全 文 ：毛茛总苷对肾性高血压大鼠血压、NO、
AngⅡ及 A7r5 细胞内钙的影响
刘守钾，刘 苑，张 兴，杨智承，刘威振，谭毓治*
(广东药学院药科学院药理学教研室，广东 广州 510006)
摘要 目的:探讨毛茛总苷对肾性高血压大鼠的血压、血清一氧化氮(NO)、血浆和心肾组织中血管紧张素Ⅱ
(AngⅡ)以及血管平滑肌细胞内钙的影响。方法:采用二肾一夹(2K1C)肾性高血压大鼠模型，连续灌胃给药 5 w，5
w 末测定血压，检测血清中一氧化氮、血浆和心、肾组织中 AngⅡ含量;采用新一代 Ca2 +荧光探针 Fluo-3 /AM 标记
培养的血管平滑肌细胞内钙，荧光倒置显微镜观察荧光成像和荧光分光光度计测量细胞内钙荧光强度，观察毛茛
总苷对大鼠血管平滑肌细胞内 Ca2 +水平的影响。结果:毛茛总苷高、中剂量能降低肾性高血压大鼠血压水平(P ＜
0. 05) ，其各剂量均能显著的升高大鼠血清中 NO含量(P ＜ 0. 01) ，但对大鼠体内的 AngⅡ含量无显著影响;毛茛总
苷各剂量均能降低由 AngⅡ引起的细胞内钙离子浓度升高。结论:毛茛总苷能降低肾性高血压大鼠的血压，其降压
作用可能与其能显著的升高大鼠 NO水平及拮抗 AngⅡ引起的血管平滑肌细胞内钙升高有关。
关键词 毛茛总苷;肾性高血压;一氧化氮;血管紧张素;血管平滑肌细胞
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454-(2012)06-0953-05
Effect of TGRJ on Blood Press，NO and AngⅡ in Renal Hypertensive Rats
LIU Shou-jia，LIU Yuan，ZHANG Xing，YANG Zhi-cheng，LIU Wei-zhen，TAN Yu-zhi
(Department of Pharmacology，Guangdong Pharmacy University，Guangzhou 510006，China)
Abstract Objective:To study the effect of total glycosides of Ranunculus japoniucus(TGRJ)on blood pressure，nitric oxide(NO)
calcium and angiotensinⅡ (AngⅡ)in renal hypertensive rats(RHR). Methods:1)RHR were established by two kidney one clip
(2K1C)and drugs were given by intragastric administration for 5 week，the blood pressure were measured at the end of 5 week，detec-
ted the concentration of NO in the serum and AngⅡ in the blood plasma，heart and kidney tissue. 2)Used a new generations of Ca2 +
fluorescent probe (Fluo-3 /AM)to mark calcium in vascular smooth muscle cells. Observed the fluorescence imaging by inverted fluo-
rescence microscope and measured the fluorescence intensity of calcium by fluorescence spectrophotometer in vascular smooth muscle
cells. Results:1)The high，medium doses of TGRJ could decrease blood pressure of RHR (P ＜ 0. 05) ，TGRJ could significantly in-
crease the concentration of NO in the serum(P ＜ 0. 01) ，but it showed no significant effect on the concentration of AngⅡ(P ＞ 0. 05) ;
2)The Ang Ⅱ could significantly promote the calcium ions in extracellular inner flow. The different doses of TGRJ could reduce the
calcium ions in cells which were mediated by AngⅡ. Conclusion:TGRJ could decrease blood pressure in RHR. the mechanism might
be related to increasing the rats NO level and reducing the calcium ions level in cells which are increased by AngⅡ.
