全 文 ：紫外分光光度法测定毛茛不同部位总黄酮的
含量
刘苑，张兴，谭毓治，刘威振，王静菁
(广东药学院 药理学教研室，广东 广州 510006)
摘要:目的 建立毛茛中总黄酮的含量测定方法并分别测定其正丁醇、乙酸乙酯萃取部位中总黄酮的质
量分数。方法 以芦丁为对照品，采用可见-紫外分光光度法于 360． 5 nm 处测定毛茛中总黄酮的含量。
结果 芦丁质量浓度在 0． 008 1 ～ 0． 028 4 mg /mL范围内与吸光度线性关系良好，r = 0． 999 6。平均回收
率均在 95% ～105%范围内。结论 该方法简便、准确、可靠，适用于毛茛中总黄酮的含量测定。
关键词:毛茛;总黄酮;紫外-可见分光光度法
中图分类号:R927． 2 文献标志码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1006-8783． 2012． 02． 014
文章编号:1006-8783(2012)02-0160-03
Determination of total flavonoids in different fractions from Ranunculus japonicus by UV
spectrophotometry
LIU Yuan，ZHANG Xing，TAN Yu-zhi，LIU Wei-zhen，WANG Jing-jing
(Department of Pharmacology，Guangdong Pharmacy University，Guangzhou 510006，China)
Abstract:Objective To develop a quantitative method for the determination of total flavonoids in different
fractions from Ranunculus japonicus． Methods Total flavonoids in Ranunculus japonicus were determined by
UV absorption at 360． 5 nm with rutin as the reference substance． Results Good linearity of rutin was
obtained within the range of 0． 008 1 － 0． 028 4 mg /mL (r = 0． 999 6)． The average recovery ratio was in
the range of 95% － 105% ． Conclusion The method is convenient，accurate and reliable，which can be
used for the quality control of total flavonoids in Ranunculus japonicus．
Key words:Ranunculus japonicas;total flavonoids;UV spectrophotometry
收稿日期:2011-12-29
基金项目:广东省科技厅课题(2004B30101002)
作者简介:刘苑(1985 －) ，女，硕士研究生，Email:sally_new@ 163． com;通信作者:谭毓治(1956 －) ，男，教授，硕士生导师，从
事新药筛选与作用机制研究，Email:tanyuzhi@ 163． com。
网络出版时间:2012-03-27 16:34 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /44． 1413． R． 20120327． 1634． 005． html
毛茛科植物毛茛(Ranunculus japonicus Tunb)为
多年生直立草本，生于山地、平地疏林、山谷、山坡或
溪旁，全国各地均有分布。味辛、性温、有毒。《中
药大词典》记载毛茛可以治疗疟疾、黄疸、偏头痛、
胃痛、风湿关节痛、鹤膝风等疾病［1］。
近年来对毛茛化学成分研究发现，毛茛的乙醇
提取物中含量最多的是苷类，包括三萜皂苷类、内酯
苷［2］、黄酮苷类等［3］，毛茛总苷的质量分数为毛茛
全草的 5%。此外，有研究采用超高效液相色谱与
串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术(UPLC /Q-
TOF-MS)对毛茛总苷的化学成分进行分析，并对其
主要成分进行鉴定。根据元素组成分析、二级质谱
和相关文献，鉴定、推断出 20 个化合物，包括内酯
苷、黄酮苷和黄酮苷元，其中内酯苷和黄酮苷为毛茛
总苷的主要成分［4］。本课题组通过药理学研究发
现，毛茛苷类成分具有抗炎、镇痛［5］、抑制心肌肥
厚［6］、降低大鼠动脉血压、抑制心肌收缩和舒张功
