全 文 ：中国药物警戒第11卷第5期 2014年5月 May,2014,Vol.11,No.5
藏药余甘子鞣质部位对HT1080细胞迁移与侵袭能力的影响研究
赵海娟 1，2龚曼 2 常青 2游云 2*张兰珍 1*（1北京中医药大学中药学院，北京100029；2中国中医科学院中药研究所，
北京100700）
中图分类号：R965 文献标识码：A 文章编号：1672-8629（2014）05-0264-04
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81274187）；北京中医药大学
自主课题（2009TYB22JS027）。
作者简介：赵海娟，女，在读硕士，中药药理。
*通迅作者 1：游云，女，博士，副研究员，硕士生导师，中药药理。
E-mail:youyunrice@126.com
*通迅作者2：张兰珍，女，博士，教授，博士生导师，中药药效物质基
础与质量控制研究。E-mail:zhanglanzhen01@126.com
摘要：目的探讨藏药余甘子鞣质部位对人纤维肉瘤细胞（HT1080）迁移和侵袭能力的影响。方法采用四甲基偶氮
唑盐（MTT）法检测余甘子鞣质部位对HT1080细胞活力的影响。分别采用划痕实验和Transwell侵袭实验法检测余
甘子鞣质部位对HT1080细胞迁移和侵袭能力的影响。结果余甘子鞣质部位作用48h能够显著抑制HT1080细胞
的增殖，其半数抑制浓度（IC50）为0.174g·L-1。与对照组比较，余甘子鞣质部位质量浓度为0.1g·L-1，作用3h后即可明
显降低HT1080细胞迁移面积；在质量浓度为0.025g·L-1时可明显降低HT1080细胞透过胶膜的数量，降低其侵袭
能力。结论余甘子鞣质部位可有效抑制人纤维肉瘤细胞迁移和侵袭能力。
关键词：余甘子；鞣质部位；迁移；侵袭
EffectofTanninPartofTibetanMedicinePhyllan husEmbl caontheM grationandInvasionofHT1080Cells
ZHAO Hai-juan1,2 GONG Man2 CHANG Qing2 YOU Yun2* ZHANG Lan-zhen1* (1School of Chinese
Pharmacology, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China; 2Institute of Chinese Materia Medica,
China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)
Abstract：ObjectiveTo investiga e the effect of tannin part of Tibetan medicine Phyllanthus emblica on the migration
and invasion of human fibrosarcoma cells HT1080. MethodsMTT assay was performed to detect the inhibitory effect
of tannin part of Phyllanthus emblica of different concentrations on proliferation of HT1080 cells. Wound-healing
scrape assay and Transwell invasion assay were performed to assess the effect of tannin part on the migration and invasive
properties of HT1080 in vitro. ResultsTannin part of Phyllanthus emblica significantly inhibited the proliferation of
HT1080 cells after 48 hours treatment, the median inhibitory concentration(IC50) was 0.174g·L-1. Compared with
the control group, tannin part of emblica group of 0.1g·L-1 concentration significantly reduced the migration areas of
HT1080 cells. The number of invasive transmembrane cells was decreased significantly in 0.025g·L-1 tannin part group.
ConclusionTannin part of Phyllanthus emblica could inhibit migration and invasion of human fibrosarcoma cells in vitro.
