全 文 ：第 29卷第 4期 江 西 农 业 大 学 学 报 Vo.l 29, No. 4
2007年 8月 Acta Ag ricu lturae Unive rsitatis Jiangx iensis Aug. , 2007
文章编号:1000 - 2286(2007)04 - 0690 -05
巴拉圭茶多酚大孔吸附树脂分离工艺及
总多酚 、多酚流分的抑菌作用研究
熊建华1, 2 ,刘仲华 1* ,黄建安 1 ,王克勤 1, 3
　　(1. 湖南农业大学 天然产物研究中心 , 湖南 长沙 410128;2. 江西农业大学 食品科学系 , 江西 南昌 330045;3.
湖南省原子能农业应用研究所 ,湖南 长沙 410125)
摘要:以静态吸附与解吸实验筛选树脂并研究巴拉圭茶多酚的大孔吸附树脂分离工艺及总多酚 、多酚流分的抑
菌作用。结果显示 , HPD500是巴拉圭茶多酚良好的吸附剂 , 以水 、φ=27%、φ=40%、φ=70%的乙醇为解吸剂
的梯度洗脱 ,巴拉圭茶多酚被分离成为极性不同的 3个流分 。巴拉圭茶多酚具有较好的抑菌活性 ,其对沙门氏
菌的抑菌活性强于茶多酚 ,不同极性的流分的抑菌作用弱于总多酚。
关键词:巴拉圭茶;多酚;大孔树脂;抑菌活性
中图分类号:Q946. 82　　文献标识码:A
A Study on Isolation Procedure of Ilex paraguariensis
Polyphenolsw ithMacroporou Resin and Antibacterial
Activities of Total and Fractional Polyphenols
XIONG Jian - hua
1, 2 , LIU Zhong - hua1* , HUANG Jian - an1 ,WANG Ke - qin1, 3
　　(1. Na tura l Products Resea rch C ente r, HAU , Changsha 410128, China;2. Department of Food Sc ience,
JAU , Nanchang 330045, China;3. Hunan Institu te o f A tom ic Energy App lication in Ag ricuhure, Chang sha
410125, China)
　　Abstract:In o rde r to study separation of resin elution test, iso lation p rocedure o f Ilex paraguariensis po ly-
phenolsw ithm acroporou resin and antibacterial ac tiv ities of tota l and frac tiona l po lypheno lsw ere studied. The
resu lts show ed thatHPD500 w as optim al absorben t to iso late Ilex paraguariensis po lypheno ls. Three fractions
w ith diffe rent po larity from IP po lypheno lsw ere obta ined after grad ient e lu tion w ith aqueous a lcoho.l Ilex para-
guariensis polyphenols showed considerab le antibacterial effects and w eremo re effective against solmonella pa-
ratyhpi than tea ploypheno ls. The antibacterial activity of the fractions w ere w eake r than that of tota l ployphe-
