全 文 ：第 32 卷 第 5 期
2 0 1 4 年 5 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 32 No． 5
May 2 0 1 4
中
华
中
医
药
1006
学
刊
DOI:10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2014． 05． 014
蜘蛛香总黄酮对肝癌 H22小鼠抗肿瘤作用及
对 pathways in cancer的影响
兰明1，林玉1，张瑞桐1，陈朝勇1，李少华1，陈冲1，陈晓玲2，张天娥3，闫智勇1
(1．西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031;2．成都中医药大学附属医院，四川 成都 610075;
3．成都中医药大学基础医学院，四川 成都 611137)
摘 要:目的:探讨蜘蛛香总黄酮对肝癌 H22小鼠抗肿瘤作用及对 pathways in cancer的影响。方法:建立 H22
肝癌皮下荷瘤模型，随机分为模型对照组、阳性对照组、蜘蛛香总黄酮高、低剂量组。给药 10 d 后，解剖称取瘤
重，计算抑瘤率，并应用小鼠全基因组基因芯片考察蜘蛛香总黄酮对瘤组织 pathways in cancer 的影响。结果:与
模型对照组相比，阳性对照组、蜘蛛香总黄酮高、低剂量组的平均瘤重明显下降(P ＜ 0． 01，P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 05) ，各
组抑瘤率分别为 45． 32%、30． 06%、25． 97%。给药组 pathways in cancer中有 17 个基因表达同时发生了显著性变
化，其中 Ccne2、Cdkn2b、Ctbp2、Mmp1a、Myc 和 Vegfa 的表达发生了上调，而 Vegfc、Csf1r、Epas1、Figf、Fzd9、Igf1、
Pdgfra、Pik3r1、Prkcb、Tcf7l1 和 Tcf7l2 的表达发生了下调，主要从细胞周期调控、PI3K － AKT 途径、Wnt 途径抑制
肿瘤增殖、迁移，促进其凋亡。结论:蜘蛛香总黄酮具有一定的抗肝癌活性，作用机理可能与调节 pathways in
cancer的信号转导相关。
关键词:蜘蛛香总黄酮;H22;pathways in cancer
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标志码:A 文章编号:1673-7717(2014)05-1006-03
Antitumor Activity and Effect of Total Flavonoids from Valeriana Jatamansi
Jones on Pathways in Cancer in Hepatocarcinoma 22 － Bearing Mice
LAN Ming1，LIN Yu1，ZHANG Ｒuitong1，CHEN Chaoyong1，LI Shaohua1，
CHEN Chong1，CHEN Xiaoling2，ZHANG Tian’e3，YAN Zhiyong1
(1． College of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031，Sichuan，China;
2． Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM，Chengdu 610075，Sichuan，China;
3． The Basic Medical School，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，Sichuan，China)
Abstract:Objective:To investigate the anti － tumor activity and effect on the pathways in cancer of total flavonoids
from Valeriana jatamansi Jones in hepatocarcinoma 22 － bearing mice． Methods:The tumor animal model by inoculating
H22 was established． Forty mice were randomly divided into four groups:the model group，the Tegafur group，the high －
dose Valeriana jatamansi Jones group and the low － dose Valeriana jatamansi Jones group． The inhibitory rate was calcu-
