全 文 ： 2009, Vol. 30, No. 20 食品科学 ※工艺技术178
紫苏高F值低聚肽的制备研究
童 波，刘大川 *，刘 晔
(武汉工业学院食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023)
摘 要：以紫苏粕为原料通过酶法水解制备紫苏高F值低聚肽，探讨Alcalase蛋白酶对紫苏粕中蛋白质水解的进程
曲线。结果显示其最适条件为底物质量浓度 5%(g/100ml)、pH8.5、温度 60℃、酶添加浓度 5ml/100g底物、时间
240min，此水解液进一步用木瓜蛋白酶水解，水解条件为 pH7.0、温度 55℃、加酶量 1%、时间 4h，然后用活
性炭吸附去除低聚肽中的芳香族氨基酸，吸附条件为 pH4.0、温度 40℃、活性炭用量 7%(m/V)、时间 3h，最后
得到 F值可达 79.25的紫苏低聚肽。
关键词：紫苏粕；高 F 值低聚肽；酶解
Preparation of Oligopeptides with High F Value from Perilla
TONG Bo，LIU Da-chuan*，LIU Ye
(School of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)
Abstract ：In order to prepare oligopeptides with high Fisher (F) value from Perilla meal through enzymatic hydrolysis, a two-
step enzymatic hydrolysis of proteins from Perilla using alcalase and papain was investigated. The optimal hydrolysis conditions
were 5% substrate concentration, pH 8.5, reaction temperature at 60 ℃, 3% enzyme amount and 24 min reaction for alcalase as
the first step hydrolysis; pH 7.0, reaction temperature at 55 ℃, 1% enzyme amount and 4 h reaction for papain as the second
step hydrolysis. The aromatic amino acids in hydrolysates were removed using active carbon to obtain oligopeptides with high
F value at pH 4.0, 40 ℃ and 7% active carbon for 3 h. The final oligopeptides revealed molecular mass ranging from 200 to 700
D and F value up to 79.25.
Key words：Perilla meal；high F value oligopeptides；enzymatic hydrolysis
中图分类号：TQ936.16 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)20-0178-04
收稿日期：2008-11-27
基金项目：湖北省教育厅项目(Q20081808)；武汉工业学院研究生教育创新基金项目(07cx001)
作者简介：童波(1983－)，男，硕士，主要从事油脂及植物蛋白工程研究。E-mail：lsl020116@126.com
*通讯作者：刘大川(1943－)，男，教授，主要从事油脂及植物蛋白工程研究。E-mail：dcliu@whpu.edu.cn
在氨基酸或低聚肽的混合物中，支链氨基酸
(BCAA)与芳香族氨基酸(AAA)的物质的量比称为 Fischer
值，简称 F 值。此值与肝脏疾病(如肝性脑病、肝硬化
等)密切相关[1]。高 F值低聚肽是一种具有高支链氨基酸
含量和低芳香族氨基酸含量组成的平均分子量在 300～
1000D左右的小肽体系。大量研究证明，高 F制剂具有
辅助治疗或减轻肝性脑病、改善术后及卧床病人的蛋白
质营养状况、抗疲劳等功效[2-13]。临床上一般要求 F值
大于 20。高 F值低聚肽独特的氨基酸组成和生理功能已
经受到食品和医药界的高度关注。因此，开发高 F 值
低聚肽具有一定意义。
国外关于大豆蛋白、鱼蛋白、酪蛋白、玉米蛋白
