全 文 ：鞘柄乌头对人肺癌 A549细胞增殖 、
侵袭和转移的影响及其机制
徐晓峰 1 ,陈银华 2 ,王　菊1 ,廖家军 1 ,吴金虎 1
(1.郧阳医学院附属人民医院中药药理实验室 ,湖北 十堰 442000;2.湖北省十堰市药品检验所 ,湖北 十
堰 442000)
　　摘要　目的:探讨鞘柄乌头对人肺癌 A549细胞增殖 、侵袭和转移的影响及其机制。方法:A549细胞分为 4
组:实验组分别给予 0.01、 0.1、 1 mg/mL鞘柄乌头处理 ,对照组给予等容量的溶媒。采用 MTT法检测鞘柄乌头对
A549细胞增殖的抑制作用;Transwel迁移实验观察鞘柄乌头对 A549细胞迁移的影响;Transwell结合基质胶实验
检测鞘柄乌头对 A549细胞侵袭的影响;酶谱法检测鞘柄乌头处理后对 A549细胞基质金属蛋白酶(MMP-2和
MMP-9)活力的影响。结果:0.01 ～ 1 mg/mL鞘柄乌头能浓度依赖性的显著抑制 A549增殖;Transwell迁移实验和
基质胶实验分别显示鞘柄乌头能抑制 A549细胞迁移和侵袭能力。鞘柄乌头处理之后 , MMP-2和 MMP-9活力均下
降。结论:鞘柄乌头可能是通过下调 MMP-2和 MMP-9活力 , 从而抑制 A549细胞增殖和侵袭转移。
关键词　鞘柄乌头;迁移;侵袭;基质金属蛋白酶
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)12-1909-04
EfectandMechanismofAconitumvaginatumontheProtiferation,
InvasionandMetastasisinHumanA549 LungCarcinomaCels
XUXiao-feng1 , CHENYin-hua2 , WANGJu1 , LIAOJia-jun1 , WUJin-hu1
(1.DepartmentofPharmacy, ThePeople′sHospitalofYunyang, Shiyan442000, China;2.Shiyancityinstituteofdrugcontrol, Shiyan
442000, China)
Abstract　Objective:TostudytheefectsandmechanismofAconitumvaginatumonproliferation, invasionandmetastasisofhu-
manlungadenocarcinomaA549celllines.Methods:A549 celsweretreatedwithAconitumvaginatumatdiferentconcentrations, and
dividedinto4 groups:Aconitumvaginatum0.01, 0.1, 1 mg/mLgroupsandcontrolgroup, respectively.MTTassaywasusedtoevaluate
celproliferation;migrationandinvasion(withmatrigel)assaywasconductedinthetranswellchamber;gelatinzymographywasper-
formedtoevaluatedtheimpactsofAconitumvaginatumonmatrixmetaloproteinase(MMP)-2, MMP-9.Results:Aconitumvaginatum
exhibitedaconcentration-dependentinhibitoryonproliferationandinvasionofA549 cels.Aconitumvaginatumwasalsofoundtode-
creasetheactivityofMMP-2, MMP-9 inaconcentration-dependentmanner(P<0.05).Conclusion:Aconitumvaginatumcaninhibit
theproliferation, invasionandmetastasisofhumanadenocarcinomaA549cellines, themechchanismmaybedeceasingMMP-2, MMP-9
activity.