lated，and the mouse genome chips were used to investigated the anti － tumor activity and effect on the pathways in canc-
er． Ｒesults:To compare with model group，the average tumor weight of the Tegafur group was decreased significantly(P ＜
0． 01) ，that of the high － dosegroup and the low － dose group was decreased significantly (P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 05)． The in-
hibition rates were 45． 32%，30． 06%，25． 97% ． A total of 17 genes expression of pathways in cancer in administration
group occurred at a significant change at the same time． Ccne2，Cdkn2b，Ctbp2，Mmp1a，Myc and Vegfa genes were up －
regulated，while Vegfc，Csf1r，Epas1，Figf，Fzd9，Igf1，Pdgfra，Pik3r1，Prkcb，Tcf7l1 and Tcf7l2 genes were down － regula-
ted． These genes can inhibit cancer cells proliferation and migration，and promote apoptosis through regulating cell cycle
and the pathway of PI3K － AKT and Wnt． Conclusion:The total flavonoids from Valeriana jatamansi Jones had the anti －
tumor activity． The mechanism may be related to signal transduction pathways in cancer．
Key words:total flavonoids from Valeriana jatamansi Jones;H22;pathways in cancer
收稿日期:2014 － 01 － 17
基金项目:国家“十一五”科技重大专项计划项目(2009ZX09103 －
370) ;四川省教育厅科技项目(13ZA0274) ;四川省科技
支撑计划项目(2013ZF0010)
作者简介:兰明(1980 －) ，男，四川德阳人，硕士，研究方向:中药药
理。
通讯作者:张天娥(1970 －) ，女，河北人，副研究员，博士，研究方
向:中西医结合基础。E-mail:1153615912@ qq． com。
闫智勇(1971 －) ，男，河北人，教授，博士，研究方向:神
经及肿瘤药理。E-mail:yzhiy@ swjtu． edu． cn。
肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高、
发展迅速、预后差，严重威胁着人们的健康及生命。蜘蛛香
总黄酮系败酱科(Valerianaceae)缬草属(Valeriana Linn．)植
物蜘蛛香(Valeriana jatamansi Jones)的根茎和根［1］，课题组
前期研究发现，蜘蛛香总黄酮提取物对体外培养的人结肠癌
细胞具有明显的抑制增殖和抗转移作用［2］。本研究通过建
立荷H22小鼠模型，进一步考察了其体内抗肝癌作用，应用小
鼠全基因组基因芯片对 pathways in cancer 的变化进行了考
察，从而在信号通路水平研究其抗肿瘤作用机制。
第 32 卷 第 5 期
2 0 1 4 年 5 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 32 No． 5
May 2 0 1 4
中
华
中
医
药
1007
学
刊
1 材 料
1． 1 动物 昆明种小鼠，体重 18 ～ 22 g，雌雄各半，由成
都达硕生物科技有限公司提供，合格证号:SCXK(川)2008
－ 24。
1． 2 瘤株 小鼠肝癌 H22瘤株，由四川大学华西医学中心
免疫实验室提供。
1． 3 药物和试剂 蜘蛛香，购于成都市荷花池药材市场;
替加氟，齐鲁制药有限公司，批号 910006LD;羧甲基纤维素
钠(CMC － Na) ，成都市科龙化工试剂厂，批号 20090929。