Key words Total glycosides of Ranunculus japoniucus;Renal hypertensive;Nitric oxide;AngiotensinⅡ;Vascular smooth muscle
cells
收稿日期:2011-10-27
基金项目:广东省科技厅课题(2004B30101002)
作者简介:刘守钾(1985-) ，在读硕士研究生，主要从事药物筛选与机制研究;Tel:15820766214，E-mail:liushoujia@ 126. com。
* 通讯作者:谭毓治，E-mail:tanyuzhi@ 163. com。
笔者前期研究发现毛茛总苷具有抗心肌肥厚、
抑制心肌胞大、抑制血管平滑肌增生、舒张动脉血
管、降低正常大鼠血压、改善大鼠血流动力学、拮抗
去甲肾上腺素或氯化钾引起的细胞钙内流等药理作
用〔1-6〕。本实验采用肾性高血压模型，进一步探讨
毛茛总苷的降压作用，并对其降压机制进行探
讨。
1 材料与仪器
1. 1 实验动物 SPF级 SD大鼠，150 ～ 170 g，雌雄
各半，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号:
SCXK(粤)2008-0002。
1. 2 细胞株 A7r5 细胞购于中科院上海细胞库。
1. 3 药物与试剂 AngⅡ放免分析测定试剂盒，北
京北方生物技术研究所，批号:20101124;一氧化氮
测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号
20101105;Fluo-3 /AM购于北京鼎国生物技术有限
责任公司，批号:6F0221;血管紧张素Ⅱ，购于德国默
克，批号:D00084133。
1. 4 主要仪器 BP-6 无创血压测定仪，成都泰盟
科技有限公司;UV-2550 型紫外分光光度计，日本岛
·359·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 35 卷第 6 期 2012 年 6 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2012.06.033
津公司;生物荧光倒置显微镜(Leica IM50) ，德国莱
茨公司;荧光分光光度计(RF-5301PC) ，日本津岛;
细胞培养箱，美国 Thermo电子电器公司。
2 方法
2. 1 毛茛总苷的制备 毛茛全草晾干切碎，85%
乙醇回流提取 3 次，过 80 目筛，合并提取液，减压浓
缩回收溶剂，得膏状物经 D-101 大孔树脂吸附，水
洗，弃去，用30% ～60%乙醇洗脱，收集此部位，水浴
蒸干乙醇得膏状物即毛茛总苷，同时测定水分含量。
实验时用生理盐水配成所需浓度。经采用超高效液
相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术
(UPLC /Q-TOF-MS)对毛茛总苷的化学成分进行分
析，其主要成分包括内酯苷、黄酮苷和黄酮苷
元〔7〕。
2. 2 肾性高血压模型建立及给药方案 按照文献
方法〔8〕建立二肾一夹(2K1C)肾性高血压大鼠模
型，术后常规饲养，第 5 周开始用 BP-6 无创血压测
试仪测血压，参照上海市高血压研究所顾得官等〔9〕
的标准，即造模处理后血压比处理前高于 20 mmHg
(大于正常血压 3 个标准差值)以上且高于 115 mm-
Hg者确定为高血压疾病模型形成。将造模成功的
大鼠按血压高低随机区组的方法分成 5 组，给药剂
量分别为毛茛总苷高(400 mg /kg)、中(200 mg /
kg)、低(100 mg /kg)剂量组及氯沙坦钾组(10 mg /
kg)模型组。灌胃容积为 10 mL /kg。第 5 周血压测
定后开始给药，连续给药 5 w。
2. 3 细胞培养及给药方案 A7r5 大鼠胸大动脉
平滑肌细胞用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养液，
