全 文 :江西农业学报 2012,24(2) :31 ~ 34
Acta Agriculturae Jiangxi
海南本地槟榔小孢子发生及雄配子体形成研究
刘 蕊1,2,黄丽云1,2,李和帅1,2,沈 雁1,2,范海阔1,2*
收稿日期:2011 -11 -29
基金项目:农业部热带作物种质资源保护项目“热带棕榈种质资源收集保存及种质圃维护”(09RZZY -04)。
作者简介:刘蕊(1979─) ,女,河北人,助理研究员,博士,主要从事棕榈植物资源收集与育种研究。
(1.中国热带农业科学院 椰子研究所,海南 文昌 571339;2.海南省热带油料作物生物学重点实验室,海南 文昌 571339)
摘 要:采用常规压片法,对海南本地槟榔(Areca cathecu Linnaeus)小孢子减数分裂和雄配子体发育过程进行了研究,并
将其不同发育阶段与花、花序的外部形态特征相联系,结果显示:海南本地槟榔小孢子母细胞减数分裂的胞质分裂属于同时
型,小孢子排列呈四面体状,成熟花粉粒为 2 -细胞型;花序外部形态与内部结构具有一定的对应关系。
关键词:海南;槟榔;小孢子;雄配子体;发育
中图分类号:Q944. 4 文献标识码:A 文章编号:1001 -8581(2012)02 -0031 -04
Study on Microsporogenesis and Male Gametophyte Development
of Local Areca cathecu in Hainan
LIU Rui1,2,HUANG Li - yun1,2,LI He - shuai1,2,SHEN Yan1,2,FAN Hai - kuo1,2*
(1. Coconut Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Science,Wenchang 571339,China;
2. Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology,Wenchang 571339,China)
Abstract:The microspore meiosis and male gametophyte development of local Areca cathecu Linnaeus in Hainan were studied
with conventional squash method,and the correlation between the developmental stage of microspore and the external morphological
characteristics of the inflorescence was analyzed. The results showed that the cytokinesis of microspore mother cells during meiosis be-
longed to simultaneous type,the microspores were almost tetrahedral - type ones,and the mature pollen grains were 2 - cell type.
There was a certain corresponding relationship between the external shape and internal structure of inflorescence.
Key words:Hainan;Areca cathecu;Microspore;Male gametophyte;Development
槟榔(Areca cathecu Linnaeus)是棕榈科(Arecaceae)
槟榔属(Areca)常绿乔木,是典型的热带药用植物,广泛
分布于印度、印度尼西亚、斯里兰卡、菲律宾等南亚、东南
亚国家[1]。我国台湾、云南、福建、广东、广西等省区均有
种植,但大部分分布在海南的东部、中部和南部山区一