1． 4 芯片和仪器 Agilent小鼠全基因 4* 44K 芯片，美国
Ｒoche － Nimblegen公司;PTC － 100 PCＲ 仪，美国 MJ 公司;
G2545A杂交炉，美国 Agilent 公司;G2565BA 扫描仪，美国
Agilent公司;ND1000 分光光度计，美国 Nanodrop公司。
2 方 法
2． 1 动物模型的制备 无菌操作条件下取荷肝癌 H22小
鼠腹水，生理盐水稀释至肿瘤细胞浓度为 1 × 107·mL －1，
于每只小鼠左腋皮下接种 0． 2 mL。
2． 2 药物的制备 蜘蛛香总黄酮:采用超声提取法从蜘
蛛香干燥粉末中提取，并用 HPD600 大孔树脂进行纯化，得
到的总黄酮质量分数为 41． 20%。将上述制得的蜘蛛香总
黄酮用 0． 5% CMC － Na 分别配成高、低两个剂量，密封，置
4 ℃冰箱中冷藏备用。替加氟溶液:用 0． 5% CMC － Na 将
替加氟片配成浓度 10 mg·mL －1的溶液，密封，置 4 ℃冰箱
中冷藏备用。
2． 3 分组及给药 接种第二天，将小鼠称重并随机分为 4
组，每组 10 只，雌雄各半。模型对照组:灌胃 0． 5% CMC －
Na，20 mL·kg －1;阳性对照组:灌胃替加氟溶液，200 mg·
kg －1;蜘蛛香总黄酮高、低剂量组:灌胃蜘蛛香总黄酮提取物
溶液，剂量分别为生药 450 mg·kg －1、150 mg·kg －1。每日
按 0． 2 mL·10 g －1标准定时灌胃给药 1次，连续给药 10 d。
2． 4 指标检测 ①瘤重和抑瘤率:给药结束次日，将动物
股动脉取血后处死，小心剥离出皮下肿瘤块并称重，按下式
计算出肿瘤抑制百分率。
抑瘤率 = C － TC × 100%。式中，C 为模型组平均瘤重
(g) ，T为给药组平均瘤重(g)。
②基因表达谱芯片检测:股动脉取血后处死小鼠，解剖
取出肿瘤，迅速放入液氮罐冻存。采用 Trizol(Invitrogen 公
司)一步法提取小鼠肿瘤的总 ＲNA，ＲNeasy mini kit(Qiagen
公司)纯化 ＲNA，用琼脂糖凝胶电泳对样品总 ＲNA 进行定
量、质检。实验标记方法采用 Agilent 放大标记方法，各取
适量探针进行杂交，杂交方法采用 65 ℃，17 h滚动杂交，并
在室温洗片。芯片结果采用 Agilent 扫描仪进行扫描(Scan
resolution:5 μm;PMT:100%，10%) ，Agilent Feature Extrac-
tion 软件读取数据。最后采用 Feature Extraction 进行 Nor-
malize 处理分析。通过 Agilent GeneSpring GX software软件
处理得到基因表达变化的倍数。差异表达基因筛选标准为
比值 ＞ 2 为表达上调基因，比值 ＜ 0． 5 为表达下调基因(数
据小于 0． 5 时取倒数)。通过 KEGG信号通路数据库，查询
各用药组与模型对照组相比表达差异基因所参与的 path-
ways in cancer变化情况。
3 结 果
3． 1 对肝癌 H22小鼠肿瘤生长的抑制作用 阳性对照组、
蜘蛛香总黄酮高、低剂量组的平均瘤重明显降低，与模型对
照组相比具有统计学意义(P ＜ 0． 01 或 P ＜ 0． 05) ，各组的
抑瘤率分别为 45． 32%、30． 06%、25． 97%，见表 1。
表 1 对肝癌 H22小鼠的肿瘤抑制作用(珋x ± s，n = 10)
组别
剂量
(mg·kg －1)
平均瘤重
(珋x ± s，g)
抑瘤率
(%)
模型对照组 / 2． 31 ± 0． 32 /
阳性对照组 200 1． 26 ± 0． 52△△ 45． 32
低剂量组 50 1． 71 ± 0． 61△ 25． 97
高剂量组 150 1． 61 ± 0． 52△ 30． 06
注:与模型对照组相比，△△P ＜ 0． 01，△P ＜ 0． 05。
3． 2 各组 pathways in cancer 差异表达基因 运用 KEGG
信号通路数据库，查询各用药组与模型对照组相比表达差
异基因所参与的 pathways in cancer 变化情况，发现阳性对
照组、蜘蛛香总黄酮高剂量组和低剂量组与模型对照组相
比，pathways in cancer中 17 个基因的表达同时发生了显著
性变化，其中 6 个明显上调，11 个明显下调，见表 2。
表 2 与模型对照组相比上调的基因
基因库 ID 基因名称
阳性对照组 /
模型对照组
高剂量组 /
模型对照组
低剂量组 /
模型对照组
NM_001037134 Ccne2 3． 4580631 2． 07439 2． 04252
NM_007670 Cdkn2b 2． 5541744 3． 08352 2． 74667
NM_009980 Ctbp2 2． 2629087 2． 27093 2． 11827
NM_032006 Mmp1a 2． 3308847 2． 95918 4． 10339
