全 文 ：收稿日期：2015-04-14
文章编号： 1005-8982（2015）24-0014-05
·论著·
蒲葵子乙醇提取物对人肝癌Bel-7402
细胞增殖和迁移的影响
刘俊斌 1，吴卫红 2，靳君华 1
（1.内蒙古医科大学附属医院 肝胆外科，内蒙古 呼和浩特 010050；2.内蒙古
医科大学附属医院 门诊办公室，内蒙古 呼和浩特 010050）
摘要：目的 研究蒲葵子乙醇提取物（EELC）对人肝癌Bel-7402细胞增殖和迁移的影响。方法 将培养的
Bel-7402细胞随机分为5组：对照组、150μg/ml EELC处理组、300μg/ml EELC处理组、10μmol/L Notch抑
制剂DAPT处理组和10μg/ml抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体处理组，分别处理后，采用MTT和划痕实验
检测各组细胞增殖和迁移能力的变化，Western blot检测各组细胞内VEGF、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）及
Notch胞内片段（NICD）等蛋白表达的变化，ELISA检测各组细胞分泌VEGF水平的变化。结果 不同浓度EELC、
DAPT和抗VEGF抗体处理Bel-7402细胞后，Notch-VEGF途径相关的VEGF、MMP-2、NICD等蛋白表达水
平、VEGF分泌量、细胞的增殖和迁移能力均受到不同程度地抑制（P<0.05）。而且EELC的抑制作用呈现一定
的浓度依赖性和时间依赖性。结论 蒲葵子乙醇提取物可通过Notch-VEGF途径抑制人肝癌Bel-7402细胞
的增殖和迁移。
关键词： 蒲葵子；人肝癌细胞系；Notch-VEGF；增殖；迁移
中图分类号：R735.7 文献标志码：A
Effects of Livistona chinensis seeds on proliferation and
migration of hepatocellular carcinoma Bel-7402 cells
Jun-bin LIU1, Wei-hong WU2, Jun-hua JIN1
(1. Department of Hepatobiliary Surgery, 2. Outpatient Office, the Affiliated Hospital, Inner
Mongolia Medical University, Huhhot, Inner Mongolia 010050, P.R. China)
Abstract:【Objective】To study the effect of ethanol extract of Livistona chinensis seeds (EELC) on the
proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma Bel-7402 cells. 【Methods】Cultured Bel-7402
cells were randomized into five groups: control group, 150 μg/ml EELC group, 300 μg/ml EELC group, 10
μmol/L DAPT group and 10 μg/ml anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) group. After treatment, cell
proliferation was determined by MTT assay and cell migration by wound-healing assay. Furthermore, the ex－
pressions of VEGF, matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and Notch intracellular domain (NICD) in Bel-7402
cells were evaluated by Western blot, and the secretion of VEGF protein was detected by ELISA.【Results】
Treatments with different concentrations of DAPT, anti-VEGF antibody and EELC inhibited the proliferation
and migration of Bel-7402 cells, as well as the expressions of VEGF, MMP-2 and NICD proteins (P < 0.05).
Additionally, EELC inhibited cell proliferation and migration as well as gene expressions in a dose - and
time-dependent manner.【Conclusion】EELC may inhibit the proliferation and migration of human hepatocel－
lular carcinoma Bel-7402 cells through Notch-VEGF pathway.