带。槟榔果实含脂肪、槟榔油、生物碱等[2 -4],具有重要
的药用价值,居我国四大南药之首。目前对槟榔的研究
主要集中在育种[5 -6]、药物成分[7 -8]、毒理作用[9 -11]等方
面,而在细胞学方面的研究则较少,尤其是对海南本地槟
榔的生殖细胞学研究鲜见报道。
本文探讨了海南本地槟榔的小孢子发生和雄配子
体发育,与花序外部特征相联系,为深入研究海南本地槟
榔的栽培和生殖细胞学提供理论基础,并为槟榔花药组
织培养和槟榔种质鉴定提供细胞学依据。
1 材料与方法
1. 1 供试材料 试验材料取自海南文昌的中国热带农
业科学院椰子研究所槟榔园,采集时间为 2010 年 3 月。
分别采集槟榔不同发育阶段的未开放花苞 6个和已开放
的花序 1个,并将其依次编号为 1 ~7。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 雄花结构的观察 对采集的花苞和花序进行外
部形态观察和记录,剥取雄花,在 Leica S8APO体视镜下
观察,并用 DFC420对其拍照,其余雄花用卡诺固定液固
定,24 h后转入 FAA固定液中保存。
1. 2. 2 小孢子发生的观察 参照董志渊等[12]的方法,
略作调整。将固定的雄花用自来水冲洗 2 遍,于解剖镜
下取出花药,用解剖刀切割并挤出内部细胞,用改良苯酚
品红染液染色,在 Leica DM2500 型光学显微镜下观察,
并用 DFC490拍照,进行减数分裂细胞学观察。
1. 2. 3 雄配子体发育的观察 参考董志渊等[12]的方
法,并略作调整。将固定的雄花用自来水冲洗 2 次,经
4%硫酸铁铵染色 4 h 后,用蒸馏水冲洗 2 h。然后用
0. 5%的苏木精染色,经蒸馏水冲洗后在解剖镜下取出花
药,用解剖刀切割并挤出内部细胞,经 45%冰乙酸或水
压片后,用 Leica S8APO体视镜、Leica DM2500 型光学显
微镜对雄配子发育进行细胞学观察。
2 结果与分析
2. 1 海南本地槟榔雄花的外部结构 槟榔花为单性花,
雌雄同株,腋生。花序为肉穗花序,外部包被佛焰苞(图
1 -1、图 1 - 2) ;雌花着生于花序基部,雄花着生在花序
顶端(图 1 -3) ;雄花具有 3片花瓣,6枚雄蕊,离生,中间
有 3枚退化的雌蕊(图 1 -4、图 1 -5)。
2. 2 海南本地槟榔小孢子的发生过程 大部分成熟的
海南本地槟榔小孢子母细胞体积较大(图 2 -1) ,细胞多
近圆形。细胞核大且位于细胞中央,着色深;核仁大而明
显,无明显液泡;减数分裂开始之前,小孢子母细胞外逐
渐积累胼胝质,其减数分裂过程如下。
1.槟榔花苞远轴面(背面) ;2.槟榔花苞近轴面(腹面) ;3.槟榔花序;
4.槟榔雄花解剖,Leica DFC 490,2 ×,0. 5 × adapter;
5.槟榔雄花花药和退化雌蕊,Leica DFC 490,2 ×,0. 5 × adapter
图 1 海南本地槟榔雄花的外部结构
前期Ⅰ:细线期细胞核膜开始变得不清晰,仅见大概
轮廓,核仁大而明显,染色体开始凝集,变得细长,充满整
个细胞核(图 2 - 2) ;偶线期同源染色体开始联会,表现
为核内细丝结构减少,染色体部分区域出现双线结构
(图 2 -3) ;粗线期染色体继续缩短变粗,四联体更为清
晰,同时发生染色单体交叉(图 2 - 4) ;双线期由于发生
交叉的染色单体分开,染色体呈现出“X、V、8、0”等形状
(图 2 - 5) ;终变期细胞核膜、核仁消失,染色体凝缩变
短,由于二价染色体的形成,染色体数目看上去似乎减半
(图 2 -6)。
中期Ⅰ:同源染色体整齐地排列在细胞中间的赤道面
上,细胞质中出现明显的纺锤体结构(图 2 -7)。
后期Ⅰ:同源染色体在纺锤体的牵引下,开始向细胞
的两极移动,后期结束时,两组同源染色体分别位于细胞
的两极,染色体数目的减半由此产生(图 2 -8、图 2 -9)。
末期Ⅰ:达到细胞两极的染色体解螺旋,重新出现核
膜、核仁,但是细胞质并不进行分裂,所以形成含有 2 个
子核的细胞(图 2 -10、图 2 -11)。