nols.
Key words:Ilex paraguariensis;po lypheno ls;macroporou resin;antibacterial activities
巴拉圭茶(Ilex paraguarensis)属冬青科冬青属 ,原产于南美 ,是热带或亚热带多年生常绿灌木。其
干叶和嫩茎可加工制成碎茶。巴拉圭茶具有较好的清除自由基 、治疗炎症 、消化不良 、肥胖 、癌症等药理
收稿日期:2007 - 04 - 17　　修回日期:2007 - 06 -04
基金项目:国家科技部科技型中小企业技术创新基金((2001)010418)
作者简介:熊建华(1969 - ), 女 ,博士生 , 副教授 , 主要从事植物功能成分化学研究 , E -m a il:x jhx jh69@163. com;*
通讯作者:刘仲华 ,教授 , 博导。
DOI牶牨牥牣牨牫牳牫牰牤j牣j jau牣牪牥牥牱牨牬牨
第 4期 熊建华等:巴拉圭茶多酚大孔吸附树脂分离工艺及总多酚 、多酚流分的抑菌作用研究
作用 [ 1 ～ 5] ,在许多国家与地区都受到关注 。中华人民共和国卫生部公告 (2004年第 6号)也已将巴拉圭茶
净油或提取物列入食品用香料名单。多酚是巴拉圭茶的主要药用成分 ,含量丰富 。研究表明[ 6, 7]巴拉圭茶
的多酚成分主要是绿原酸类物质 ,包括绿原酸 、咖啡酸 、异绿原酸 A、异绿原酸 B、异绿原酸 C ,以及少量的
槲皮素 、芦丁 、三奈酚等类黄酮类物质。笔者研究大孔吸附树脂柱层析初步分离巴拉圭茶多酚的工艺 ,并
对总多酚及不同极性洗脱产物的抑菌活性进行探讨 ,以期为深入了解和利用巴拉圭茶提供依据。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　原料　巴拉圭茶 (从阿根廷进口),绿原酸标准品 (中国药品生物制品检定所提供),茶多酚 TP
(湖南金农生物资源股份有限公司 ,产品纯度 80%),硫酸庆大霉素 (华北制药厂 , 8万单位 /2 mL)。树
脂材料分别为:HPD500(沧州宝恩 ), D101(天津农药), HP - 20(日本三菱), X - 5、AB - 8、S - 8、NKA、
NKA -9(南开大学化工厂)。
1. 1. 2　供试菌株　大肠杆菌 C8309(E scherich ia coli)、链球菌 C55605(Streptococcus sp. )、沙门氏菌 C79
- 74(Solmonella paratyhpi),购自中国兽药监测所 。
1. 1. 3　培养基　牛肉膏蛋白胨培养基 。
1. 2　仪器
LC - 10ATVP高效液相色谱仪 (日本岛津公司 );BS -30自动部份收集器 (上海青浦户西仪器厂);98
- I-C型电子调温电热套 (天津市泰斯特仪器有限公司);R - 200型旋转蒸发仪 (瑞士 BüCH I公司 );
SHZ -95型循环水式多用真空泵 (河南予华仪器厂);A ir Tech无菌操作台 (苏净集团泰安公司 );DNP -
9162恒温培养箱 (上海精密实验设备有限公司 )。
1. 3　巴拉圭茶总多酚 (TIPP)的制备[ 8]
取巴拉圭茶 2 kg,用 φ=70%乙醇 ,以 10倍料液比 ,在 80 ℃下回流提取 60 m in,减压浓缩回收乙
醇 ,得到浸膏 。用水将浸膏溶解 ,分别用石油醚 、氯仿萃取去除叶绿素 、脂溶性成分及咖啡碱 ,再用乙酸
乙酯对其纯化 ,得到巴拉圭茶总多酚 ,采用 HPLC检测其多酚组成 。
1. 4　大孔吸附树脂初步分离巴拉圭茶总多酚
1. 4. 1　大孔树脂的筛选研究[ 9, 10] 　准确称取预处理好的湿树脂 2 g,装入 150 mL的磨口三角瓶中 ,精
密加入一定量稀释的巴拉圭茶多酚(T IPP)作为吸附原液 ,盖紧瓶塞 ,在(25±0. 5)℃的恒温水浴振荡器
上振摇 24 h,充分吸附后 ,过滤 ,再向树脂中精密加入一定体积 φ=95%的乙醇溶液 ,置恒温水浴振荡器
上振荡 24 h解析多酚。分别测定树脂吸附前后和乙醇解吸后溶液巴拉圭茶多酚的浓度 ,按下式计算吸