以及葵花蛋白等为来源的蛋白酶解制备高 F值低聚肽[2,13]
和国内玉米来源蛋白酶解制备高 F值低聚肽的研究已较
多[14-19]，而以紫苏粕为原料制备高 F值低聚肽的报道还
尚未见到。紫苏是一种传统药食两用植物。长期以来，
紫苏粕作为紫苏子制油后副产品仅仅做为廉价的饲料出
售，未被加工成食品，影响了紫苏蛋白资源的经济价
值。生产高 F值低聚肽的过程分两步进行[20]：1)选用能
使水解按要求发生在特定位置的内切酶，使得切下肽段
的 N-末端或 C-末端为芳香族氨基酸；2)用另一种能切
下芳香族氨基酸基团的外切酶，使芳香族氨基酸残基从
肽链中释放出来。
本实验以紫苏粕为原料，采用Alcalase蛋白酶和木
瓜蛋白酶依次水解，活性炭吸附去除芳香族氨基酸，制
备紫苏高 F值低聚肽。重点探讨Alcalase蛋白酶对紫苏
粕中蛋白质水解的进程曲线，为紫苏加工副产品的精深
加工探索新路，为制备高 F 值低聚肽提供技术依据。
179※工艺技术 食品科学 2009, Vol. 30, No. 20
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫苏粕预先处理(脱脂→脱植酸、单宁[21]→脱多糖[22])；
Alcalase蛋白酶(2.4AU/ml) 诺维信(中国)生物技术有限
公司；木瓜蛋白酶(100万U/g) 南宁庞博生物科技有限
公司；活性炭 自制；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
奥立龙 868型酸度计 美国奥立龙公司；FW80型
高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；80-2离
心沉淀器 江苏省金坛市医疗仪器厂；Cary-50型紫外
分光光度计 美国Varian仪器公司；SYC-15B超级恒温
水浴 南京桑力电子设备厂；78-1磁力加热搅拌器 国
华电器有限公司；CE-31-MWCO100D透析袋 上海绿鸟
科技发展有限公司；高效液相色谱仪及氨基酸分析柱 美
国Wa te rs 公司。
1.3 方法
1.3.1 常规成分测定
蛋白质含量测定：采用半微量凯式定氮法；脂肪
含量测定：采用索式抽提法(GB 5512— 1985)；水份含
量测定：采用 105℃恒重法(GB 5497— 85)，灰份含量
测定：采用 550℃灼烧法(GB 5512— 85)。
1.3.2 紫苏高 F值低聚肽的制备工艺流程
先处理后的紫苏粕→Alcalase蛋白酶酶解→灭酶(95℃，
15min)→离心(3000r/min，10min)→上清液→木瓜蛋白酶
酶解→灭酶(95℃，15min)→离心(3000r/min，10min)→
上清液→活性炭吸附芳香族氨基酸(AAA)→液体→透析
→浓缩→冷冻干燥→紫苏高 F值低聚肽
1.3.3 紫苏高 F值低聚肽氨基酸组成测定
取 1mg低聚肽和 0.16g苯酚，加 6mol/L HCl 10ml于
硬质试管中，抽真空通氮气 3次，火焰封口，105℃条
件下水解 24h，冷却开口，过滤定容 1000ml。
高效液相色谱仪及氨基酸分析柱测定紫苏肽的氨基
酸组成：离子交换柱：Sopium amino acid analysis，
4.0× 150 mm；OPA柱后衍生，衍生剂 0.4ml/min，荧
光检测 VARIAN 363，激发波长 ex：338nm，发射波
长 ex：425nm；进样条件：标准样 0.25μl，取水解液
1ml稀释至10ml，进样10μl。柱条件：A相：0.2mol/L柠
檬酸钠，pH3.0；B 相：0.2mol/L硼酸钠，pH9.8。柱
温 60℃，流速 0.4ml/min，时间 32min，0～100%的 B
线性梯度。
1.3.4 紫苏高 F值低聚肽分子量测定
采用 A g l i e n t 1 1 0 0 系列液相色谱仪，色谱柱：
TSKG2000SWXL，流动相：乙腈:水:三氟乙酸＝ 10:90:
0.1(V/V)，流速：0.5ml /min，进样量：5μl，检测波
长：220nm，样品浓度：1mg/ml。标准品：细胞色素
C，分子量 12384D；胰岛素，分子量 5733D；杆菌肽，
分子量 1422D；甘氨酸 -甘氨酸 -酪氨酸 -精氨酸，分
子量为 451.5D。所用常规溶剂乙腈为色谱纯，三氟乙
酸为分析纯。
1.3.5 水解度(DH)测定[23]
在中性碱性条件下采用 pH-stat法，水解度计算公式：

B·Nb
DH(%)=——————× 100

α·Mp·Htot
式中：B为碱液体积，ml；N b为碱液的当量浓度，
mol/L；α为α-氨基的解离常数；Mp为底物中蛋白质的