Keywords：Phyllanthus emblica; tannin part; migration; invasion
余甘子为大戟科叶下珠属植物余甘子 Phyllanthus
emblicaL.的干燥果实，在历版《中国药典》中都作为常用
藏药被收载。在我国蒙药、维药、彝药、傣药等16个民族
药作为药用中，尤以藏药较为常用，藏药部颁标准收录的
藏药制剂中含有余甘子的制剂占29%，常与诃子，毛诃
子配伍使用被称为“三大果”，是藏药常用方剂的基础，
使用频率非常高。余甘子在藏药中常用来治疗“培根病”，
“赤巴病”和“血病”（血热血瘀）。现代药理研究表明余甘
子具有抗氧化、清除自由基、抗突变、抗诱变、降脂、抗动
脉粥样硬化、抗病毒、抗菌、抗炎、防衰老、降糖、抗溃疡、
抗腹泻等作用[1]，与余甘子在藏药中的应用相近。
余甘子提取物能阻断人体内强致癌性物质N-亚硝
基化合物的合成，对环磷酰胺诱发的小鼠骨髓细胞微核
发生和丝裂霉素诱发的小鼠睾丸细胞染色体畸变均有
明显的抑制效果；近期报道余甘子对S-180和H-22小
鼠移植性肿瘤生长也有明显的抑制作用，对体细胞和生
殖细胞的DNA损伤均有保护作用[2]。余甘子中富含鞣质
类、酚酸类、黄酮类及生物碱等成分[3]。研究表明其中酚
酸类和黄酮类成分具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤作用[4-5]。
本课题组前期研究发现余甘子鞣质部位对于肿瘤侵袭
和转移具有较好的抑制作用。侵袭和转移是恶性肿瘤的
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基本特征，也是导致肿瘤患者死亡的主要原因，因此防
止和阻断肿瘤的侵袭和转移是降低恶性肿瘤死亡率的
重要途径[6]。本研究以高转移性人纤维肉瘤细胞（HT1080）
为材料，采用MTT法检测余甘子鞣质部位对肿瘤细胞增
殖活性的影响，并采用划痕实验和Transwell体外侵袭实验
考察了余甘子鞣质部位对肿瘤细胞的迁移和侵袭能力
的影响，为余甘子抗癌活性的进一步研究提供实验依据。
1材料
1.1 细胞株
人纤维肉瘤细胞（HT1080）购自中国医学科学院基
础医学研究所细胞资源中心。
1.2 仪器
MCO-15A型CO2培养箱（日本三洋电机国际贸易
有限公司公司）；超净工作台（北京半导体设备一厂）；
DT5-6A 型台式离心机（北京时代北利离心机有限公
司）；NikonTi-S倒置显微镜（日本Nikon公司）；CCD相
机（美国Qimaging公司）；Model680型酶联免疫检测仪
（美国 BIO-RAD公司）；KQ2200B超声仪（昆山市超声
仪器有限公司）；96孔培养板、24孔Transwell细胞培养
板（8.0 m）及培养瓶（美国Corning公司）。
1.3 药品及试剂
余甘子鞣质部位，由本课题组自制，鞣质总含量大
于50%；注射用依托泊苷VP-16（山东济南齐鲁制药厂）；
MEM-EBSS培养基（美国HyClone公司）；胎牛血清（美
国 GIBCO 公司）；0.25%Trypsin-EDTA（美国 HyClone
公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT，美国 Amresco公司）；非
必需氨基酸（NEAA，美国 GIBCO 公司）；DMSO（美国
Sigma 公司）；青、链霉素（美国 Hyclone 公司）；Matrigel
TM基质胶（美国 BD 公司）；姬姆萨稀释液、姬姆萨浓
缩液（SoLarbio公司）。
2 方法
2.1 药品配制
2.1.1 余甘子鞣质部位溶液 余甘子鞣质部位储存溶液：
取余甘子鞣质部位粉末约1g，精密称定，将其加入2mL
DMSO中，超声使其完全溶解，配成质量浓度为0.5kg·L-1
的实验用母液，0.22 m微孔滤膜过滤，分装于-20℃储存
备用。实验前将余甘子鞣质部位母液（0.5kg·L-1）4℃解
冻。取少量母液用细胞培养液先稀释成1g·L-1，给药时
将1g·L-1的余甘子药液稀释成不同的工作浓度。
2.1.2 依托泊苷溶液 注射用依托泊苷 VP-16：分子量
为588.56，20g·L-10.22 m微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃
储存备用。实验前将放在-20℃的依托泊苷实验储存液，
4℃解冻。实验时用培养基调成所需浓度（20mM）。
2.2 细胞培养
HT1080 细胞培养于含 10%胎牛血清、100U·mL-1
青霉素、100U·mL-1链霉素的MEM培养基中，置于37℃、
5%CO2及饱和湿度的培养箱培养。细胞单层长到80%
时，用 0.25%的胰蛋白酶消化，1:3 传代，取对数生长期
细胞进行后续实验。
2.3 细胞增殖抑制实验
采用MTT法测定余甘子鞣质部位对HT1080细胞
增殖的影响。取对数生长期的肿瘤细胞常规消化制成单