附量 Q、吸附率 E及解吸率 F。综合树脂对巴拉圭茶总多酚的吸附与解吸性能选取分离树脂 。
Q =(C0 -Ce)×V0 W/ (1)
E =(C 0 -Ce) /C0 ×100 (2)
F =C1 ×V1 /(C 0 -Ce)×V0 ×100 (3)
式中:C0表示原液中巴拉圭茶多酚浓度(mg /mL);Ce表示吸附液巴拉圭茶多酚浓度(mg /mL);C1
表示解吸液中巴拉圭茶多酚浓度 (mg /mL);V0表示吸附原液的体积 (mL);W表示树脂重 (g);V1表示
解吸液体积 (mL)。
1. 4. 2　柱洗脱条件选择　柱床体积 0. 3 L(2. 5 cm ×60 cm), 3 g总多酚用 φ=20%酒精最大浓度溶解
上样 ,以水 -乙醇梯度洗脱 ,流速为 1 BV /h,每个梯度洗脱 5 BV。分步收集 ,合并同一梯度洗脱液 ,真
空浓缩 ,冷冻干燥 ,成分检测。改变洗脱条件 ,确定最佳的乙醇洗脱梯度 、最大上样量 、最佳流速 ,并进行
工艺验证实验。总多酚 T IPP经初步分离后可得 3个极性不同的多酚流分 (TIPPA 、T IPPB、TIPPC)。
1. 5　巴拉圭茶多酚的高效液相测定方法
色谱条件:K romasil C18柱(200 mm ×4. 6 mm id, 5 μm)色谱柱;流动相 A:乙腈 ,流动相 B:1%(体
积比)醋酸水溶液;采用梯度洗脱:0. 0. 1 m in A /B(10 /90,体积比 ), 15 m in A /B (15 /85), 25 m in A /B
(20 /80) , 43 m inA /B (20 /80), 45 m in A /B(35 /65), 58 m inA /B(35 /65), 60m inA /B (10 /90);流速:
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　江 西 农 业 大 学 学 报 第 29卷
图 1　总多酚的高效液相色谱图
F ig. 1　H PLC spec trum o f to tal po lyphonic in Ilex paraguarensis
表 1　巴拉圭茶多酚的吸附解吸特性
Tab. 1　The adsorp tion and desorp tion of po lyphenols
from Ilex paraguarensis
树脂型号 极性 吸附量
/mg g- 1
吸附率
/%
解吸率
/%
X - 5 非极性 24. 3 57. 6 75. 3
D101 非极性 20. 9 53. 4 72. 6
NKA 非极性 25. 0 60. 1 80. 3
AB - 8 弱极性 25. 1 59. 5 93. 7
HP -20 弱极性 28. 5 67. 2 82. 6
H PD500 极性 35. 2 74. 2 90
S -8 极性 37. 5 78. 7 47. 5
NKA - 9 极性 29. 7 68. 7 83. 4
0. 9mL /m in;检测波长:325 nm;柱温:40 ℃。
1. 6　体外抑菌试验[ 10, 11]
1. 6. 1　菌液制备　所用菌株使用前将菌种先接种平板 ,于 37 ℃培养 24 h后 ,挑选典型菌落接种于液
体培养基中 ,再于 37 ℃培养 18 h后 ,通过细菌总数测定 ,将菌液稀释至 105 ～ 106个菌 /mL备用 。
1. 6. 2　抑菌效果的测定　含药物纸片制备:将多酚各分离流分 (TIPPA、TIPPB、TIPPC)、巴拉圭茶总多
酚 (TIPP)配成多酚质量浓度为 30 mg /mL的溶液 ,过滤除菌备用。每张纸片 (直径 6mm)加药物样品
溶液 5 μL,空白对照为生理盐水 ,阳性对照是 400单位 /mL的硫酸庆大霉素(GS)和 30mg /mL的茶多
酚 (TP)。
采用 K -B纸片法进行:将固体培养基加热后倒入平皿内 ,每个平皿约 20mL。待培养基凝固后 ,
用灭菌吸管吸取菌悬液 0. 1 mL注入平皿内 ,再用灭菌的涂布棒迅速将菌液涂抹均匀 ,制成含菌平板。
