全 文 ：综上所述，本实验中大鼠在布比卡因脊髓神经毒
性后，6 和 12 h接受 GM － 1 治疗均可以提高脊髓组织
bcl － 2 mＲNA的阳性表达，抑制脊髓神经早期细胞凋
亡;且早期治疗效果好。
参考文献
［1］ Carron M，Behr A，Ori C． Cauda equina syndrome following com-
bined spinal and epidural anesthesia with levobupivacaine［J］． Mi-
nerva Anestesiol，2013，79(12) :1445 － 1446．
［2］ Chen X，Xu Z，Lin Ｒ，et al． Persistent cauda equina syndrome
after cesarean section under combined spinal － epidural anesthe-
sia:a case report［J］． J Clin Anesth，2015，27(6) :520 － 523．
［3］ 何亚军，刘敬臣． 2008 ～ 2012 年广西各级医院椎管内麻醉神
经系统并发症初步调查分析［J］． 临床麻醉学杂志，2013，29
(8) :792 － 793．
［4］ Chiu YS，Cheng YH，Lin SW，et al． Bupivacaine induces apoptosis
through caspase － dependent and － independent pathways in canine
mammary tumor cells［J］． Ｒes Vet Sci，2015，100:232 －238．
［5］ 中华医学会创伤学会神经损伤专业组． 单唾液酸四己糖神经
节苷脂钠盐注射液———治疗脑、脊髓损伤患者的专家共识
［J］． 中华创伤杂志，2010，26(1) :232 － 238．
［6］ 吉杰梅，陆华良，谷万杰，等． 鞘内注射单唾液酸神经节苷脂
对布比卡因椎管麻醉诱发大鼠脊髓毒性的治疗效果［J］． 中
华麻醉学杂志，2013，33(7) :815 － 818．
［7］ Xu F，Li T，Zhang B． An improved method for protecting and
fixing the lumbar catheters placed in the spinal subarachnoid space
of rats［J］． J Neurosci Methods，2009，183(2) :114 － 118．
［8］ Takenami T，Wang G，Nara Y，et al． Intrathecally administered
ropivacaine is less neurotoxic than procaine，bupivacaine，and
levobupivacaine in a rat spinal model［J］． Can J Anaesth，2012，
59(5) :456 － 465．
［9］ Lu J，Xu SY，Zhang QG，et al． Bupivacaine induces reactive oxy-
gen species production via activation of the AMP － activated protein
kinase － dependent pathway［J］． Pharmacology，2011，87(3 /4) :
121 － 129．
［10］ Yao Q，Chen J，Lv Y，et al． The significance of expression of au-
tophagy － related gene Beclin，Bcl － 2，and Bax in breast cancer
tissues［J］． Tumor Biol，2011，32(6) :1163 － 1171．
［11］ 陈永刚，刘文忠，王栓科，等． 神经节苷脂对大鼠脊髓损伤后
神经元保护和修复作用的实验研究［J］． 兰州大学学报:医学
版，2013，39(4) :1 － 6．
(收稿日期:2015 － 08 － 25 编辑:林培德)
* 国家级大学生创新创业训练计划项目(编号:201410599011)
△通信作者。E － mail:1048912839@ qq． com
蒲葵子水提液对人肝癌细胞株 HepG2 凋亡的
作用*
何思远，罗翠，覃寿阳，莫小莹，罗艳红，邹佳峻△
右江民族医学院医学检验学院(广西百色 533000)
【摘要】 目的 研究蒲葵子水提液对人肝癌细胞株 HepG2 的凋亡作用和机制。方法 将蒲葵子水提液作