前期Ⅱ:2个子核的染色体逐渐变得粗短,核膜、核仁
消失(图 2 -12)。
中期Ⅱ:每个子核的染色体都排列在赤道面上,2 套
染色体的排列方式有多种,主要以平行排列和垂直型
(异面)排列为主,此外有少量“8”字型排列(图2 -13、图
2 -14、图 2 -15)。
后期Ⅱ:每条染色体的染色单体在纺锤丝牵引下彼
此分开,移向两极,形成 4组染色单体,排列方式有 2 种,
分别对应中期染色体的平行排列和垂直排列(图 2 - 16、
图 2 -17、图 2 -18)。
末期Ⅱ:核膜出现,染色体解螺旋,形成 4 个子核,子
核排列方式有 2种,分别对应中期染色体的平行排列和
垂直排列(图 2 -19、图 2 -20)。
四分体:4个子核形成后,胞质进行分裂,形成四分
体小孢子,四分体主要是四面体型(图 2 -21、图 2 -22) ,
也有少数呈等双面型(图 2 -23)。
海南本地槟榔的胞质分裂类型为同时型,减数分裂
第一次分裂后不形成细胞壁,在第二次分裂完成后在 4
个核之间产生壁,形成四分体。
在减数分裂过程中,可以见到类似核穿壁的现象
(图 2 -24) ,发生在两个处于前期Ⅱ的细胞之间。
2. 3 海南本地槟榔雄配子体的发育过程 在四分体后
期,胼胝体破裂,释放出小孢子,开始雄配子体的发育。
海南本地槟榔的雄配子体发育过程如下。
单核居中期:刚释放出来的小孢子具有明显的细胞
核和核仁,细胞核位于细胞中央,没有明显的液泡(图 3
-1)。
单核靠边期:随着液泡的出现,细胞质和细胞核逐
渐偏向细胞一侧(图 3 -2)。
双核期:单核花粉进行 1次有丝分裂,产生 2个细胞
核,分别为营养核和生殖核。在双核初期,随着胞质进行
不等分裂,形成大小 2个细胞,其中贴近花粉壁的为生殖
细胞,较大细胞为营养细胞(图 3 -3) ,随后,生殖细胞逐
渐脱离花药壁,游离在营养细胞中(图 3 -4)。
成熟花粉粒:生殖细胞渐渐伸长,变为梭形,小孢子
发育成为成熟的花粉粒(图 3 - 5)。成熟花粉粒为近圆
形,为单沟花粉粒,表面具有网状花纹(图 3 - 6)。海南
本地槟榔成熟花粉中具有 1 个营养细胞、1 个生殖细胞,
其雄配子体为 2 -细胞型。
2. 4 花序及花的外部形态与小孢子和雄配子体发育的
关系 试验发现,海南本地槟榔雄花内部结构的发育与
外部形态存在一定的关系,根据雄花内部结构的发育程
度,结合花序的采集位置和其他相关数据,材料的发育阶
段由早至晚的编号依次为 1、2、3、4、5、6、7(表 1)。
对于槟榔花序的发育而言,包裹在内层叶片的花序
发育比包裹在外层叶片的早,在本试验的供试材料中,包
裹在第 2片叶内的花序,其雄花尚未进入减数分裂阶段;
包裹在第 1片叶内的花序,其雄花均可见到减数分裂时
期的花粉母细胞;而无叶片包裹的材料大部分已经进入
小孢子双核期。随着花序发育,花苞的颜色呈现白色、黄
绿色、绿色的变化趋势,花序背面颜色深于腹面,这与其
23 江 西 农 业 学 报 24 卷
接受光照的程度相关。雄花、雌花的颜色变化趋势与花
苞相同,花序表面的颜色深于内部。雄花、雌花长,小穗
轴直径也随花序发育呈现增长趋势。
1.小孢子母细胞,40 ×;2.细线期,100 ×;3.偶线期,40 ×;4.粗线期,40 ×;5.双线期,40 ×;6.终变期,100 ×;7.中期Ⅰ100 ×;8 ~ 9.后期Ⅰ,100
×;10 ~11.末期Ⅰ,100 ×;12.前期Ⅱ,100 ×;13 ~15.中期Ⅱ,100 ×;13.平行型;14.八字型;15.异面垂直型;16,18.后期Ⅱ,100 ×;17.后期Ⅱ,40 ×;
19.末期Ⅱ,40 ×;20.末期Ⅱ,100 ×;21.四分体(体视镜下) ,8 ×;22.四分体(四面体型) ,100 ×;23.四分体(等双面型) ,100 ×;24.核穿壁,100 ×。
1 ~20,22 ~24:DFC420,0. 55 × adapter;21:DFC490,0. 5 × adapter
图 2 海南本地槟榔小孢子的发生过程
1.单核居中期,40 ×;2.单核靠边期,40 ×;3.双核初期,100 ×;4.