NM_010849 Myc 2． 5501914 2． 664 2． 3486342
NM_001025257 Vegfa 2． 1053233 3． 07696 2． 0178132
表 3 与模型对照组相比下调的基因
基因库 ID 基因名称
阳性对照组 /
模型对照组
高剂量组 /
模型对照组
低剂量组 /
模型对照组
NM_009506 Vegfc 2． 614234 2． 17467 4． 107568
NM_001037859 Csf1r 7． 738672 2． 00212 2． 4887645
NM_010137 Epas1 2． 1674442 3． 02444 3． 5518117
NM_010216 Figf 2． 421174 4． 80008 12． 261144
NM_010246 Fzd9 3． 6701312 7． 99231 7． 664554
NM_010512 Igf1 2． 188306 3． 40876 7． 044193
NM_011058 Pdgfra 2． 0711126 2． 22131 2． 5979586
NM_001077495 Pik3r1 2． 7311962 2． 90082 3． 0322084
NM_008855 Prkcb 6． 7783217 2． 23753 3． 8705804
NM_001079822 Tcf7l1 2． 022451 3． 99549 6． 8313313
NM_009333 Tcf7l2 3． 5093386 2． 7632 4． 290419
3． 3 各组 pathways in cancer 差异表达基因比较 相对于
模型对照组，阳性对照组、蜘蛛香总黄酮高剂量和低剂量组
pathways in cancer 中 Ccne2、Cdkn2b、Ctbp2、Mmp1a、Myc 和
Vegfa的表达发生了上调，而 Vegfc、Csf1r、Epas1、Figf、Fzd9、
Igf1、Pdgfr1、Pik3r1、Prkcb、Tcf7l1 和 Tcf7l2 的表达发生了下
调，见插页Ⅳ图 1。
3． 4 pathways in cancer差异表达基因分析 运用 NCBI数
据库对各差异基因进行分析，见表 4。
4 讨 论
我们在前期体内抗 H22活性的基础上，运用基因表达
谱芯片技术对蜘蛛香总黄酮抑制小鼠 H22的差异表达基因
进行初步筛选，以期从基因水平阐释出蜘蛛香总黄酮抗
H22肝癌的机制。通过对差异表达基因的分析，发现下调的
基因在 pathways in cancer通路中都起到对肿瘤促进作用，
参与血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖和迁
移等多个方面。研究发现［3 － 5］Epas1、Pdgfra 均能通过诱导
Vegf的表达促进血管的生成，下调 Epas1、Pdgfra、Vegfc、Figf
能抑制血管生成，从而阻止肿瘤细胞的生长和转移［6］。
Csf1r的过量表达与肝癌细胞的生长、分化及转化密切相
第 32 卷 第 5 期
2 0 1 4 年 5 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 32 No． 5
May 2 0 1 4
中
华
中
医
药
1008
学
刊
表 4 pathways in cancer差异表达基因的功能分析
基因名称 基因描述
Ccne2 cyclin E2 (Ccne2) ，transcript variant 1，mＲNA
Cdkn2b cyclin － dependent kinase inhibitor 2B(p15，inhibits CDK4) (Cdkn2b) ，mＲNA
Ctbp2 C － terminal binding protein 2 (Ctbp2) ，transcript variant 2，mＲNA
Mmp1a matrix metallopeptidase 1a (interstitial collagenase) (Mmp1a) ，mＲNA
Myc myelocytomatosis oncogene (Myc) ，transcript variant 1，mＲNA
Vegfa vascular endothelial growth factor A (Vegfa) ，transcript variant 3，mＲNA
Vegfc vascular endothelial growth factor C (Vegfc) ，mＲNA
Csf1r colony stimulating factor 1 receptor (Csf1r) ，mＲNA
Epas1 endothelial PAS domain protein 1 (Epas1) ，mＲNA
Figf c － fos induced growth factor (Figf) ，mＲNA