能的作用［7］。本文建立了毛茛中总黄酮含量测定
的方法，检测毛茛总黄酮在不同提取部位中的含量，
为毛茛总苷的进一步研究提供理论依据。
1 仪器与试药
UV-2550 型紫外-可见分光光度计(日本岛津公
司)、AUW220D型电子天平(十万分之一，日本岛津
公司)、HW-1000 超级恒温器(成都泰盟科技有限公
司)、RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、
SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限
公司)、DK-S26 型电热恒温水浴锅(上海精宏实验
广东药学院学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University Apr． 2012，28(2)
设备有限公司)。
毛茛药材采自江西省九江市，由广东药学院刘
基柱副教授鉴定为毛茛科植物毛茛(Ranunculus
japonicus Tunb)。
芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号:
100080 － 200707) ;D101 型大孔吸附树脂(上海润捷
化学试剂有限公司) ;聚酰胺吸附树脂(浙江省台州
市路桥四甲生化塑料厂，200 ～ 400 目) ;其余试剂均
为分析纯。
2 方法与结果
2． 1 毛茛不同萃取部位的制备
取毛茛药材4． 00 kg，每次加7倍量的75%(体积
分数，下同)乙醇，回流提取 3 次(1． 5 h、1 h、1 h) ，滤
液过 80 目筛，合并滤液，浓缩至 3． 10 kg。
将上述浓缩得到的浸膏 200 g，悬浮于水，加入
等量石油醚(沸点 60 ～ 90 ℃)萃取，脱去脂溶性色
素，弃去石油醚部分。往水层加入等体积乙酸乙酯
萃取，萃取后分层，下层为水层，保留待用。用乙酸
乙酯继续萃取至乙酸乙酯层颜色逐渐透明变为浅绿
色。合并乙酸乙酯部分，旋转蒸发仪回收乙酸乙酯，
60 ℃水浴锅蒸干。用甲醇溶解后拌聚酰胺，挥干甲
醇，上聚酰胺柱(50 mm × 750 mm) ，先用去离子水
冲洗至洗脱液无色，再用 3 倍柱体积 30%(体积分
数，下同)乙醇洗脱。收集 30%乙醇洗脱液，回收乙
醇，余液置水浴上蒸干，得到乙酸乙酯萃取部分。平
行制备 3 批，质量分别为 7． 35、6． 57、7. 04 g。
取上述乙酸乙酯萃取后水层，加入等体积正丁
醇萃取，分层。取正丁醇层，旋转回收正丁醇，60 ℃
水浴蒸干。所得浸膏用水溶解，上 D101 型大孔树
脂柱(7． 5 mm × 100 mm)进行柱层析，先用去离子
水冲洗至洗脱液无色，再用 3 倍柱体积 30%乙醇洗
脱。收集 30%乙醇洗脱液，回收乙醇，余液置水浴
上蒸干，得到正丁醇萃取部分。平行制备 3 批，质量
分别为 11. 27、12. 36、11. 82 g。
2． 2 溶液的制备
2． 2． 1 对照品溶液的制备 精密称取烘干至恒重
的芦丁对照品 20． 25 mg，加 50%(体积分数，下同)
乙醇溶解并定容至 100 mL 容量瓶中，摇匀，精密移
取 2 mL定容至 10 mL 容量瓶中，即得质量浓度为
0. 040 5 mg /mL的芦丁对照品溶液。
2． 2． 2 供试品溶液的制备 分别精密称取“2． 1”
项下毛茛乙酸乙酯、正丁醇萃取部分粉末适量，分别
加 50%乙醇溶解并定容至 25 mL容量瓶，摇匀后超
声 20 min，静置至澄清后分别取上清液，即得。
2． 3 测定波长的选择
取芦丁对照品溶液 5 mL，置 10 mL 容量瓶中，
加 50%乙醇溶解并定容至刻度，于 200 ～ 600 nm 范
围内进行紫外扫描，在 360． 5 nm处有最大吸收。另
分别取 2 种供试品溶液于 200 ～ 600 nm 范围内进行
扫描，亦于 360． 5 nm处有最大吸收，故选 360． 5 nm
为测定波长。见图 1。
a．对照品溶液;b．乙酸乙酯萃取部分;c．正丁醇萃取部分。
图 1 紫外吸收光谱图
Figure 1 The ultraviolet absorption spectra
2． 4 标准曲线的绘制
分别精密移取芦丁对照品溶液 2、3、4、5、6、7
mL于 10 mL容量瓶中，加 50%乙醇稀释至刻度，摇
匀，以 50%乙醇为空白溶剂，于 360． 5 nm 处测定吸
光度。以芦丁质量浓度(ρ)为横坐标，吸光度(A)为
纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为:A = 31． 457ρ －
0． 0168，r = 0． 999 6。芦丁质量浓度在 0． 008 1 ～
0. 028 4 mg /mL范围内，与吸光度线性关系良好。
2． 5 精密度试验