双核期,100 ×;5.成熟花粉粒,100 ×;6.花粉粒外形 40 ×。1 ~ 6:Lei-
ca DFC 420,0. 55 × adapter
图 3 海南本地槟榔雄配子体的发育过程
3 讨论
一般来说,胞质分裂连续型存在大多数的单子叶植
物中,同时型常出现在双子叶植物中。被子植物成熟的
花粉可分为 2 -细胞型、3 -细胞型或者两者兼有,胡适
宜认为这 2种类型通常是整个属或整个科的特征,这在
植物的分类学上具有重要的参考价值[13]。一般认为,所
有系统发育原始的植物都是 2 -细胞型花粉[14]。而本试
验发现,海南本地槟榔属于单子叶植物,但胞质分裂属于
同时型,与大部分双子叶植物类似。海南本地槟榔的成
熟花粉为 2 -细胞型,具有原始的性状,说明槟榔所属棕
榈科的进化地位原始,这与已有报道的结果一致[15]。
试验观察到槟榔小孢子减数分裂前期核Ⅱ存在核穿
壁现象。据报道,核穿壁现象多发生在表皮组织或花粉
母细胞组织中,被认为是一种正常的生理现象[16]。穿壁
现象在许多植物中存在[17],但在槟榔中尚未见类似报
道,仍需深入研究。
单倍体育种是一种快速选育作物品种的新途径,而
单倍体育种主要是通过花药培养的途径进行。在花药培
养时,花粉发育时期对单倍体诱导具有重要影响,选择适
宜的小孢子发育时期是单倍体育种取得成功的重要因素
之一[18]。对于许多植物花药培养而言,花药培养的最适
宜时期是单核期[19 -22]。本研究结果表明,花药培养应选
择的花序特征为:花苞背面呈绿色和浅绿色,腹面黄白
色,边缘绿色;雄花嫩黄色;雌花尖端浅绿色。此时期的
332 期 刘蕊等:海南本地槟榔小孢子发生及雄配子体形成研究
雄花处于单核期,用于花药培养可能提高组培成功率。
表 1 海南本地槟榔雄花不同发育时期外部形态及内部结构特征
材料
编号
花序位置 花苞颜色
雄花
颜色
雌花颜色
雄花长
/mm
雌花长
/mm
小穗轴直
径 /mm 发育时期
1 第 2片叶包裹 背面上段浅绿色,中段嫩黄
色,下段白色;腹面上段嫩黄
色,中、下段白色
白色 雌花尚不明显,大
小类似雄花,白色
2. 85 0 1. 45 未进入减数分裂期
2 第 2片叶包裹 白色 白色 白色 2. 45 6. 94 1. 75 未进入减数分裂期
3 第 1片叶包裹 背面上、中段绿色,下段浅绿
色;腹面嫩黄色,边缘绿色
嫩黄色 整体白色,尖端浅
绿色
4. 08 9. 44 2. 26 母细胞、减数分裂旺盛
期、四分体、单核居中期
4 第 1片叶包裹 背面上、中段绿色,下段浅绿
色;腹面嫩黄色,上部边缘
绿色
嫩黄色 尖端翠绿色,其余
部分嫩黄色,表面
花颜色深,内部浅
4. 48 11. 03 2. 07 母细胞、减数分裂末期
Ⅰ、四分体、单核居中期
5 第 1片叶包裹 背面绿色,腹面嫩黄色 黄绿色 上部翠绿色,中、
下部嫩黄色
4. 2 10. 95 2. 4 减数分裂末期Ⅰ、末期Ⅱ、
母细胞、四分体
6 无叶包裹 背面黄绿色,有斑点;腹面黄
绿色
表 面 绿
色,内部
黄色
表面上段绿色,下
段黄色;内部黄色
4. 42 14. 26 2. 39 单核靠边期、双核期
(生殖细胞贴壁)
7 无叶包裹,部
分花开放
花苞已脱落 鲜黄色、
绿色
绿色 4. 59 16. 93 2. 53 双核期(生殖细胞游
离)、成熟花粉粒
参考文献:
[1]张春江,吕飞杰,陶海腾.槟榔活性成分及其功能作用的研究
进展[J].中国食物与营养,2008(6) :50 -53.