用于传代培养的人肝癌细胞株 HepG2(蒲葵子治疗组) ，设置未加蒲葵子水提液的 HepG2 为对照组，采用 MTT 法
检测蒲葵子水提液对 HepG2 细胞增殖的抑制作用，通过测出的最低吸光度值来确定药物作用的最佳浓度，流式细
胞仪(FCM)测定蒲葵子水提液作用前后的细胞凋亡率，ELISA 测定 Bcl － 2、Bax 因子的含量和细胞分泌的 VEGF
水平。结果 蒲葵子水提液作用于人肝癌细胞株 HepG2 24 h后的最佳药物量为 100 μL，作用后的细胞抑制率为
41． 4%，凋亡率为 9． 0%，蒲葵子治疗组与对照组相比，Bcl － 2 含量下降(P ＜ 0. 01) ，Bax 含量上升(P ＜ 0. 05) ，
Bcl － 2 /Bax下降(P ＜ 0. 05) ，VEGF分泌量下降，差异有统计学意义(P ＜ 0. 05)。结论 蒲葵子水提液对人肝癌细
胞株 HepG2 有促凋亡作用，其机制是 Bcl － 2 含量下降，Bax含量上升，Bcl － 2 /Bax显著下降。同时，蒲葵子水提液
能抑制肿瘤血管的形成。
【关键词】 蒲葵子;HepG2;凋亡机制
肝癌是病死率很高的难治性恶性肿瘤，我国为肝
癌的高发区，其病死率位居肿瘤的第 2 位，全球每年肝
癌死亡病例中约有半数在中国［1］，肝癌已成为严重危
害我国人民生命健康的疾病。化疗、放疗等常规疗法
不良反应大，影响患者的生活质量。临床疗效观察研
究表明，中草药治疗能有效的稳定患者病情，改善临床
症状［2］，配合手术、放化疗等治疗可防止肿瘤复发转
移，解毒增效，消灭癌细胞，使部分患者肿瘤缩小，延长
患者生存期［3］。故低毒、有效的天然抗肿瘤药物成为
了肿瘤治疗的新方法和研究热点。蒲葵为棕榈科蒲葵
属常绿乔木，蒲葵的种子(简称“蒲葵子”)具有凉血止
血、止痛功效和抗癌作用，对慢性肝炎、白血病、食管
癌、胃癌和子宫颈癌有一定的治疗作用［4］。目前，国内
外已有关于蒲葵子抗癌活性成分及抗肿瘤作用的报
道，但未见到关于蒲葵子对人肝癌细胞株 HepG2 的凋
亡作用及机制的研究报道。为此，2014 年 1 月至 2015
年 10 月，本研究针对蒲葵子的抗癌作用，对蒲葵子水
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DOI:10.13820/j.cnki.gdyx.2016.15.010
提液促人肝癌细胞凋亡的作用及机制进行研究。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
1． 1． 1 细胞株 人肝癌细胞株 HepG2 (上海细胞库)。
1． 1． 2 主要试剂 胰蛋白酶(0. 25%)、二甲基亚砜
(DMSO)、四甲基蓝(MTT，pH = 7，5 g /L) (武汉博士德
生物有限公司)、细胞凋亡试剂盒(上海劲马科技有限
公司)、蒲葵子(3 g，自采)。
1． 1． 3 主要仪器 CO2恒温培养箱(MCO － 18AIC) ;
生物安全柜(BHC_1300HA /B) ;酶联免疫检测仪(ＲS_
232C) ;流式细胞仪(美国 BD医疗器械有限公司)。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 蒲葵子水提液制备 3 g 蒲葵子加入 200 mL
纯净水中，煮沸，小火煮 15 min，浓缩至 60 mL，过滤取
上清液。
1． 2． 2 细胞传代培养 传代培养人肝癌细胞株
HepG2，用 0． 25%的胰酶消化后，加入培养液吹打制成
细胞悬液，培养后取对数生长期的细胞。
1． 2． 3 最佳药物浓度确定 MTT 法检测蒲葵子水提
液对 HepG2 细胞增殖的抑制作用，找出吸光度值最低
的最佳浓度。收集对数期 HepG2 细胞并调整为 5 ×
104 个 /mL接种于 96 孔板内，每孔 100 μL，2 h 时后设
置未加药的 HepG2 为对照组，以及 75、100、125 μL 蒲
葵子水提液处理组，均补足培养液至 200 μL。每组设
4 个复孔，置培养箱中培养 24 h。每孔加入 20 μL MTT
溶液(5 mg /mL，即 0. 5%MTT) ，继续培养 4 h。小心吸
弃上清，每孔加入 100 μL DMSO，充分振荡 10 min，使
结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪测量各孔的吸光
值(OD值) ，得出蒲葵子水提液最佳作用浓度。根据
公式抑制率(%)= (1 － 实验组平均值 /对照组平均
OD值)× 100%计算细胞生长抑制率
1． 2． 4 流式细胞仪测定细胞凋亡率［5］ 将对数期细