Fzd9 frizzled homolog 9 (Drosophila) (Fzd9) ，mＲNA
Igf1 insulin － like growth factor 1 (Igf1) ，transcript variant 1，mＲNA
Pdgfra
platelet derived growth factor receptor，alpha polypeptide (Pdgfra) ，transcript
variant 1，mＲNA
Pik3r1
phosphatidylinositol 3 － kinase，regulatory subunit，polypeptide 1 (p85 alpha)
(Pik3r1) ，transcript variant 2，mＲNA
Prkcb protein kinase C，beta (Prkcb) ，mＲNA
Tcf7l1
transcription factor 7 － like 1 (T － cell specific，HMG box) (Tcf7l1) ，transcript
variant 1，mＲNA
Tcf7l2
transcription factor 7 － like 2，T － cell specific，HMG － box (Tcf7l2) ，transcript
variant 3，mＲNA
关，可能是 c － fms原癌基因发生点突变导致 Csf1r 表达量
增加，后者通过自分泌生长方式促进肝癌细胞的生长和转
化［7］。同时，Pdgfra、Vegfc、Figf、Csf1r、Igf1 又能通过 PI3K －
AKT途径促进肿瘤生成、侵袭和转移［8］。Pik3r1 是一类特
异的催化磷脂酰肌醇脂物质的激酶，由其活化而产生的类
脂产物 PIP2 和 PIP3 作为第二信使结合并激活多种细胞内
靶蛋白，形成一个信号级联复合物，最终调节细胞的增殖、
分化、存活和迁移［9］，通过下调 Pdgfra、Vegfc、Figf、Csf1r、
Igf1、Pik3r1、Prkcb而抑制了 PI3K － AKT途径。
Fzd9 Frizzle基因家族的成员编码了一个 7 次跨细胞膜
的跨膜蛋白，这个蛋白是 Wnt 信号通路的组成成员，并在
其中发挥了重要的作用［10］。Wnt 途径的异常活化在细胞
癌变、肿瘤发生及肿瘤侵袭过程中具有重要的作用。当基
因本身或通路其他任一成员因素发生变化使其不正常活化
时，均有可能引起肿瘤，其中 FZD 受体的异常表达可见于
多种恶性肿瘤［11 － 12］。Tcf7l1、Tcf7l2、Fzd9、Prkcb 参与 Wnt
信号传导通路，与肿瘤细胞增殖和分化相关。下调这些基
因，能从 Wnt途径对肿瘤起到抑制作用。
Cyclin E是细胞周期蛋白中的一种，它可与 CDk2 结合
形成复合物，磷酸化其底物，释放转录因了 E2F，启动 DNA
复制，使细胞由 G1 期进入 S 期，是 G1 / S 期转换的主要限
速因子［13］，P15(CDKN2B)在 TGFβ介导的生长抑制中起重
要作用。TGFβ诱导细胞阻滞在 G1 期，起源于 P15 转录量
的增加，后者可与 cyclinD /cdk4、cyclinD /cdk6 复合体结合，
取代复合体中的 P27，使 P27 结合并抑制 cyclinE /cdk2 复合
体。TGFβ抑制生长的作用归因与上述两种 cyclin /cdk 复
合体的共同抑制。［14］
Myc基因是人类肿瘤中最常见的高表达的癌基因之
一，它在肝癌中呈高表达，涉及肿瘤发生发展过程中许多方
面，如细胞增殖、分化、凋亡等［15］。各种模式证实，c － myc
的过度表达能导致细胞增殖和细胞死亡都增加［16 － 17］，从而
使肿瘤的绝对细胞数没有净增加。
同时，我们发现 Ctbp2、Mmp1a、Vegfa 出现了上调，这 3
个基因分别涉及促进上皮 －间质转化、降解多种细胞外基
质和基底膜成分和促血管生成［18 － 20］，这说明蜘蛛香总黄酮
抑制肿瘤作用的复杂性有待于我们的下一步深入探讨。
总之，蜘蛛香总黄酮可以通过下调多种功能基因从肿
瘤细胞凋亡、增殖和迁移等多个方面发挥抗肿瘤作用。其
抗肿瘤作用是多个靶基因共同作用的结果，尚需使用功能
分类基因芯片对表达谱芯片进行进一步研究。
参考文献
［1］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典:1 部［S］．北京:中国
医药科技出版社，2010:345．
［2］ 张占平．蜘蛛香提取物体外抗结肠癌作用研究［D］． 西南交
通大学硕士学位论文，2010:23．
［3］ 朱东明，李德春． EPAS1、VEGF 在胰腺癌中表达及其相关性
［J］．江苏医药，2008，34(5) :433 － 435．
［4］ Ｒatcliffe PJ． HIF － 1 and HIF － 2:working alone or together in