Keywords　Aconitumvaginatum;Migration;Invasion;MMPs
收稿日期:2009-11-24作者简介:徐晓峰(1975-),男,主管药师 ,硕士 ,主要从事中药药理研究;Tel:0719-8637262, E-mail:xxf 120@yahoo.cn。＊通讯作者:吴金虎 , Tel:13329850659, E-mail:wujinhuyx@ 163.com。
　　肺癌为当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一 。
非小细胞肺癌在肺癌中约占 75% ～ 80%〔1〕 ,且非小
细胞肺癌是一种高侵袭性 、高转移性的肿瘤 ,预后
差 〔2〕。肿瘤侵袭和转移是一个多环节 、多步骤的复
杂过程 ,侵袭行为是恶性肿瘤的关键特征 ,是导致肿
瘤转移的内因 〔3〕。恶性肿瘤细胞一旦离开原发部
位 ,临床治愈率将大大下降 ,因此阻止癌细胞的侵袭
行为是恶性肿瘤的关键特征。如何抑制肺癌细胞生
长 ,阻断癌细胞的侵袭与转移 ,是目前肿瘤治疗研究
的热点之一。鞘柄乌头(Aconitumvaginatum)是湖
北常用的一种药用草乌 ,该草药在民间用于抗肿瘤
疗效较好 〔4〕。此前笔者报道了鞘柄乌头对 S180细胞
的增殖均有抑制作用 〔5〕 ,另有文献报道乌头能抑制
肿瘤转移 〔6〕。然而鞘柄乌头在肺癌侵袭和转移中
的作用还不清楚。笔者在本实验中观察鞘柄乌头对
人肺癌 A549细胞增殖 、侵袭转移的影响 ,并研究了
鞘柄乌头对其基质金属蛋白酶活力影响 ,以期探讨
鞘柄乌头作为非小细胞肺癌侵袭转移拮抗药的可行
性。
1　材料
1.1　细胞株　人肺腺癌 A549细胞 ,引自北京大学
医学部病理室 。
·1909·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 12期 2010年 12月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2010.12.029
1.2　药品和试剂　鞘柄乌头(Aconitumvaginatum)
产于湖北省神农架林区 ,由神农架药检所石世贵主
任药师鉴定 。胎牛血清购自杭州四季青生物材料有
限公司;DMEM、胰酶购自美国 Gibco公司;MTT、
DMSO、琼脂糖 、丙烯酰胺 、双丙烯酰胺 、四甲基乙二
胺(TEMED)、过硫酸胺 、Triton-100、苏木精 、伊红 、十
二烷基磺酸钠(SDS)购自 Sigma公司;Transwel小
室(直径 6.5 mm、孔径 8 μm)购自美国 Costar公司;
Matrigel购自 BD公司;其余试剂均为国产分析纯 。
2　方法
2.1　细胞培养及分组　A549细胞培养于含 10 %
小牛血清 、100 U/mL青霉素和 100 μg/mL链霉素
的 DMEM培养液中 , 37 ℃、5 % CO2饱和湿度孵箱
培养 ,取对数生长期细胞用于实验。实验分为 4组:
①鞘柄乌头 0.01 mg/mL组;②鞘柄乌头 0.1 mg/mL
组;③鞘柄乌头 1 mg/mL组;④对照组:只加培养
基 。药物作用 48 h,收集细胞 ,作以下检查 ,每组设
3个复孔 。
2.2　MTT法检测细胞增殖　取对数生长期经不同
浓度的鞘柄乌头乙醇提取物(0.01、0.1、1 mg/mL)
预处理 48 h的 A549细胞制成单细胞悬液 ,空白对
照组加入等体积的溶媒 ,按 1 ×104 /孔接种于 96孔
板中 , 37 ℃、5% CO2培箱中贴壁培养 24 h后 ,每孔
加入 MTT15 μL(5 mg/mL),继续培养 24 h,弃上清
液 ,然后每孔再加入 DMSO180 μL,室温振荡 2 min,
用酶联免疫检测仪于 570 nm处测光密度 D(λ)值 ,
以 D(λ)570值的大小反映活细胞数量的多少 。每组
设 3个复孔 ,实验重复 3次 。
2.3　Trasnwel迁移实验　选择孔径为 8 μm的 in-
sert(上室)和 24孔培养板(下室)建立 Transwel迁
移系统 ,将经 0.01、0.1、1 mg/mL鞘柄乌头处理 48