胞调整为 5 × 105 个 /孔，细胞贴壁后，加入相应的适量
(1． 2． 3 确定的最佳浓度)的药物，置于 37℃、5% CO2、
95%O2 的细胞培养箱中，6 h 后停止培养，收集细胞，
按细胞凋亡试剂盒说明书处理细胞，膜联蛋白 V(An-
nexinV) ，碘化丙啶(PI)染色，上机，打出细胞凋亡图像
及凋亡百分率。
1． 2． 5 ELISA 检测细胞凋亡相关因子和血管内皮生
长因子(VEGF) 加药培养 24 h 后将细胞上清液收
集，12 000 r /min，4℃下离心 10 min，取上清液 50 μL，
按 Bcl － 2、Bax、VEGF等试剂盒说明书操作，用酶标仪
测各孔 450 nm下的 OD值，拟合标准曲线，确定线性范
围，将待测样本 OD值代入线性方程，最终得到各因子
的含量。
1． 3 统计学方法 采用 SPSS 13. 0 统计软件进行方
差分析和配对 t检验，P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 药物的最佳浓度 对照组、75、100、125 μL蒲葵子
水提液处理组 OD 值分别为 0、0. 319 ± 0. 008、0. 198 ±
0. 028、0. 148 ± 0. 008、0. 216 ± 0. 030，观测到细胞数目
与 OD值成正比，细胞数越少，则吸光度越低。由数据
可知蒲葵子水提液对肝癌细胞作用的最佳药物量为
100 μL。得到 24 h 时蒲葵子对细胞的抑制率为
41. 4%。
2． 2 细胞凋亡率检测结果 细胞凋亡以早期凋亡为
主，见图 1。蒲葵子组细胞凋亡率为 9. 0 ± 0. 4，对照组
为 7. 1 ± 0. 1，差异有统计学意义(P ＜ 0. 01)。
A:蒲葵子组;B:对照组;Q2:早期凋亡;Q4:晚期凋亡
图 1 流式细胞术细胞凋亡图
2． 3 细胞凋亡相关因子等含量表达 药物作用 24 h
后，与对照组比较，蒲葵子组 Bcl － 2 含量下降，Bax含量
上升，Bcl － 2 /Bax 比值下降，差异有统计学意义(P ＜
0. 05，P ＜ 0. 01) ，见表 1。而 VEGF 分泌量蒲葵子组为
0. 006 ± 0. 003，对照组为 0. 032 ± 0. 001，差异有统计学
意义(P ＜ 0. 05)。
表 1 细胞因子含量表达 珋x ± s
因子 蒲葵子组 对照组
Bcl － 2 0． 044 ± 0． 006＊＊ 0． 061 ± 0． 001
Bax 0． 058 ± 0． 000* 0． 044 ± 0． 004
Bcl － 2 /Bax 0． 759 ± 0． 098* 1． 395 ± 0． 166
与对照组比较* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
3 讨论
蒲葵为多年生植物，广泛分布于中国的南部地区，
药材资源丰富，蒲葵子易于取得。有研究报道，蒲葵子
提取物具有较好的体外抗肿瘤活性［5 － 9］。另有研究表
明，从蒲葵子中分离出的薯蓣皂苷元及 β －胡萝卜苷
是蒲葵子抑制癌细胞功能的主要有效成分［10］。临床
上，蒲葵子与其他成分配伍制成的复方金蒲片、复生康
胶囊对联合化疗和放疗具有增效作用，治疗原发性肝
癌效果显著［11 － 12］。
流式细胞术是用于细胞定量分析和分选的技术，
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是目前细胞凋亡分析和检测应用较多的一种方法，通
过检测细胞的凋亡数和凋亡指数，可以早期测定药物
的疗效。本研究采用 FCM AV结合 PI双染色法，可将
凋亡各时期的细胞以及死细胞区分开来。AV 是一种
磷脂结合蛋白，在细胞凋亡的早期，AV 与从细胞膜内
侧翻向外侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)高
亲和力特异性结合，在发生细胞凋亡时，PS 外翻早于
细胞核的改变，AV 能更早地检测到凋亡细胞，故为检
测细胞凋亡的灵敏指标之一，PI 在凋亡中晚期细胞和
死细胞中能透过细胞膜使细胞核染红，AV 常与 PI 联
合使用，以区分凋亡细胞(AV + /PI － )与死亡细胞
(AV + /PI +)［13］，由此得出细胞凋亡图像和百分率。此
检测方法具有检测速度快，采集数据量大，分析全面客
观的特点，是检测细胞凋亡较为理想的方法［13］。
本研究进行了预实验的浓度摸索，在设置好的 3
个药物浓度梯度中，寻找最佳的药物作用量，结果显
示，药物量为 100 μL 时，有最低的 OD 值，故蒲葵子水
提液最佳作用药量为 100 μL。将蒲葵子水提液药物量