细胞悬液，调整细胞浓度至1×105cells·mL-1左右，接种
于96孔培养板中，每孔100 L，置37℃、5%CO2培养箱
中培养24h后给药。空白对照组：每孔给100 L的细胞
培养基；阴性对照组：每孔给100 L的细胞悬液；实验组：
每孔给 100 L 的含药培养基使细胞给药终浓度达到
0.5g·L-1、0.25g·L-1、0.125g·L-1、0.0625g·L-1、0.03125g·L-1
共5个浓度；阳性对照组：每孔给100 L的依托泊苷溶
液使细胞给药终浓度达到10 mM，各组均设5个复孔。
给药后置于37℃，5%CO2培养箱中继续培养48h后，吸
弃孔中含药培养基，每孔加200 LPBS溶液冲洗2次，
弃去，再每孔加入新鲜MEM培养基180 L和MTT溶液
（5g·L-1）20 L，继续培养4h，培养结束后，弃上清，每孔加
入150 LDMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解。用酶标
仪测定各孔在570nm和630nm处的吸光度（OD）值。按下式
计算生长抑制率，求出IC50，评价药效。以上实验重复3次。
细胞生长抑制率 =（阴性对照孔 OD 值 - 给药组
OD值）/（阴性对照组OD值-空白组OD值）×100%。
2.4 划痕实验
取对数生长期的HT1080肿瘤细胞常规消化成单细
胞悬液，调整细胞浓度至 2.0×105cells·mL-1，接种于 24
孔板中，每孔1mL，置37℃、5%CO2培养箱中培养24h至
细胞长到90%融合，用20 L加样枪头在单层细胞层上
呈“一”字均匀划痕，用无菌的PBS清洗3次，洗去脱落
的细胞。此时作为划痕后0时刻，在显微镜下观察划痕
宽度，并拍照。细胞分组，分别设不同浓度余甘子鞣质部
位给药组和对照组。给药组分别加入含2%血清的含药
培养液1mL，使给药组的终浓度为 0.1g·L-1、0.05g·L-1、
0.025g·L-1共 3 个浓度，阴性对照组加入含 2%血清的
培养基 1mL，每个浓度设 3个复孔，置 37℃、5%CO2的
培养箱中培养，分别于加药后0h、3h、6h、9h观察划痕宽
度并以 CCD 相机拍照，Bioflux Montage 软件统计在同
一视野内细胞由划痕边缘向划痕内迁移的面积。
2.5 肿瘤细胞侵袭实验
将Matrigel用无血清培养基1:2稀释后铺于Transwell
侵袭小室聚碳酯膜（孔径为8 m）的上表面，置37℃60min
使其聚成凝胶。取对数生长期的HT1080肿瘤细胞常规
消化成单细胞悬液，调整所需细胞密度2.5×105cells·mL-1，
接种于6孔板中，每孔2mL，置37℃、5%CO2培养箱中培
μ
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养24h后给药。给药组：设置0.1g·L-1、0.05g·L-1、0.025g·L-1
3个浓度，每个浓度设3个复孔，阴性对照组加入等量的培
养基，孵育48h。将药物作用48h后的HT1080细胞消化收
集，用不含血清培养基调整细胞密度为2.5×105cells·mL-1，
接种于已铺 Matrigel TM胶的 Transwell板中，每孔接种
100 L，放入培养箱中培养。18h后取出上室，甲醇固定30min，
Giemsa染色 30min，清水漂洗 2次，擦去上室底部膜表
面上的细胞，小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上
用中性树胶封片，显微镜下观察计数穿膜细胞。
细胞侵袭抑制率=（阴性对照组穿膜细胞数-给药
组穿膜细胞数）/（阴性对照组穿膜细胞数）×100%。
2.6 统计学分析
采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析及多
组间比较，实验结果数据以 ±s表示。P<0.05为具有统
计学意义。
3 结果
3.1 余甘子鞣质部位对 HT1080细胞增殖的影响
余甘子鞣质部位抑制HT1080细胞增殖的量效曲线
见图1。药物处理48h可以显著抑制HT1080细胞增殖，
且抑制作用随着药物浓度的增加而增强。与对照组相比
较，余甘子鞣质部位质量浓度为0.25g·L-1时，对HT1080
的抑制率可达约80%，其半数抑制浓度（IC50）为0.174g·L-1。
3.2 余甘子鞣质部位对HT1080细胞迁移能力的影响
随着余甘子鞣质部位给药浓度的增加，细胞迁移
面积呈下降趋势。与对照组相比，余甘子鞣质部位质量浓
度0.1g·L-1，作用时间3h可明显抑制HT1080细胞迁移。
随着作用时间的延长，药物抑制效应增强，作用时间
9h，0.1g·L-1药物抑制细胞迁移的效应与对照组相比具
有极显著差异（图2）。与相同时间点的对照组相比，质
量浓度 0.025g·L-1和 0.05g·L-1对 HT1080 细胞迁移
未见明显影响（表1）。
