal-time PCＲ 结果显示，与正常对照组相比，模型
A．对照组; B．模型组; C． VTP 80 mg·L －1组
图 2 VTP对 Aβ25-35所致 PC12 细胞损伤超微结构的影响( 透射电
镜，× 4 000)
Fig． 2 Effects of VTP on cellular ultrastructure in PC12 cells
induced by Aβ25-35 ( transmission electron microscopy，× 4 000)
表 2 VTP 对 Aβ25-35诱导的 PC12 细胞 SOD 活性，MDA 含量的影
响( 珋x ± s，n = 5)
Table 2 Effects of VTP on SOD activity and MDA content in PC12
cells induced by Aβ25-35 ( 珋x ± s，n = 5)
组别 质量浓度 /mg·L －1 SOD /U·mL －1 MDA /μmol·L －1
对照 － 29. 24 ± 2. 03 10. 18 ± 0. 58
模型 － 15. 67 ± 2. 131) 17. 92 ± 1. 621)
VTP 20 19. 90 ± 2. 082) 15. 14 ± 0. 282)
40 24. 17 ± 2. 443) 13. 11 ± 1. 083)
80 27. 76 ± 2. 103) 9. 06 ± 1. 683)
组 APP mＲNA表达下降( P ＜ 0. 01) ;与模型组相比，
VTP各剂量组 APP mＲNA表达升高，差异显著( P ＜
0. 05) ，见表 3。
表 3 VTP对 Aβ25-35诱导 PC12 细胞 APP mＲNA 相对表达的影响
( 珋x ± s，n = 5)
Table 3 Effects of VTP on APP mＲNA expression in PC12 cells
induced by Aβ25-35 ( 珋x ± s，n = 5)
组别 质量浓度 /mg·L －1 APP mＲNA相对表达 /倍
对照 － 1. 00 ± 0. 00
模型 － 5. 46 ± 0. 811)
VTP 20 2. 63 ± 0. 173)
40 0. 88 ± 0. 143)
80 0. 79 ± 0. 263)
4 讨论
AD的特征性的病理改变为: 神经细胞外以 Aβ
为主要成分的老年斑( senile plaque，SP) ，神经细胞
内主要成分为 tau 蛋白的神经元纤维缠结
( neurofibrillary tangles，NET) 。目前，在 AD 发病机
制的众多假说中，最受关注的“Aβ 级联假说”认为
AD是一种神经变性过程，Aβ 的沉积和聚集在 AD
发病过程中是关键因素［4］。Aβ 所引起的氧化应
激、细胞凋亡以及突触障碍、轴突生长异常等神经病
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理学变化，最终导致了 AD。在 AD发病机制及药物
筛选研究中，常用 Aβ 诱导建立体内体外模型［5-6］。
本研究采用 20 μmol·L －1 Aβ25-35作用于 PC12 细胞
24 h，构建 AD 细胞模型，实验结果显示，模型组细
胞活性，SOD 活性下降，MDA 含量增高( P ＜ 0. 01 ) ，
细胞超微结构明显损伤，表明此模型可以作为评价
VTP保护作用的神经损伤体外模型。
AD发生的主要危险因子是年龄，随着机体的
衰老，氧自由基生成增多，而抗氧化防御能力降低。
脑部神经细胞是自由基最容易侵袭的靶点，膜上含
有大量的不饱和脂肪酸，对脂质过氧化作用很敏感，
相比其他部位更容易受到氧化应激的影响。AD 的
发病与氧化应激密切相关，中药有效成分可通过抗
氧化作用治疗 AD［7-8］。琐琐葡萄中有含量较高的
多糖，具有较强的抗氧化能力［9］。实验结果显示，
模型组细胞活性及 SOD 活性下降，MDA 含量增高
( P ＜ 0. 01) ，细胞氧化损伤; VTP干预后细胞活性及
SOD活性升高，MDA 含量下降 ( P ＜ 0. 01 ) ，细胞形
态趋向正常，缓解细胞的氧化应激损伤。
Aβ是由 APP 经分泌酶裂解产生，由于神经细
胞膜的损伤，或 APP基因的过度表达及代谢异常均
可引起 Aβ的聚集［10］。APP转基因 AD 动物模型建
立的基础，就是小鼠脑中过量表达 APP，Aβ 产生增
多聚集形成老年斑，导致神经毒害作用，损伤学习记
忆能力，从而造成小鼠 AD转基因动物模型。在 AD
体外模型研究中也发现 APP的过度表达，导致神经
细胞死亡［11］。Aβ 可以在体内和体外诱导氧化应
激。氧化应激促进 Aβ 的生成和聚集，Aβ 又反过来
诱导氧化应激，从而进一步增加 Aβ 的沉积，如此形
成恶性循环，促进 AD 的发生［12］。氧化应激能通过
多种途径诱导 Aβ 生成，如激活细胞内腺苷酸环化
酶，活化第二信使 cAMP，促进 APP 的大量生成，
APP经分泌酶加工后形成 Aβ［13］。通过调节 APP的
表达和代谢从而减少产生 Aβ，减轻 Aβ 的神经毒
性，是防治 AD 的有效途径。本研究通过荧光定量
PCＲ检测 VTP 对 AD 细胞模型 APP 基因表达的影
响，结果显示: 与对照组比较，模型组细胞 APP
mＲNA表达上调，有显著性差异( P ＜ 0. 01 ) ，而 VTP
能下调细胞 APP mＲNA的表达。
综上所述，VTP对 Aβ25-35诱导 PC12 细胞的 AD
模型具有神经保护作用，通过增强 SOD 活性、降低
MDA含量，缓解细胞氧化损伤，抑制 PC12 细胞 APP
mＲNA的表达，减轻 Aβ 毒性作用，保护神经元，这
可能是 VTP防治 AD的作用机制之一。
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［责任编辑 聂淑琴］
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