37 ℃，5%CO2 恒温孵箱内常规培养，至细胞处于生
长对数期用于实验。给药剂量分别为毛茛总苷高
(400 μg /mL)、中(200 μg /mL)、低(100 μg /mL)剂
量组及硝苯地平组(10 μg /mL)、空白对照组
(PBS)。加入不同浓度的毛茛总苷孵育 1 h 后，再
加入终浓度为 10 －6 mol /mL的 AngⅡ孵育 45 min。
2. 4 血压测定 在安静的环境中，BP-6 无创血压
测试仪预热后，将大鼠置恒温加热箱中预热 10 ～ 15
min 后测取收缩压，连续观察待脉搏波稳定后取 5
个加压前后波段测定，取平均值。
2. 5 血清 NO含量测定 各组大鼠乙醚麻醉后眼
眶取血 1. 5 mL，4 ℃，3 000 r /min 离心 15 min，取上
层血清采用硝酸还原酶法测定 NO的含量。
2. 6 血浆中 AngⅡ含量测定 经眼眶采血 2 mL
置于含酶抑制剂抗凝管中，4 ℃，2 500 r /min 离心 7
min，分离血浆，按照 AngⅡ放免分析测定试剂盒测
定 AngⅡ含量。
2. 7 组织中 AngⅡ含量测定 采血后，取各组大
鼠心和肾组织进行匀浆，3 000 r /min，离心 20 min，
取上清液测定 AngⅡ含量，方法同“2. 6”项。
2. 8 荧光拍照 细胞经药物孵育后，用不含
Ca2 +、Mg2 +的 PBS 溶液轻轻冲洗，4% 的多聚甲醛
固定 20 min，再用不含 Ca2 +、Mg2 +的 PBS-T 溶液清
洗;最后于室温避光条件下加入终浓度为 5 μmol /L
的 Fluo-3 /AM，37 ℃，避光恒温振荡 40 min。用
PBS-T 溶液冲洗细胞洗去多余的荧光染料，采用生
物荧光倒置显微镜进行拍照。
2. 9 细胞内游离钙离子浓度测定〔10〕 前期操作
方法同“2. 8”，经 PBS-T 溶液冲洗细胞洗去多余的
荧光染料后用胰蛋白酶消化，收集细胞，1 000 r /min
离心 5 min，弃上清液，用 PBS 溶液吹打均匀，调整
细胞浓度 1 × 106 /mL。使用荧光分光光度计检测荧
光强度，激发光波长为 488 nm，发射光波长为 526
nm，狭缝 5 nm。先测得样品荧光值 F;再加入体积
分数为 10 % 的 TritonX-100 溶液 20 μL，使 TritonX-
100 的终浓度为 0. 1%，破膜 2 min后测荧光值 Fmax;
最后加入 0. 5 mmol /L的 EGTA溶液 20 μL，使其终
浓度为 5 mmoL /L，EGTA 螯合 2 min 后测荧光值
Fmin。［Ca
2 +］i计算公式:C［Ca2 +］i = Kd(F － Fmin)/
(Fmax － F) ，Kd 是 Fluo-3 与 Ca
2 +反应的解离常数，本
实验 Kd = 400 nm，F 为某时刻测定得到的荧光强度
值，Fmax是 Ca
2 + 饱和时(加入终浓度为 0. 1% Tri-
tonX-100)荧光强度值，Fmin为零钙时(加入终浓度为
5 mmol /L的 EGTA溶液)的荧光强度值。
2. 10 统计学处理 所有数据均以 珋x ± s 表示，采
用 SPSS 16. 0 进行数据分析，各组组间差异比较采
用单因素方差分析。LSD 检验或 SNK 检验各组间
差异的显著性。显著性水平 α = 0. 05。
3 结果
3. 1 血压测定结果 采用无创血压测定仪分别于
第 5 周和第 10 周测定大鼠血压。结果表明，与正常
对照组比较，手术 5 w 各给药组大鼠血压显著升高，
(P ＜ 0. 01) ，各组血压值符合实验要求，表 0 明肾性
高血压造模成功。给药 5 w 后，与生理盐水组比较，
毛茛总苷高、中剂量组大鼠血压值差异具有统计学
意义(P ＜ 0. 05) ，表明高、中剂量的 TGRJ 均能不同
程度的降低和改善肾性高血压大鼠血压水平。结果
见表 1。
3. 2 血清一氧化氮测定结果 硝酸还原法测定结
果表明毛茛总苷呈浓度依赖性地升高肾性高血压大
鼠血清中一氧化氮水平，与模型组比较，各给药组一