Key words: Livistona chinensis seed; Bel-7402 cell line; Notch-VEGF; proliferation; migration
第25卷第24期 中国现代医学杂志 Vol. 25 No.24
2015年8月 China Journal of Modern Medicine Aug. 2015
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蒲葵子为棕榈科蒲葵的种子，味淡，性平，甘涩，
微毒。南方民间有用蒲葵子治疗癌症的历史，现也已
有不少关于蒲葵子抗癌活性和抗血管生成作用的相
关研究报道[1-3]，尤其是蒲葵子的乙醇提取物具有较
强的抗肿瘤作用[4]。肝癌是全球第三大致死癌症，具
有恶性程度高，易转移复发等特点[5]。目前，在肝癌
诊治方面已取得较大进展，但关于肝癌的转移机制
仍需进一步阐明。
大量研究表明，肿瘤转移的发生、发展总是伴随
着新生血管的形成，如果没有新血管的形成，肿瘤会
处于生长抑制状态，甚至发生退化。如今，肿瘤转移
中的血管生成已作为抗癌治疗的一个重要靶点，尤
其在阻断Notch和血管内皮生长因子（vascular en-
dothelial growth factor，VEGF）信号通路方面[6]。Notch
和VEGF通路的相互作用方式为相互调节，既有区
别，又协同[7]。关于Notch和VEGF通路参与肝癌转
移发生发展的研究已有相关报道，体内实验研究提
示，蒲葵子可通过下调Notch通路来抑制肝癌转移
的血管生成[4]，而关于蒲葵子针对肝癌细胞迁移机制
的体外实验研究少有报道。因此，本实验拟以人肝癌
细胞系Bel-7402为研究对象，在不同浓度蒲葵子乙
醇提取物 （ethanol extract of Livistona chinensis
seeds，EELC）、DAPT或抗VEGF抗体处理下，分别采
用MTT、Western blot、ELISA和划痕实验等方法，检
测Notch和VEGF通路相关的分子表达，以此探究蒲
葵子对Bel-7402细胞增殖和迁移能力的影响和分
子机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人肝癌细胞株 Bel-7402 购于美国 ATCC 细胞
库，RPMI-1640培养基为美国GIBCO公司产品，蒲
葵子购于西南偏冷草药房，人VEGF ELISA试剂盒
购于武汉博士德生物工程有限公司，HRP-标记的
山羊抗鼠二抗和HRP-标记的山羊抗兔二抗购于江
苏碧云天生物技术研究所，鼠抗人NICD抗体、兔抗
人 VEGF 抗体为美国 Abcam 公司产品，兔抗人
MMP-2 抗体和兔抗人β-actin 为美国 Santa Cruz
公司产品，DAPT、MTT及DMSO为美国 Sigma公司
产品，胰酶为美国Invitrogen公司产品。其他试剂均
为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 溶液配制将蒲葵子分别用10倍量95%乙
醇回流提取3次，每次1h，分别合并提取液，浓缩，
冷冻干燥，备用。取一定量的EELC干粉，用DMSO
和无水乙醇等体积溶解，配制600g/L EELC储液，
无菌过滤。用DMSO配制20mmol/L DAPT储液。
1.2.2 细胞培养和分组Bel-7402 细胞用含 10%
灭活胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素
的RPMI 1640培养基，在37℃、5%二氧化碳（CO2）
条件下进行培养。根据细胞生长情况，更换培养基，
取对数生长期细胞用于实验。以下各实验的细胞均
分为 5 组，对照组（细胞 + 培养基）、150μg/ml
EELC 处理组（细胞 + 培养基 +EELC）、300μg/ml
EELC 处理组（细胞 + 培养基 +EELC）、10μmol/L
DAPT处理组（细胞+培养基+DAPT）和10μg/ml
抗VEGF抗体处理组（细胞+培养基+抗VEGF抗
体），各组细胞用相应处理的培养基孵育时间一致。
1.2.3 MTT检测细胞增殖活性将Bel-7402细胞
按1×104个/孔的密度接种于96孔板，每孔200μl
培养基，24h后换液，并按24h和48h时间点培养细
胞，各自分5组，分别加180μl相应处理的含血清
培养基，每组设6个复孔。分别在24和48h时间
点，收集上清液，同时向待测孔加入 20μl MTT溶
液（5g/L），37℃ 4h。弃上清液，每孔加入150μl
DMSO，溶解后，酶标仪检测 490 nm处各孔的吸光
值（OD值），并按公式计算各组的细胞活性：细胞相
对活性=处理组平均OD值/对照组平均OD值×
100%。
1.2.4 Western blot检测Notch-VEGF途径相关蛋
白表达 将Bel-7402细胞按 4×105个 /孔的密度
接种于6孔板，24h后换液，进行无血清RPMI 1640
培养24h之后，向各组中分别加相应处理的无血清
培养基。作用24h后，提取细胞全蛋白，Western blot