设置为 100 μL，作用于 HepG2 细胞株 24 h，结果对肝
癌细胞 HepG2 的增殖有一定的抑制作用，其抑制率为
41. 4%。用流式细胞 AV结合 PI双染色法测定细胞凋
亡率，其结果为(9. 0 ± 0. 4)%，表明蒲葵子水提液能使
肝癌细胞 HepG2 凋亡。有研究表明，Bcl － 2 为抑制细
胞凋亡因子，Bax为促细胞凋亡因子［14］，蒲葵子作用于
肝癌细胞株 HepG2 后，Bcl － 2 含量下降，Bax 含量上
升，同时 Bcl － 2 /Bax 比值下降，说明癌细胞发生了凋
亡。有研究表明，在细胞凋亡的两个进化保守的信号
转导途径中，Bcl － 2 家族成员的构成比例是凋亡调控
的关键因素，尤其是 Bcl － 2 /Bax 比值是启动细胞凋亡
的“分子开关”，Bcl － 2 为抑制细胞凋亡因子，Bax为促
细胞凋亡因子，Bax 和 Bcl － 2 通过形成同源或异源二
聚体来调节细胞凋亡，当 Bax 形成同源二聚体时诱导
细胞凋亡［16］。在人肝癌细胞 HepG2 凋亡过程中，蒲葵
子可抑制 Bcl － 2 因子的表达，促进 Bax 因子的表达，
Bcl － 2、Bax 在此过程中发挥了重要的作用，是关键的
凋亡因子［15］;VEGF为促血管内皮细胞生长因子，在此
过程中给药组表达下降，说明蒲葵子可抑制肝癌细胞
HepG2 的血管形成，能抑制肿瘤发展。
综上所述，蒲葵子水提液能促进人肝癌细胞株
HepG2 的凋亡，通过 Bax和 Bcl － 2 的作用，使 Bcl － 2 /
Bax比值降低，共同调控人肝癌细胞株 HepG2 的凋亡。
这为蒲葵子药物的进一步研发与临床应用提供理论基
础，为治疗肝癌提供新的思路。
参考文献
［1］ 王红阳，吕桂帅，陈磊． 我国肝癌研究的现状与前景［J］． 生
命科学，2015，27(3) :237 － 245．
［2］ 王睿林，王立福，王仲霞，等． 中药治疗肝癌研究现状［J］．
传染病信息，2012，25(3) :189 － 192．
［3］ 黄赞松，仇仪英． 中医学治疗原发性肝癌的研究现状［J］． 时
珍国医国药，2012，23(11) :2851 － 2853．
［4］ 广西壮族自治区卫生局． 广西本草选编［M］． 南宁:广西人民
出版社，1998:1292 － 1293．
［5］ 罗艳红，于沛涛，陈源红． 松花粉对人肝癌细胞株 HepG2 增
殖和凋亡的影响［J］． 广东医学，2013，34(9) :1349 － 1351．
［6］ 陈艳，林新华，李少光，等． 蒲葵子的体外抗癌活性［J］． 福
建医科大学学报，2008，42(2) :93 － 94．
［7］ 王慧，李傲，董小萍，等． 蒲葵子抗肿瘤活性部位筛选及抗血
管生成作用［J］． 中药材，2008，31(5) :718 － 722．
［8］ 曾春晖，杨柯，郑作文． 蒲葵子的含药血清体外抗肿瘤作用的
实验研究［J］． 广西中医药，2007，30(1) :58 － 59．
［9］ 秦盛莹，刘雯，张园园，等． 4 种中药抗肿瘤活性的初步研究
［J］． 西北药学杂志，2007，22(1) :16 － 18．
［10］ 刘俊斌，吴卫红，靳君华． 蒲葵子乙醇提取物对人肝癌 Bel －
7402 细胞增殖和迁移的影响［J］． 中国现代医学杂志，2015，
25(24) :14 － 18．
［11］ 柳雷，熊常健，朱岳麟，等． 蒲葵子活性单体的分离及抗癌活
性研究［J］． 北京化工大学学报，2015，16(6) :20 － 25．
［12］ 吴英德，宋向群，胡晓桦，等． 复方金蒲片临床研究概述［J］．
广西医学，2007，29(13) :1722 － 1724．
［13］ 周增娣，马丽，葛争鸣，等． 流式细胞术结合 FITC － Annex-
inV /PI荧光染色检测人精子死亡［J］． 中华检验医学杂志，
2003，26(10) :626 － 627．
［14］ 黄瑞松，叶云峰，苏青，等． 复生康胶囊质量标准的研究［J］．
中草药，2003，34(8) :698 － 701．
［15］ 周增娣，马丽，葛争鸣，等． 流式细胞术结合 FITC － Annex-
inV /PI荧光染色检测人精子死亡［J］． 中华检验医学杂志，
2003，26(10) :626 － 627．
［16］ 王卫东，陈正堂． Bcl /Bax比率与细胞“命运”［J］． 中国肿瘤
生物治疗杂志，2007，14(4) :393 － 395．
(收稿日期:2016 － 01 － 05 编辑:林培德)
·7522·广东医学 2016 年 8 月 第 37 卷第 15 期 Guangdong Medical Journal Aug． 2016，Vol． 37，No． 15