用无菌镊子将浸透药品的滤纸片放在含菌平板上 ,每种样品 3次重复 。把处理过的培养皿放到 37℃培
养箱中培养 24 h,用游标卡尺测定抑菌圈直径的大小 ,并以此判断不同样品对供试菌的抑制效果。
2　结果与分析
2. 1　巴拉圭茶总多酚的组成
巴拉圭茶总多酚经高效液相色谱仪检测 ,其色谱图如图 1所示 。从图 1可以看出 ,巴拉圭茶中多酚
种类较丰富 ,极性差
异较大 。
2. 2　分离树脂的筛
选
选择不同厂家 、
不同性能的 8种大孔
树脂 ,进行静态吸附
筛选试验。将所选的
树脂用含多酚 1 mg /
mL的 φ=10%乙醇
溶液 50 mL浸泡 ,树
脂吸附 24 h后测定其吸附率 ,乙醇解吸 24 h后测定其解吸率 ,树脂对巴拉圭茶多酚的吸附和解吸特性
见表 1。由表 1可知 , S - 8树脂对巴拉圭茶多酚具有最好的吸附性能 ,吸附率达 78. 7%,但其解吸率在
所有树脂中又是最低的 ,因此不
符合筛选要求。综合考虑树脂的
吸附和解吸性能 , HPD500是较
为理想的树脂 ,可用来对巴拉圭
茶多酚进行分离 , NKA - 9、AB -
8对巴拉圭茶多酚也具有一定的
吸附与解吸性能 。
2. 3　巴拉圭茶多酚柱层析洗脱
条件的优化
2. 3. 1　最佳乙醇洗脱梯度的选
择 　将 2. 2 中选用 的树 脂
HPD500处理好 , 装入柱床体积
(0. 3 L, 2. 5 cm ×60 cm)的层析
柱中 ,总多酚 3 g用 φ=20%乙
醇溶解慢慢加入层析柱顶端 ,充分吸附 ,依次用水 、φ=20%、φ=50%、φ=80%的乙醇 5 BV 、流速为
1 BV /h梯度洗脱 。总多酚分离效果不好 ,水洗部分不含有多酚 ,说明水不能将多酚成分洗下 ,将其浓缩
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第 4期 熊建华等:巴拉圭茶多酚大孔吸附树脂分离工艺及总多酚 、多酚流分的抑菌作用研究
冻干 ,干粉呈淡灰色 ,在空气中易吸潮 ,与蒽酮试剂反应呈绿色 ,与费林试剂反应呈现红色沉淀 ,说明含
有糖类物质 ,因此在下一次试验中 ,必须用水洗脱以去除杂质。 φ=20%乙醇洗脱物未将 HPLC检测中
15 m in以前出峰的物质全部洗脱 ,在下一个洗脱梯度中还有较多残留 ,说明此浓度的乙醇洗脱能力不
够 ,必须加大乙醇的含量。 φ=50%乙醇洗脱物与相邻梯度乙醇洗脱物的成分重叠严重 ,说明此梯度的
乙醇洗脱能力太大 ,有必要降低乙醇的浓度。因此 ,在上一次实验的基础上改变乙醇的洗脱梯度 ,第 2
次选用水 、φ=27%、φ=40%、φ=70%的乙醇各 5 BV对上柱样品进行梯度洗脱 。分离效果见图 2 ～图
5, φ=27%乙醇洗脱的物质 (TIPPA)极性较大 ,是高效液相检测中 15 m in前出峰的物质 , φ=40%的乙
醇洗下中等极性的物质(TIPPB), φ=70%的乙醇洗下极性较小的物质 (TIPPC)。各流分主要成分没有
重叠 ,具有很好的代表性 ,可作为巴拉圭茶性质不同总多酚流分的代表进行活性研究并利于多酚化合物
的进一步分离。
图 2　水洗部分 图 3　φ=27%乙醇洗脱部分
F ig. 2　W ater fraction F ig. 3　φ=27% E thano l frac tion
图 4　φ=40%乙醇洗脱部分 图 5　φ=70%乙醇洗脱部分
F ig. 4　φ=40% Ethano l frac tion F ig. 5　φ=70% E thano l frac tion
2. 3. 2　最佳上样量的选择　以上述的梯度乙醇作为洗脱剂 ,其余条件不变 ,上样量分别选用 3 g、6 g、
9 g、12 g、15 g进行梯度洗脱分离 ,其中前 3种上样量分离度好。上样量为 12 g时 ,各梯度之间分离效
果不好 ,有交叉拖尾现象;上样量为 15 g时 ,交叉现象严重 ,无法进行样品流分的分离 ,所以最佳上样量
为 9 g /(300 mL)HPD500树脂 。