氧化氮水平均显著升高(P ＜ 0. 05) ，见表 2。
·459· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 35 卷第 6 期 2012 年 6 月
表 1 毛茛总苷对肾性高血压大鼠
收缩压的影响 (珔x ± s，n =10)
组别 剂量
/
(mg /kg)
第 5 周血压 /
(mmHg)
第 10 周血压 /
(mmHg)
正常对照组 － 99 ± 10. 1 103. 3 ± 10. 2＊＊
模型组 － 147. 6 ± 12. 3## 160. 2 ± 18. 7
毛茛总苷高剂量组 400 150. 0 ± 14. 6## 125. 6 ± 10. 1*
毛茛总苷中剂量组 200 152. 8 ± 15. 3## 132. 9 ± 11. 9*
毛茛总苷低剂量组 100 150. 5 ± 10. 1## 142. 2 ± 14. 0
氯沙坦钾组 10 147. 5 ± 16. 3## 106. 1 ± 12. 7＊＊
注:与模型组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊ P ＜ 0. 01;与正常对照组比
较，##P ＜ 0. 01
3. 3 血浆和心、肾组织中血管紧张素Ⅱ测定结果
按照 AngⅡ放免分析测定试剂盒要求对血浆和
心、肾组织中 AngⅡ的含量进行测定，结果发现，与
正常对照组比较，肾性高血压大鼠血浆中的 AngⅡ
含量显著升高(P ＜ 0. 05) ，给药 5 w 后，与生理盐水
组比较发现毛茛总苷各剂量组 AngⅡ含量无统计学
意义(P ＞ 0. 05) ，表明毛茛总苷对肾性高血压大鼠
血浆、心肾组织中的 AngⅡ含量无明显影响。结果
见表 3。
表 2 毛茛总苷对肾性高血压大鼠血清中一氧
化氮(NO)的影响(珔x ± s，n =10)
组别 剂量 / (mg /kg) NO/(μmol /L)
正常对照组 － 33. 6 ± 4. 4*
模型组 － 17. 4 ± 1. 9
毛茛总苷高剂量组 400 44. 1 ± 7. 3*
毛茛总苷中剂量组 200 33. 4 ± 5. 0*
毛茛总苷低剂量组 100 32. 9 ± 4. 8*
氯沙坦钾组 10 29. 9 ± 7. 6*
注:与模型比较，* P ＜ 0. 05
表 3 毛茛总苷对肾性高血压大鼠血浆和心、肾组织中 AngⅡ的影响 (珔x ± s，n =10)
组别 剂量 /(mg /kg)
AngⅡ含量
血浆 /(pg /mL) 心脏 /(pg /mg) 肾脏 /(pg /mg)
正常对照组 － 334. 33 ± 73. 16 1123. 18 ± 27. 67 1336. 80 ± 20. 01
模型组 － 527. 39 ± 60. 35* 1304. 93 ± 96. 97* 1758. 21 ± 100. 85*
毛茛总苷高剂量组 400 522. 73 ± 77. 84* 1258. 88 ± 75. 02* 1712. 47 ± 121. 68*
毛茛总苷中剂量组 200 534. 87 ± 73. 81* 1327. 44 ± 99. 84* 1793. 98 ± 86. 10*
毛茛总苷低剂量组 100 520. 64 ± 74. 07* 1290. 54 ± 63. 53* 1703. 09 ± 93. 59*
氯沙坦钾组 10 548. 20 ± 74. 16* 1454. 09 ± 89. 67* 1864. 46 ± 95. 89*
注:与正常对照组比较，* P ＜ 0. 05
3. 4 毛茛总苷对 AngⅡ诱导血管平滑肌细胞内钙
的影响
3. 4. 1 采用生物荧光倒置显微镜观察细胞染色情
况:AngⅡ组的血管平滑肌细胞中绿色荧光最强，表
明 AngⅡ可一定程度的促进细胞内钙浓度升高，给
予不同剂量的毛茛总苷后，荧光强度明显下降。见
图 1。
3. 4. 2 荧光分光光度计测量细胞胞内钙荧光强
度:结果见表 4。与 PBS组比较，不同剂量的毛茛总
苷均能显著降低 AngⅡ引起的血管平滑肌细胞内钙