法检测VEGF、MMP-2、NICD等蛋白的表达。
1.2.5 ELISA 检测细胞 VEGF 分泌水平按 1.2.3
方法获取相应处理后的上清液，置于4℃冰箱保存，
10000r/min，离心10min，收集上清液，用BCA法检
测蛋白的浓度。另取各组部分上清液，按ELISA试
剂盒说明书操作，最后酶标仪检测，读取450nm处
的OD值，绘制标准曲线，计算各组细胞分泌上清液
中每1mg蛋白中的VEGF含量。
1.2.6 划痕实验检测细胞迁移能力将 Bel-7402
细胞按4×105个/孔的密度接种于6孔板，待细胞长
至80%左右汇合时换液，进行无血清RPMI 1640培
养24h。然后用 200μl无菌枪头在单层细胞上划
第24期 刘俊斌，等：蒲葵子乙醇提取物对人肝癌Bel-7402细胞增殖和迁移的影响
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中国现代医学杂志 第25卷
覮与对照组比较，P <0.05
图1 不同处理对Bel-7402细胞增殖的影响
时间组
细
胞
相
对
活
性
/%
对照组
150μg/ml EELC
300μg/ml EELC
10μmol/L DAPT
10μg/ml抗VEGF抗体
150
100
50
0
24h 48h
覮
覮
覮 覮
覮
覮
覮 覮
0：对照组；1：150μg/ml EELC处理组；2：300μg/ml EELC处理组；3：10μmol/L DAPT处理组；4：10μg/ml 抗VEGF抗体处理组。覮与对照
组比较，P<0.05
图2 不同处理对Bel-7402细胞VEGF、MMP-2、NICD蛋白表达水平的影响
10
8
6
4
2
0
各
蛋
白
相
对
表
达
量
对照组
150μg/ml EELC
300μg/ml EELC
10μmol/L DAPT
10μg/ml抗VEGF抗体
VEGF MMP-2 NICD
覮
覮 覮 覮 覮
覮
覮 覮
覮
覮 覮 覮
A B
痕，PBS洗去漂浮细胞，后向各组中分别加相应处理
的无血清培养基培养。在划痕后0、24h时间点，均
通过倒置显微镜和电脑软件在同一位置观察划痕区
域的细胞迁移情况，并计数。
1.3 统计学方法
实验数据采用 SPSS 13.0 软件进行统计学分
析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间用单
因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同处理对Bel-7402细胞增殖情况的影响
MTT结果显示，在24和48h时间点，与对照
组比较，EELC、DAPT 和抗 VEGF 抗体组的细胞增
殖均受到了不同程度的抑制（P<0.05），而且随着作
用时间的延长，抑制效果更加明显。同时，EELC对
该细胞增殖的抑制作用随剂量的增加而增强，
300μg/ml、48h EELC处理对Bel-7402细胞有极其
显著的增殖抑制作用，细胞相对活性低至31%。见
图1。
2.2 不同处理对 Bel-7402 细胞 Notch-VEGF 途
径相关蛋白表达的影响
Western blot结果显示，与对照组比较，EELC、
DAPT 和抗 VEGF 抗体组的细胞 VEGF、MMP-2、
NICD 等蛋白表达量均明显下调（P<0.05），并且高
浓度的EELC比低浓度的EELC对3种蛋白表达的
下调作用更显著，有着明显的浓度-效应依赖关系。
见图2。
2.3 不同处理对 Bel-7402细胞分泌 VEGF 水平
的影响
ELISA结果显示，见图3，在24和48h时间点，
EELC、DAPT和抗VEGF抗体等处理均能不同程度
地降低Bel-7402细胞分泌VEGF水平，与同样时间
条件下的对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。
而且，EELC浓度越高，相应组细胞培养上清液中的
VEGF含量越低。此外，随着作用时间的延长，各组
0 1 2 3 4
VEGF
MMP-2
NICD
β-actin
覮与对照组比较，P <0.05
图3 不同处理对Bel-7402细胞分泌VEGF水平的影响
1500
1000
500
0
V
E
G
F
浓
度
/（
pg
/m
l）
时间组
对照组
150μg/ml EELC
300μg/ml EELC
10μmol/L DAPT
10μg/ml抗VEGF抗体
24h 48h
覮
覮 覮 覮
覮
覮 覮 覮
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第24期 刘俊斌，等：蒲葵子乙醇提取物对人肝癌Bel-7402细胞增殖和迁移的影响
100
80
60
40
20
0
24h
0 1 2 3 4
迁
移
细
胞
数
目
对照组
150μg/ml EELC
300μg/ml EELC
10μmol/L DAPT
10μg/ml抗VEGF抗体
覮
覮
覮 覮
0h
24h
0：对照组；1：150μg/ml EELC处理组；2：300μg/ml EELC处理组；3：10μmol/L DAPT处理组；4：10μg/ml 抗VEGF抗体处理组。覮与对照