2. 3. 3　最佳流速的选择　此次试验分别选择了 0. 5 BV /h、1 BV /h、1. 5 BV /h、2. 0 BV /h 4种流速进行
最佳流速的选择 ,结果发现前 3种流速能很好的分离 TIPP,但前 2种流速分离时间较长 ,不利于实验进
程及以后的放大实验;而 2. 0 BV /h的流速不能对 TIPP进行有效的分离 ,所以 1. 5 BV /h的流速是最佳
的洗脱流速 。
2. 3. 4　工艺验证实验　按前述选择的条件进行放大验证实验 , 1 L(5 cm ×60 cm)的层析柱 , 上样
30 g,梯度洗脱 ,结果各流分得到很好的分离 ,最终回收样品 22. 55 g,回收率 75. 17%,各洗脱流分样品
量分别为:TIPPA 4. 17 g、TIPPB 3. 47 g、TIPPC 13. 91 g。
2. 4　巴拉圭茶多酚的抑菌试验结果
采用纸片法检测巴拉圭茶多酚的抑菌效果 ,结果如表 2。巴拉圭茶总多酚 (TIPP)、多酚各分离流分
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　江 西 农 业 大 学 学 报 第 29卷
(TIPPA、TIPPB、TIPPC)和茶多酚(TP)对 3种菌均有一定的抑菌效果 ,其中巴拉圭茶总多酚 、流分 TIP-
PA、流分 TIPPB、流分 TIPPC对大肠杆菌的抑菌作用弱于茶多酚(P <0. 01);巴拉圭茶总多酚 、流分 TIP-
PA、流分 T IPPB、流分 TIPPC对沙门氏菌的抑菌直径强于茶多酚 (P <0. 01);巴拉圭茶多酚试验组对链
球菌的抑菌作用弱于茶多酚 (P <0. 05);巴拉圭茶多酚的所有试验组对大肠杆菌 、沙门氏菌 、链球菌的
抑菌效果弱于庆大霉素(P <0. 01)。通过比较巴拉圭茶 3个柱分离流分对细菌的抑菌作用发现 , 3个流
分对不同的细菌具有不同的抑制作用 ,对大肠杆菌抑菌作用最好的是 TIPPC ,对沙门氏菌抑菌作用最好
的是 TIPPB ,对链球菌抑菌作用最好的是 TIPPA。但总多酚对 3种细菌均表现出较好的抑菌作用 ,因此
仅对抑制大肠杆菌 、沙门氏菌和链球菌而言 ,总多酚的效果较好 ,不需要做进一步的分离。
表 2　巴拉圭茶多酚的抑菌效果
Tab. 2　Antibacterial effec t of polyphenols from Ilex paraguarensis
菌种
抑菌圈直径( X ±SD) /mm
TIPP T IPPA TIPPB TIPPC TP
阳性
(庆大霉素)
空白
(生理盐水)
大肠杆菌 20. 03±0. 85 18. 23±0. 55 18. 72±0. 67 19. 88±0. 68 22. 19±0. 43 24. 82±0. 32 0
沙门氏菌 21. 56±0. 76 20. 33±0. 43 21. 67±0. 54 20. 89±0. 55 17. 12±0. 47 22. 66±0. 24 0
链球菌 16. 38±0. 73 16. 52±0. 42 15. 72±0. 47 15. 33±0. 32 18. 36±0. 52 23. 67±0. 37 0
3　小　结
(1)通过考察 8种大孔吸附树脂对巴拉圭茶多酚的吸附与解吸性能 ,筛选了 1种适合初步分离巴
拉圭茶多酚的大孔吸附树脂 HPD500,树脂的吸附容量可达 35. 2 mg /g。建立了大孔吸附树脂柱层析初
步分离巴拉圭茶多酚的方法 ,经以乙醇溶液为解吸剂的梯度洗脱 ,巴拉圭茶多酚 (TIPP)被分离成为
TIPPA、TIPPB、TIPPC 3个流分 ,样品回收率为 75. 17%。
(2)巴拉圭茶多酚具有较好的抗菌作用 ,其对沙门氏菌的抑菌作用强于茶多酚 。各流分对不同的
细菌具有不同的抑菌效果 ,但总多酚对 3种细菌均具有较好的抑菌作用 。因此仅对抑制大肠杆菌 、沙门
氏菌和链球菌而言 ,巴拉圭茶多酚的进一步分离没有太大价值。
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