hypoxia? ［J］ J． Clin Invest，2007，117(4) :862 － 865．
［5］ Chen K T，Lin J D，Liou M J，et al． An aberrant autocrine activa-
tion of the platelet － derived growth factor alpha － receptor in
follicular and papillary thyroid carcinoma cell lines［J］． Cancer
Lett，2006，231(2) :192 － 205．
［6］ 王刚，代小菊，等．血管内皮生长因子与肿瘤的抗血管生成治
疗［J］．中国医药，2006，1(9) :574 － 575．
［7］ 崔俊，杨冬华． CSF － 1 受体 / c － fms与肝癌［J］． 世界华人消
化杂志，2000，8(6) :696 － 697．
［8］ 薛亚梅，李坤，等． IGF － 1 对细胞凋亡的抑制调控［J］． 生命
科学，2007，19(1) :68 － 71．
［9］ Osaki M，Oshimura M，Ito H． PI3K － Akt pathway:Its functions
and alterations in human cancer［J］． Apoptosis，2004，9(6) :667
－ 76．
［10］ Ｒulifson E J，Wu C H，Nusse Ｒ． Pathway specificity by the bi-
functional receptor Frizzled is determined by affinity for wingless
［J］． Mol Cell，2000，6:1172126．
［11］ To KF，et al． Alterations of frizzled(FzE3)and secreted frizzled
related protein (hsFＲP)expression in gastric cancer［J］． Life
Sci，2001，70(4) :483．
［12］ Winn ＲA，et al． Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd9 in
non － small cell lung cancer cells is mediated through EＲK － 5
－ dependent activation of peroxisome proliferator － activated re-
ceptor gamma［J］． J Biol Chem，2006，281(37) :26943．
［13］ Keyomarsi K，0’Leary N，Molnar G，et a1． Cyclin E a potential
prognostic marker for breast cancer． Cancer Ｒes，1994，54(2) :
380 － 385．
［14］ Vita V T，Hellman J，AＲosenberg S，et a1 ． 癌 －肿瘤学原理
和实践［M］． 5 版．徐从高，张茂宏，杨兴季等，译． 济南:山
东科学技术出版社，2001:131．
［15］ 赵文洁，扬帆．二阶段化学诱发小鼠肝癌模型 C － MYC 基因
动态变化的研究［J］．广西医学，2013，35(1) :1 － 5．
［16］ Symonds H，Krall L，Ｒemington L，et al． p53 － dependent apop-
tosis suppresses tumor growth and progression in vivo［J］． Cell，
1994，78:703．
［17］ Evan Gl，Wyllie AH，Gilbert CS，et al． Induction of apoptosis in
fibroblasts by c － myc protein［J］． Cell，1992，69:119．
［18］ 黄承信，曾思恩． CTBP 与肿瘤相关的研究［J］． 当代医学，
2011，17(35) :38 － 40．
［19］ Werner JA，Ｒathcke IO，Mandic Ｒ，et al． The role of matrix
metalloproteinases in squamous cell carcinomas of the head and
neck［J］． Clin Exp Metastasis，2002，19:275 － 282．
［20］ STAMENKOVIC I． Matrix metalloproteinases in tumor invasion
and metastasis［J］． Semin Cancer Biol，2000，10:415 － 433．