h的 A549细胞重悬于含 0.1% BSA的无血清培养
液中 ,调整细胞浓度至 1×105 /mL。加 200 μL细胞
悬液于小室上室 ,小室下层放 500 μLDMEM培养
基 ,对照组为未经鞘柄乌头处理的细胞 。每组设 3
个复孔 ,孵育 12 h后终止实验 。取出小室 , 4%多聚
甲醇固定 10 min,苏木精染色 8 min,水洗 ,伊红染色
60 s, 70%乙醇冲 2洗 。用棉签擦掉上膜面的未穿
过膜的细胞 。在 400倍光学显微镜下随机选择 5个
视野 ,计数每个视野穿过膜的细胞数 ,取其均值并统
计分析 。
2.4　Trasnwel结合 matrigel检测细胞侵袭能力　
将经 0.01、 0.1、 1 mg/mL鞘柄乌头处理 48 h的
A549细胞重悬于含 0.1% BSA的无血清培养液中 ,
调整细胞浓度至 1 ×105 /mL,加入已涂有 1∶1 Matri-
gel胶的 Transwel小室上层 ,其后如前所述 ,每组设
3个复孔 ,孵育 24 h后终止实验 ,用苏木精-伊红染
色后 ,计数细胞并计算细胞侵袭率 。
侵袭率(%)=实验组侵袭细胞数对照组侵袭细胞数 ×100%
2.5　明胶酶谱法检测 MMP-2和 MMP-9活力　经
鞘柄乌头预处理后的 A549细胞经常规消化 ,以 1 ×
10
4细胞数接种于 48孔培养板中 ,常规培养 24 h,
使细胞贴壁 ,收集培养上清液。分离胶中加入终浓
度为 1 g/L的明胶 ,常规 SDS-PAGE电泳 24 h,电泳
结束后用蒸馏水漂洗数次后 ,转移到 100 mL2.5%
Triton-100溶液中 ,在摇床上低速摇动以洗脱 SDS。
30 min后 ,换新 Triton-100溶液 ,继续洗脱 1 h。蒸
馏水漂洗 ,加 100 mL明胶酶缓冲液(50 mmol/LTris
·HCl, 10 mmol/LCaCl2 , 200 mmol/LNaCl, 1 μmol/
LZnCl2 , pH7.5), 在 37 ℃恒温摇床中温育 18 h。
取出凝胶 ,蒸馏水漂洗 ,放入染色液(0.1%考马斯
亮蓝 R250染色 2 h,及脱色液脱色 2次 ,每次 15
min,显示出位于背景上的透亮带 ,弃去脱色液 ,终止
脱色 。凝胶经扫描成像 ,进行半定量分析 ,结果以条
图表示。
2.6　统计学处理　全部数据用 SPSS13.5软件包
进行统计处理 。计量资料用 x±s表示;各组及组间
比较用 t检验 。
3　结果
3.1　鞘柄乌头对 A549细胞活力的影响　MTT结
果表明 ,经不同浓度(0.01 ～ 1 mg/mL)鞘柄乌头预
处理 , A549细胞活力受到不同程度的抑制 ,随浓度
增加抑制作用开始显现并渐次增强(P<0.05),并
呈现出良好的浓度依赖性 , 1 mg/mL鞘柄乌头处理
后其活力仅为对照组的 31.5%,见图 1。
图 1　鞘柄乌头对 A549细胞活力的影响(n=3)
注:与对照组比较 , ＊P<0.05
3.2　鞘柄乌头对肺腺癌 A549细胞迁移运动能力
的影响　收集经鞘柄乌头预处理的细胞 ,采用 tran-
swel小室检测癌细胞侵袭情况 , HE染色发现 ,与对
·1910· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 12期 2010年 12月
照组比较 ,鞘柄乌头处理组癌细胞穿过滤膜的细胞
数明显下降 , 且呈浓度依赖性 。实验结果显示 ,
0.01、0.1、1 mg/mL鞘柄乌头作用 A549细胞 24 h,
A549细胞的迁移能力受到显著抑制(P<0.05或
P<0.01), 且与剂量呈正相关 , 抑制率分别为
21.6%、35.2%和 53.7%(图 2)。
图 2　鞘柄乌头对 A549细胞迁移的影响(×400)
A.对照组　B.0.01 mg/mL鞘柄乌头组　C.0.1mg/mL鞘柄乌头组　D.1 mg/mL鞘柄乌头组
3.3　鞘柄乌头对肺腺癌 A549细胞侵袭能力的影
响　采用 transwel小室 ,引入 Matrigel基质胶 ,模拟
体外侵袭模型中细胞外基质(ECM)的作用 ,观察了
鞘柄乌头对 A549细胞侵袭力的影响 。结果发现 ,