[2]周文化,李忠海,张海德,等.不同槟榔果常规营养成分和槟榔
碱含量分析[J].食品与机械,2009,25(3) :27 -30.
[3]黄玉林,张海德,谯莲. 槟榔油的提取工艺[J]. 中国油脂,
2008,33(8) :21 -23.
[4]杜道林,王小英,甘炳春,等.不同品种槟榔果实性状及其槟榔
碱含量的比较研究[J].广西植物,2004,24(5) :432 -436.
[5]杜道林,甘炳春,王有生,等.槟榔种质初步评价研究[J].中国
种业,2005(7) :37 -38.
[6]晏小霞,王祝年,王建荣.槟榔种质资源研究概况[J].中国热
带农业,2008(5) :34 -36.
[7]张兴,梅文莉,曾艳波,等.槟榔果实的酚类化学成分与抗菌活
性的初步研究[J]. 热带亚热带植物学报,2009,17(1) :74
-76.
[8]申秀丽,段亮亮.槟榔的化学成分及药理研究进展[J].宜春学
院学报,2009,31(2) :95 -97.
[9]Wu G H,Boucher B J,Chiu Y H,et al. Impact of chewing betel -
nut (Areca catechu)on liver cirrhosis and hepatocellular carcino-
ma:a population - based study from an area with a high preva-
lence of hepatitis B and C infections[J]. Public Health Nutrition,
2009,12(1) :129 -135.
[10]Lu Ssu - Yi,Chang Kuo -Wei,Liu Chung - Ji,et al. Ripe areca
nut extract induces G1 phase arrests and senescence - associated
phenotypes in normal human oral keratinocyte[J]. Carcinogene-
sis,2006,27(6) :1273 -1284.
[11]蔺琳.槟榔碱在口腔黏膜纤维性变及癌变发病机制中的作用
[J].临床口腔医学杂志,2006,22(2) :124 -126.
[12]董志渊,郭华春.小花盾叶薯蓣减数分裂与雄配子发育细胞
学观察[J].热带亚热带植物学报,2009,17(1) :24 -28.
[13]胡适宜.被子植物胚胎学[M].北京:高等教育出版社,1982:
20 -37.
[14]Brewbaker J K. The distribution and phylogenetic significance of
binucleate and trimucleate pollen grains in the Angiosperms[J].
Amer J Bot,1967,54:1069 -1083.
[15]覃伟权,范海阔.槟榔[M].北京:中国农业大学出版社,2010:
16.
[16]吴素萱. 关于植物细胞核的穿壁现象问题[J]. 植物学报,
1955,4(4) :233 -243.
[17]张伟成.高等植物中原生质细胞间运动研究的进展[J].植物
学报,2002,44(9) :1068 -1074.
[18]沈海龙.植物组织培养[M].北京:中国林业出版社,2005.
[19]谢森,秦丽颖,潘俊松,等.黄瓜花器形态发生、小孢子发育与
花药培养[J].西北植物学报,2005,25(6) :1096 -1100.
[20]刘仁祥,黄莺. 烟草花粉植株染色体倍性的早期快速鉴定
[J].贵州农业科学,1998,26(6) :4 -7.
[21]吴旺泽,彭晓莉,王蒂,等.马铃薯花粉离体培养影响因子分
析[J].甘肃农业大学学报,2009,44(5) :40 -43,49.
[22]赵建平,姚祥坦.花粉发育时期与取样时期对白菜小孢子胚
诱导的影响[J].中国园艺文摘,2008,24(6) :56 -58.
43 江 西 农 业 学 报 24 卷