3.3 余甘子鞣质部位对HT1080细胞侵袭能力的影响
由表2及图3可知，随着余甘子鞣质部位给药浓度
的增加，跨过Matrigel胶的HT1080细胞数量逐渐减少。
与对照组比较，0.025g·L-1、0.05g·L-1和0.1g·L-1给药组均
能够显著抑制HT1080细胞侵袭（P<0.05或P<0.001）；上
述实验表明，余甘子鞣质部位能够抑制HT1080细胞的
体外侵袭能力，且此抑制作用呈现剂量依赖性。
4 讨论
恶性肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病。从天
μ
χ
图 1 余甘子鞣质部位对 HT1080细胞活力影响的量效曲线
表 1 余甘子鞣质部位对 HT1080细胞迁移面积
的影响（ ±s,n=12）
组别 浓度（g·L-1）
迁移面积（mm2）
3h 6h 9h
对照组 0 0.15±0.03 0.32±0.04 0.45± .05
余甘子鞣质部位 0.025 0.15± 01 0.33±0.01 0.42± .02
0.05 0.15±0.01 0.33±0.02 0.40± .01
0.1 0.11±0.02* 0.24±0.04*** 0.34±0.07***
注：与对照组比较，*P <0.05，***P <0.001。
χ
图 2 余甘子鞣质部位对 HT1080细胞迁移能力的影响
A B
C D
E F
G H
注：A-D为细胞划痕实验起始（0h）图片。A为对照组，B、C、D分别为余甘子
鞣质部位 0.025、0.05、0.1g·L-1处理组；E-H为对照或药物处理 9h 后各组细
胞图片：E 为对照组，F、G、H分别为余甘子鞣质部位 0.025、0.05、0.1g·L-1处
理组。(×200)
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表 2 余甘子鞣质部位对跨膜细胞数量的影响（ ±s,n=12）
注：与对照组比较，*P <0.05，***P <0.001。
组别 浓度（g·L-1） 细胞数 抑制率（%）
对照 - 325.92±35.26 -
余甘子鞣质部位 0.025 247.67±66.10* 24.01
0.05 173.00±29.87*** 4692
0.1 101.25±22.67*** 68.93
χ
图 3 余甘子鞣质部位对 HT1080细胞侵袭能力的影响
注：A为对照组；B、C、D分别为余甘子鞣质部位 0.025g·L-1、0.05g·L-1、0.1g·L-1处
理组。（×200）
A B
C D
然植物中寻找新的抗肿瘤药物已成为新药研究与发展
的主要方向之一。余甘子作为养生保健的常用民族药
物，其抗肿瘤活性也逐渐受到重视。余甘子果实中的单
宁与维生素C协同具有抗肿瘤及抗诱变作用[1]。余甘子
果汁可降低红细胞促淋巴细胞粘附肿瘤细胞的能力，并
可抑制S180荷瘤小鼠肿瘤的生长[7]。本研究采用MTT
法检测了余甘子鞣质部位对人纤维肉瘤细胞 HT1080
增殖活性的影响，结果表明余甘子中的鞣质成分能够显
著抑制肿瘤细胞的增殖，且抑制率随药物浓度的增加而
提高，证实余甘子鞣质成分具有很好的抗肿瘤活性。此
外，本课题组研究发现余甘子鞣质成分的抗肿瘤作用与
其诱导肿瘤细胞凋亡有关（数据尚未发表）。
为了对余甘子进行药用植物资源的深层开发，我们
对余甘子鞣质部位开展了抗肿瘤迁移与侵袭的实验研
究。转移是恶性肿瘤最基本和最重要的生物学特性之
一，是一个多步骤、多阶段、多基因参与的复杂过程[8]，细
胞内外的多种细胞因子、蛋白酶、信号转导通路蛋白、受
体等都参与了肿瘤细胞转移的过程[9]，研究药物抗肿瘤
转移的作用机制有利于抗癌药物的进一步开发。Zeng
等[10]研究发现，ERK1/2信号通路与 c-Myc基因在肿瘤
细胞G1细胞周期阻滞和细胞凋亡过程中发挥着关键作
用，其激活表达可诱导肿瘤细胞发生侵袭和转移。赵晨
阳等[11]研究发现 TGF-β1和 E-cadherin 的表达在一定
程度上可诱导肝癌细胞的迁移和侵袭。本研究通过划痕
实验和人工重组基底膜体外侵袭实验考察了余甘子鞣
质部位对HT1080细胞迁移和侵袭能力的影响，结果显
示余甘子中的鞣质成分能够显著抑制肿瘤细胞的迁移
和侵袭，且其抑制作用与药物浓度呈正相关。在肿瘤细
胞的侵袭和转移过程中，通常伴有基质金属蛋白酶
（MMPs）含量与活性的升高[12]。MMPs可以降解肿瘤细
胞表面基质（ECM）从而形成瘤细胞转移通路，促进瘤细
胞转移。目前对于余甘子鞣质类成分体外抗肿瘤细胞转
移的作用机制尚不明确，我们将从基质金属蛋白酶及细
胞信号传导等方面深入开展余甘子鞣质部位抗肿瘤转
移的机制研究。
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（收稿日期：2014-02-19 编辑：井春梅）
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