与对照组比较 ,不同浓度(0.01 ～ 1 mg/mL)鞘柄乌
头预处理组细胞侵袭力明显下降且呈浓度依赖性 ,
浓度为 1 mg/mL鞘柄乌头处理后细胞侵袭率仅为
对照组的 39.1%,结果见图 3。
图 3　鞘柄乌头 A549细胞侵袭的影响(n=3)
注:与对照级比较 , ＊P<0.05
3.4　鞘柄乌头对 MMPs活力的影响　采用酶谱法
分析 MMPs活力 ,实验结果表明 ,鞘柄乌头 0.01、
0.1、1 mg/mL作用 48 h能降低 MMP-2和 MMP-9
的活性 ,并呈一定的浓度依赖关系 ,不同浓度鞘柄乌
头预处理后 MMP-2活力分别是对照组的 74.6%、
55.5%、40.9%;MMP-9活力与对照组相比分别是
73.0%、53.9%、38.3%(图 4)。
图 4　酶谱法检测不同浓度鞘柄乌头对细胞
MMP-2和 MMP-9活力的影响(n=3)
注:与对照级比较 , ＊P<0.05
4　讨论
侵袭和转移是恶性肿瘤生物学特性之一 ,细胞
的黏附力 、运动力 、侵袭力是其侵袭转移的重要因
素 ,肿瘤侵袭转移最终成为大多数癌症患者死亡的
原因 。目前研究表明 ,肿瘤侵袭转移是一个多因素 、
多步骤参与的复杂过程〔3〕 ,其中细胞外基质(extra-
celularmatrix, ECM)降解和基底膜破坏是一个关键
步骤 , ECM是肿瘤侵袭和转移的天然屏障 〔7〕。肿瘤
细胞通过自身或诱导或激活宿主细胞产生多种基质
蛋白溶解酶导致 ECM的降解 ,在参与破坏 ECM的
·1911·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 12期 2010年 12月
酶类中 , Zn2 +依赖性基质金属蛋白酶(Matrixmetal-
loproteinase, MMP)与肿瘤侵袭转移的相关性最为密
切 。基质金属蛋白酶是一组重要的细胞外基质降解
酶 ,在肿瘤侵袭降解基质的过程中发挥着重要的作
用 ,其中 MMP-2和 MMP-9在肿瘤细胞介导的细胞
外基质降解中起关键作用 ,与多种肿瘤的侵袭与转
移有密切关系〔8, 9〕。
乌头类中药为毛茛科乌头属(Aconitum)植物 ,
主要用于寒湿痹痛 、心腹冷痛 、阴疽肿毒 〔10〕。现代
研究证实乌头类生物碱主要具有强心 、抗肿瘤 、镇痛
和免疫调节作用 〔11〕。文献记载 , 乌头碱浓度 200
μg/mL时可完全抑制人胃癌细胞 ,并抑制其有丝分
裂 , 对小鼠移植 实体肝癌抑 瘤率 47.77% ～
57.38%,对小鼠肉瘤 S180抑瘤率 57%,汤铭新等 〔6〕
报道 ,乌头碱对小鼠前胃癌 FC、小鼠肉瘤 S180等瘤
株均有抑制作用 ,抑瘤率 21.7% ～ 46.4%,并可抑
制 Lewis肺癌和胃癌转移自发转移 。此前研究已报
道鞘柄乌头能抑制肺癌 A549细胞等肿瘤细胞增
殖 ,但对其抗肿瘤侵袭转移的作用目前尚无系统 、深
入的基础研究〔12〕。因此笔者就鞘柄乌头在 A549细
胞中的迁移和侵袭作用进行研究 ,并推测其可能是
通过抑制 MMP活力最终抑制肺癌侵袭和转移 。
在本实验中 ,笔者观察到 0.01 ～ 1 mg/mL鞘柄
乌头即可显著抑制 A549细胞增殖 ,并可抑制细胞
迁移。此外本采用 matrigel胶(含有Ⅳ型胶原 、层粘
蛋白 、巢蛋白(entactin)、硫酸肝素蛋白多糖等成分 ,
与细胞外基质的成分非常相近 。)在体外模拟肿瘤
细胞的侵袭过程探讨鞘柄乌头对侵袭的影响 ,结果
鞘柄乌头能使穿过聚碳酸酯膜的胃癌细胞数量减
少 ,降低了 A549细胞的侵袭能力 。并且酶谱法分
析的结果也表明 0.01 ～ 1 mg/mL鞘柄乌头能浓度
依赖性降低 MMP-2和 MMP-9活力 ,因此笔者推测
鞘柄乌头抑制 A549细胞侵袭和转移可能是通过抑
制 MMP-2和 MMP-9活力。
参 考 文 献
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《中药材 》杂志为中国中文核心期刊。
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