离子浓度的升高(P ＜ 0. 05) ，并呈剂量依赖性，其中
毛茛总苷高剂量组荧光强度接近于硝苯地平组的荧
光强度。
4 讨论
正常 SD大鼠进行肾动脉狭窄手术后，造成肾
动脉管腔狭窄，使肾脏缺血，从而刺激肾脏皮质内的
颗粒细胞合成和分泌肾素增加，使循环血液中血管
表 4 毛茛总苷对 VSMC内钙浓度的影响(珔x ± s，n =3)
组别 剂量 /(μmol /L) ［Ca2 +］i /(nmol /L)
空白对照组 － 540. 19 + 117. 64*
PBS + AngⅡ － 1179. 28 + 87. 35
硝苯地平 + AngⅡ 10 498. 36 + 106. 91*
毛茛总苷 + AngⅡ 100 913. 19 + 91. 62*
毛茛总苷 + AngⅡ 200 878. 34 + 127. 81*
毛茛总苷 + AngⅡ 400 609. 42 + 113. 15*
注:与空白对照组比较，* P ＜ 0. 05
紧张素Ⅱ浓度升高，血管紧张素Ⅱ作用于 AT1 受体
产生收缩血管、促进肾上腺皮质释放醛固酮、增加血
容量等作用，最终导致血压升高。在 2 肾 1 夹手术
初期，血液中升高的血管紧张素是导致血压升高的
主要因素。但随着模型大鼠血压的进展，血压对肾
素 /血管紧张素依赖性减少，由于继发性的脏器损害
引起恶性循环导致血压的进一步增高〔11〕。
·559·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 35 卷第 6 期 2012 年 6 月
图 1 毛茛总苷对血管平滑肌细胞内钙离子浓度的影响
A. 正常对照组 B. 模型组 C. 硝苯地平 10 μmol /L 组 D. TGRJ 100 μg /mL 组 E. TGRJ 200 μg /mL 组
F. TGRJ 400 μg /mL组
笔者的研究发现，手术 5 w 大鼠血压明显上升，
给药 5 w 后，毛茛总苷能降低和改善肾性高血压大
鼠血压水平，其中毛茛总苷高剂量降压水平与氯沙
坦钾降压水平差异无统计学意义，表明毛茛总苷降
压效果良好。对于大鼠 AngⅡ含量结果分析发现，
与正常对照组比较，在肾性高血压大鼠血浆、组织心
肾中 AngⅡ的含量明显升高，给予毛茛总苷后，大鼠
体内的 AngⅡ无明显变化。表明毛茛总苷降压作用
并非通过降低 AngⅡ的含量来实现的。由于肾性高
血压与肾素-血管紧张素系统激活有关，故笔者设想
毛茛总苷的降压作用可能是通过影响 AngⅡ下游的
信号通路实现的。由于钙离子是 AngⅡ收缩血管引
起血压升高的关键物质，故笔者进一步研究了毛茛
总苷对 AngⅡ引起的大鼠血管平滑肌细胞(A7r5 细
胞)内钙浓度升高的影响。结果表明毛茛总苷各剂
量组均能显著性地降低由 AngⅡ诱导的血管平滑肌
细胞内钙离子升高。其中毛茛总苷高剂量组对细胞
内钙浓度的抑制作用与于硝苯地平相当，可以推测
毛茛总苷在不影响 AngⅡ水平的条件下，可以通过
拮抗 AngⅡ引起的细胞内钙浓度上升，从而拮抗
AngⅡ引起的收缩血管、增加血容量、升高血压、促
进心肌肥大和血管增生等生理效应。同时毛茛总苷
可以升高大鼠血清中 NO 的水平，上调的 NO 通过
激活鸟苷酸环化酶，NO 使细胞内环磷酸鸟苷
(cGMP)浓度增加，导致平滑肌细胞松弛，扩张血
管〔12〕。
参 考 文 献
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肌作用及其机制的研究［J］. 广东药学院学报，2004，20
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宫平滑肌细胞的影响［J］. 中草药，2005，36(4) :566-
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兔主动脉平滑肌细胞内钙的影响［J］. 中药材，2004，27
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115.