精密吸取对照品溶液 3 mL于 10 mL容量瓶中，
加 50%乙醇稀释至刻度，摇匀，在 360． 5 nm 处测定
其吸光度，连续测定 6 次，结果吸光度 RSD 值为
0. 22%，表明仪器精密度良好。
2． 6 稳定性试验
分别吸取“2． 2． 2”项下 2 种供试品溶液，在 60
min内，每 10 min测定 1 次吸光度，结果乙酸乙酯部
分 RSD值为 0． 29%，正丁醇部分 RSD值为 0． 34%，
表明供试品溶液在 60 min内基本稳定。
2． 7 重复性试验
取同一批药材，精密称定，平行 6 份，按“2． 2． 2”
项下分别制备乙酸乙酯、正丁醇部分供试品溶液，依
法测定。计算乙酸乙酯、正丁醇部分总黄酮平均质
量分数分别为 60． 49% (RSD = 1． 13%)、43． 86%
(RSD = 2． 73%) ，表明该方法重复性良好。
2． 8 加样回收率试验
精密称取已知总黄酮质量分数的不同萃取部分
161第 2 期 刘苑，等．紫外分光光度法测定毛茛不同部位总黄酮的含量
粉末适量，共 9 份，分别按样品中总黄酮质量分数的
80%、100%、120%精密加入芦丁对照品溶液适量，
按“2． 2． 2”项下方法制备供试品溶液，依法测定。
结果见表 1。
表 1 毛茛不同提取部位加样回收率试验结果
Table 1 Recovery results of different fractions from Ranunculus japonicus
萃取部位 序号 样品中的量 m /mg 加入量 m /mg 测得量 m /mg 回收率 /% 平均回收率 /% RSD /%
1 0． 070 7 0． 056 8 0． 126 97． 36
2 0． 070 2 0． 056 8 0． 126 98． 24
3 0． 070 5 0． 056 8 0． 126 97． 71
4 0． 072 5 0． 070 2 0． 142 99． 00
正丁醇 5 0． 072 2 0． 070 2 0． 142 99． 43 98． 26 1． 97
6 0． 070 9 0． 070 2 0． 143 102． 71
7 0． 071 1 0． 084 9 0． 153 96． 47
8 0． 071 8 0． 084 9 0． 154 96． 82
9 0． 072 0 0． 084 9 0． 154 96． 58
1 0． 125 9 0． 104 0． 224 94． 33
2 0． 125 0 0． 104 0． 224 95． 19
3 0． 124 4 0． 104 0． 224 95． 77
4 0． 126 6 0． 130 0． 248 93． 38
乙酸乙酯 5 0． 125 3 0． 130 0． 248 94． 38 96． 08 2． 36
6 0． 126 3 0． 130 0． 249 94． 38
7 0． 124 8 0． 156 0． 280 99． 49
8 0． 126 0 0． 156 0． 280 98． 72
9 0． 125 5 0． 156 0． 280 99． 04
2． 9 样品含量测定
分别称取毛茛的正丁醇萃取部位(批号:
100805、100824、100917)、乙酸乙酯萃取部位(批号:
100801、100821、100912)3 批，各 10 mg，每批平行 2
份，共 12 份，精密称定，按“2． 2． 2”项下方法制备供
试品溶液，依法测定。结果乙酸乙酯、正丁醇萃取部
分总黄酮质量分数分别为 60． 11%、44． 15%，RSD
值分别为 0. 08%、0. 07%。
3 讨论
目前黄酮类化合物测定法有直接测定法、AlCl3
显色法和 Al(NO3)3 显色法。试验中供试品溶液的
制备采用石油醚萃取、聚酰胺柱层析法纯化毛茛中
总黄酮类化合物，去除了含酚羟基的杂质成分，消除
了叶绿素的干扰。因此是否加显色剂对其含量测定
无显著影响，故本试验采用直接测定法。
大多数黄酮类化合物都具有特定的紫外吸收
带，其结构中 B 环的桂皮酰基产生的峰带Ⅰ在 300
～ 400 nm 内，由 A 环的苯甲酰基产生的峰带Ⅱ在
220 ～ 280 nm内。含黄酮类化合物的原料经一定的
提取纯化后，可直接于最大吸收波长处测定其吸光
度，以芦丁对照品为对照计算其含量。由于在紫外
低波长区易有溶剂干扰，可能引起误差，故选择芦丁
在Ⅰ带的最大吸收波长 360． 5 nm 作为测定波长。
本试验采用紫外-可见分光光度法测定毛茛药
材中总黄酮的质量分数，方法简便、快速、准确，为今
后毛茛中总黄酮质量分数的测定提供了依据，同时
为毛茛中黄酮类成分的深入开发利用奠定了基础。
本文得到黄庆华教授的指导，谨致谢忱。
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(责任编辑:刘晓涵)
261 广东药学院学报 第 28 卷