含量，g；H to t为底物中蛋白质中肽键总数，mmol /g。
本实验中取Htot=8.0[24]。
1.3.6 酶解和脱除芳香族氨基酸
通过改变底物浓度、p H 值、温度、酶与底物比
4个因素对水解度的影响，来优化 Alcalase蛋白酶酶解
条件。所得水解液再用木瓜蛋白酶进一步水解，释放
芳香族氨基酸，然后用活性炭吸附脱除芳香族氨基酸。
2 结果与分析
2.1 Alcalase蛋白酶水解紫苏粕过程中酶解条件对水解
度的影响
Alcalase蛋白酶是一种丝氨酸肽链内切酶，其主要
裂解的化学键为：疏水性氨基酸的羧基，可以使水解切
下肽段的N-末端或C-末端为芳香族氨基酸，即可以使
芳香族氨基酸的残基暴露出来，以保证第二步水解切下
的是芳香族氨基酸。
2.1.1 底物浓度对水解度的影响
从图 1 可以看出，当底物质量浓度在 1 %～5 %
(g/100ml)时随着底物浓度的增加，水解度呈明显增大状
态。但当底物质量浓度大于 5%时，水解度有下降的趋
势。这可能是当底物质量浓度过高时，不利于紫苏粕
中蛋白质与Alcalase蛋白酶的接触，影响水解程度。因
此，选用底物质量浓度为 5 %。
30
25
20
15
10
5
0
10%
7%
5%
3%
1%
水
解
度
(%
)
时间(min)
0 50 100 150 200 250 300
图1 Alcalase蛋白酶在不同底物浓度下的水解进程曲线
Fig.1 Hydrolysis curves of Perilla digested by alcalase at different
substrate concentrations
2009, Vol. 30, No. 20 食品科学 ※工艺技术180
从图 2可以看出，水解液 pH值明显影响 Alcalase
蛋白酶的水解。开始时，Alcalase蛋白酶对底物都具有
较高的水解度。随着 pH 值的升高，水解程度不断的增
加。而当 pH 值达到 8 . 5 后，水解程度趋于平衡状态，
不再升高。从水解程度和减少肽液的盐含量考虑，确
定 Alcalase蛋白酶的最适 pH值为 8.5。
2.1.3 温度对水解度的影响
从图 3可以看出，在试验所选温度范围内，在 40℃
时水解度最低；当温度升高，水解度也随着增加。在
55～65℃之间，水解度变化较缓慢，到 65℃时，有下
降的趋势。这可能与酶蛋白有关，当温度升高至一定
时蛋白质开始发生变性，从而改变酶的活动中心，影
响 Alcalase蛋白酶的活性。因此，试验选定 60℃为最
适温度。
2.1.4 酶添加浓度对水解度的影响
从图 4可以看出，随着酶添加量的增加，Alcalase
蛋白酶水解的速度加快，紫苏蛋白被水解的程度提高。
当酶添加浓度为 1ml/100g底物时，水解进程较慢；当
酶添加浓度为 7～10ml/100g底物时，水解进行的很快，
水解度也较大，但这是以增加酶的添加量为代价的；当
酶添加浓度为 3ml/100g底物和 5ml/100g底物时，尽管水
解不是特别快，但随着反应的不断进行，其水解度提
高较大。从图中可以发现，在 240min时，酶添加浓度
5ml/100g底物的水解度与7%和10%的水解度很接近。从
工业成本考虑，本试验选用酶添加为 5ml/100g底物。
综合考虑上述不同条件下Alcalase蛋白酶水解进程
曲线，确定Alcalase蛋白酶水解的最适条件为底物浓度
5%，pH8.5，温度 60℃，酶添加浓度 5ml/100g底物，
时间 240min。此条件下Alcalase蛋白酶对紫苏粕的水解
度可达 34.8%，水解液中小肽的N-末端或 C-末端主要
为芳香族氨基酸残基。
2.2 木瓜蛋白酶水解
将2.1.4节最适条件酶解得到的水解液作为木瓜蛋白
酶的作用底物进行水解。木瓜蛋白酶兼有内切肽酶和外
切肽酶的活性。据报道[14-17]，在一定条件下木瓜蛋白酶
可切断芳香族氨基酸旁的肽键将芳香族氨基酸从肽链中
释放出来。因此本实验第二步水解选择木瓜蛋白酶作为
释放芳香族氨基酸的酶。木瓜蛋白酶的水解条件选择为
p H 7 . 0、温度 5 5℃、加酶量 1 %、时间 4 h。
2.3 脱除芳香族氨基酸
在芳香族氨基酸的分离纯化方面已有研究[25]，活性
炭对芳香族氨基酸具有较强的选择性吸附特性。利用这
一特点，本实验采用活性炭对 2.2节所得木瓜蛋白酶水
解液脱除芳香族氨基酸。本实验脱除芳香族氨基酸的参
数为 pH4.0，温度 40℃，活性炭用量 7%(m/V)，时间
3 h。
2.4 紫苏肽 F值的测定
按照以上确定的Alcalase蛋白酶、木瓜蛋白酶两步
酶解，活性炭脱除芳香族氨基酸的最佳工艺条件，制
备得到的紫苏高 F值低聚肽产品，采用高效液相测定其