复方黄甘提取物对慢性肾衰大鼠氧化应激的影响
文志勇，毛 萍，金召英，莫立乾，肖小燕，杨西晓*
(南方医科大学南方医院药学部，广东 广州 510515)
摘要 目的:观察复方黄甘提取物对慢性肾功能衰竭(CRF)大鼠体内氧化应激的影响及水提物与醇提物的作
用差异。方法:以灌胃腺嘌呤法制备大鼠 CRF模型，同时给予复方黄甘水及醇提取物进行治疗。8 w 后，测定各组
大鼠血清 BUN、SCr、MDA、AOPPs、肾脏指数及肾组织匀浆 SOD。制作肾组织 HE染色切片，观察肾脏病变情况。结
果:复方黄甘提取物能显著降低 CRF大鼠血清中 SCr、BUN、MDA、AOPPs水平及肾脏指数，提高肾组织内抗氧化酶
SOD活性，并减轻肾脏组织病理改变。醇提取物对 SCr 的作用和其低剂量对 MDA 的作用比水提取物强，而对
AOPPs的作用则比水提取物低剂量弱。结论:复方黄甘提取物能显著抑制 CRF大鼠体内的氧化应激，可能是其延
缓肾功能恶化的主要作用机制之一。
关键词 慢性肾衰;复方黄甘;腺嘌呤;氧化应激;晚期氧化蛋白产物
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454-(2012)06-0957-05
收稿日期:2011-10-27
基金项目:广东省科技计划重点科技专项(2011A030100007)
作者简介:文志勇(1985-) ，男，在读硕士研究生，主要从事中药新药与制剂研究;Tel:15915767363，E-mail:wenzhiyong16@ 163. com。
* 通迅作者:杨西晓，Tel:020-62787463，E-mail:yaxx@ 263. net。
慢性肾功能衰竭(CRF)是在各种慢性肾脏疾病
基础上缓慢进展性肾功能减退直至肾功能衰竭的临
床综合征。在西方国家，慢性肾病影响到约 11%的
成年人，是其发病和死亡的主要原因〔1〕。在中国，
初步调查结果显示，终末期肾病发病率大约为万分
之一。故防治 CRF 已成为十分重要的公共健康问
题，但目前尚无有效延缓 CRF 进展的方法和手段。
西医多采用透析治疗、肾移植来维持 CRF晚期病人
的生命，但价格昂贵，肾源稀缺，难以普及。而近年
来，中医药在防治 CRF 方面取得了明显的疗效，许
多经方、验方在防治 CRF 中的作用也正被逐步挖
掘。尿毒清颗粒是南方医院研制的抗肾衰产品，能
有效减轻 CRF 病人的临床症状，改善肾功能，延缓
肾功能减退。复方黄甘片是尿毒清颗粒的第二代产
品，由大黄、甘草、柴胡等药材组成。本实验拟对复
方黄甘片药材的提取物进行药效学研究，观察复方
黄甘对 CRF 大鼠血中丙二醛(MDA)、晚期氧化蛋
白产物(AOPPs)及肾组织超氧化物歧化酶(SOD)的
影响，探讨复方黄甘影响 CRF进展的作用机制及水
提物和醇提物的作用差异，以期为其临床治疗 CRF
提供可靠的实验依据，并为申报新药打下基础。
1 材料与仪器
1. 1 实验动物 SD 雄性大鼠，体质量 180 ～ 220
g，购于南方医科大学实验动物中心，许可证号:
SCXK(粤)2006-0015，实验前动物置于室内适应环
境 1 w。
1. 2 药物与试剂 复方黄甘片组成中各药材均购
自康美药业股份有限公司，经南方医科大学中医药
学院张宏伟副教授鉴定为正品;复方黄甘水提取物，
全方药材加 10 倍量水，煎煮 2 次，每次 2 h，弃渣浓
缩，60 ℃真空干燥得浸膏;醇提取物，药材加 8 倍量
70%乙醇，回流提取 2 次，每次 1. 5 h，弃渣旋转蒸
发，60 ℃真空干燥得浸膏;尿毒清颗粒，广州康臣药
业，批号:20101032;腺嘌呤(批号:28882，阿拉丁) ;
超氧化物歧化酶(SOD)试剂(批号:20110301)、丙
二醛(MDA)试剂盒，批号:20110301 (南京建成生
·759·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 35 卷第 6 期 2012 年 6 月