组比较，P <0.05
图4 不同处理对Bel-7402细胞迁移能力的影响 （×200）
细胞的VEGF分泌量反而略有下降。
2.4 不同处理对Bel-7402细胞迁移能力的影响
划痕24h后，各组细胞均有不同数量的迁移，但
对照组的细胞迁移现象最为明显，各处理组的细胞
发生迁移的数目明显低于对照组（P<0.05）。EELC、
DAPT和抗VEGF抗体等处理对Bel-7402细胞的迁
移能力都是有所抑制，并且该细胞的迁移能力与
EELC浓度呈负相关。见图4。
3 讨论
肿瘤细胞的增殖和迁移是肝癌患者死亡的的首
要原因，也是临床治疗易复发，预后差的主要原因[8]。
在肝癌发生、发展过程中，肝癌细胞中的VEGF、
MMP-2和NICD蛋白表达量相比于正常细胞均显
著上调，与本实验结果一致。其中，VEGF是作用最
强的血管生成因子，与肝癌细胞的迁移有关，可通过
旁分泌途径诱导肿瘤血管生成，促进肿瘤生长；也
可作为一种自分泌生长调节因子而直接刺激肿瘤
生长。同时它还能诱导血管内皮细胞产生MMP-2
等降解细胞基底膜和细胞外基质的蛋白水解酶，从
而有利于肝癌细胞迁移进入脉管系统，促进血管内
皮细胞增殖和血管形成。因此，VEGF几乎参与整个
血管新生的病理生理过程。而NICD是Notch信号
通路激活后，细胞表面的Notch受体与配体结合，在
γ-分泌酶的水解作用下，Notch受体的胞内段被切
割而形成的片段产物，随后该片段进入细胞核，作用
于下游基因，从而产生各种生物学效应。总之，VEGF
通路与肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移、血管形成以及复
发密切相关；Notch 通路则是结构高度保守的经典
信号通路，参与生物个体发育和肿瘤不同发生发展
的过程。
该实验发现，EELC 作用能明显抑制 Bel-7402
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中国现代医学杂志 第25卷
细胞的增殖和迁移水平，有一定的浓度依赖性和时
间依赖性，说明蒲葵子在调控肝癌细胞的增殖和迁
移能力有一定的抑制作用。抑制Notch或者VEGF通
路也均使Bel-7402细胞的增殖作用和迁移水平明
显降低，说明在抑制肝癌细胞增殖和迁移方面，蒲葵
子、Notch抑制剂DAPT和抗VEGF抗体3者是有相
同的抑制作用。另外，在EELC、DAPT和抗VEGF抗体
分别作用下，Bel-7402细胞的VEGF分泌水平都明
显降低，提示蒲葵子的抗肿瘤机制可能通过降低细
胞分泌VEGF，而抑制内皮细胞VEGF受体表达，从
而干预VEGF和Notch信号转导通路的实现。
本研究表明，蒲葵子可通过下调Notch通路来抑
制肝癌转移的血管生成[4]；VEGF通路抑制剂能明显
抑制VEGF引发的主动脉环微血管形成和植入的人
工基底膜新血管形成[9]；在Notch信号上调的肿瘤发
生中，抑制Notch通路可能加强VEGF抑制剂作用[10]；
同时抑制Notch和VEGF通路并不影响肿瘤重量，
但会导致血管退化，降低肿瘤活性，远高于单独抑制
某一通路的效果[7]。可见Notch和VEGF通路在促进
肝癌细胞迁移和肿瘤血管形成上是有共同之处的，
并且蒲葵子很可能是通过 Notch-VEGF 途径来实
现对肝癌细胞增殖和迁移的抑制。
本研究表明，抑制肝癌细胞Notch通路会导致
VEGF表达下调[11]，VEGF的表达也可影响Notch通
路[12]，可见Notch和VEGF信号通路是相互作用、相
互调节的作用方式。而抗VEGF抗体可以中和VEGF
的作用，抑制其与受体结合，从而抑制肿瘤细胞生
长；Notch抑制剂DAPT则可下调Notch通路。本实
验中，将不同浓度EELC、DAPT或者抗VEGF抗体
分别与 Bel-7402 细胞共培养 24 h 后，检测到
NICD、MMP-2 和 VEGF 蛋白表达显著下调，即
Notch和VEGF通路均明显受到抑制，进一步证实
Notch和VEGF通路主要是通过相互作用来调节肝
癌细胞的增殖和迁移能力，并且蒲葵子作用于Bel-
7402 细胞，可通过下调 Notch 和 VEGF 通路，进而
抑制肝癌细胞的的增殖和迁移。
综上所述，Bel-7402 细胞中的 Notch-VEGF 信
号通路处于激活状态。其中VEGF、MMP-2和NICD
等分子均为高表达，VEGF分泌量、细胞增殖和迁移
能力也均处于较高水平。而蒲葵子可通过Notch-
VEGF 途径能明显抑制 VEGF、MMP-2 和 NICD 等
相关分子表达，并使人肝癌细胞Bel-7402的增殖和
迁移能力明显降低，且表现为一定的浓度依赖性和
时间依赖性。因此，蒲葵子作用可显著降低肝癌细胞
的增殖和迁移能力，抑制血管形成和肝癌转移，这无
疑为今后蒲葵子应用于肝癌靶向药物的开发研究提
供实验基础，也可能为肝癌治疗提供一条新途径。
参 考 文 献：
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（刘东京 编辑）
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