氨基酸组成，结果见表 1。
BCAA=0.01344mol，AAA=0.0001696mol，F=
BCAA/AAA =79.25(以 100g样品计算)。
实验获得的紫苏肽 F值较高为 79.25，这与两次水
解和活性炭选择性吸附是密切相关的。
35
30
25
20
15
10
5
0
pH7.5
pH8
pH8.5
pH9
pH9.5
水
解
度
(%
)
时间(min)
0 50 100 150 200 250 300
图2 Alcalase蛋白酶在不同pH值的水解进程曲线
Fig.2 Hydrolysis curves of Perilla digested by alcalase at different
pH values
35
30
25
20
15
10
5
0
40℃
45℃
55℃
60℃
65℃
水
解
度
(%
)
时间(min)
0 50 100 150 200 250 300
图3 Alcalase蛋白酶在不同温度下的水解进程曲线
Fig.3 Hydrolysis curves of Perilla digested by alcalase at different
temperatures
35
30
25
20
15
10
5
0
水
解
度
(%
)
时间(min)
0 50 100 150 200 250 300
1%
3%
5%
7%
9%
10%
图4 Alcalase蛋白酶在不同酶与底物浓度比下的水解进程曲线
Fig.4 Hydrolysis curves of Perilla digested by alcalase at different
ratios of enzyme to substrate
2.1.2 pH值对水解度的影响
181※工艺技术 食品科学 2009, Vol. 30, No. 20
2.5 分子量的测定
紫苏高 F值低聚肽的平均分子量分布见图 5。
解液中小肽的N-末端或C-末端主要为芳香族氨基酸残基。
3.2 进一步用木瓜蛋白酶水解，然后用活性炭吸附去
除低聚肽中的芳香族氨基酸，得到 F可达 79.25的紫苏
高 F 值低聚肽。
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B.标准品
图5 紫苏肽平均分子量分布图谱
Fig.5 Mass spectra of oligopeptides standard and oligopeptides
sample from Perilla
25
20
15
10
5
0
m
A
U
时间(min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
14
.6
63
13
.1
20
13
.4
67
175
150
125
100
75
50
25
0
m
A
U
时间(min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
A.产品
8.
62
3
11
.3
58 12
.6
26
13
.5
07
13
.1
20
14
.7
64
15
.5
60
由图 5分析可知，紫苏肽的平均分子量在 1000D以
下，主要集中在 200～700D，其中200～400D占58.02%，
400～700D占 21.72%，200D以下有 5.56%。因此，本
实验所得紫苏肽为低聚肽。
3 结 论
3.1 确定了Alcalase蛋白酶水解切下肽段N-末端或C-
末端为芳香族氨基酸的最适条件为底物质量浓度 5%(g/
100ml)、pH8.5、温度 60℃、酶添加浓度 5ml/100g底
物、时间 240min。此条件下的水解度可达 34.8%，水
氨基酸 含量(%) 氨基酸 含量(%)
Aspartic 0.53 Methionine 0.17
Threonine 0.23 Isoleucine☆ 0.18
Serine 0.20 Lecine☆ 0.72
Glutamic 1.78 Tyrosine★ 未测出
Proline 0.51 Phenylalanine★ 0.028
Glycine 0.82 Histidine 0.28
Alanine 1.41 Lysine 0.28
Cystine 0.50 Arginine 0.18
Valine☆ 0.77 F值 79.25
表1 紫苏肽氨基酸组成
Table 1 Amino acid composition of oligopeptides with high
Fisher ratio from Perilla
注：☆.支链氨基酸(BCAA)，★.为芳香族氨基酸(AAA)。