全 文 ：浙江中医药大学学报 2012年 10月第 36卷第 10期
红腺忍冬叶抗氧化作用的实验研究
朱英 李键
浙江中医药大学药学院 杭州 310053
摘要：[目的]研究红腺忍冬叶的抗氧化作用，为红腺忍冬叶的开发利用奠定一定的实验依据。[方法]对红腺忍冬叶不同溶剂提取物进行体内外抗氧化
实验研究：（1）以 Vc、二丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene, BHT）为对照品，通过 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhy drazyl,
DPPH）法和铁离子还原法考察样品的体外抗氧化活性。（2）以 Vc为阳性对照，由D-半乳糖至衰的小鼠为模型，通过测定血清、肝脏组织中超氧化物
歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘过氧化酶（glutathione peroxidase, GSH-PX）活性和丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量，考察样品的体内
抗氧化活性。[结果]（1）在 0.5～5mg·mL-1范围内，水提液、50%乙醇提取液和 95%乙醇提取液对 DPPH自由基的清除效果与 Vc无显著性差异或优于
Vc，多与 BHT尚有差距，三种提取液之间无显著性差异（P＞0.05）；在 0.1～5mg·mL-1范围内，三种提取液对 Fe3+的还原能力随着浓度上升显著增强，但
与 Vc、BHT尚有差距，三种提取液之间无显著性差异（P＞0.05）。（2）综合 SOD结果：水提液高剂量组作用优于其他各药物组，且其血清 SOD活力与
Vc组无显著性差异（P＞0.05），肝脏中 SOD活力只有该组与模型组比较有显著性效果。综合 GSH-PX活性结果：除 50%醇提高低剂量组外，其余各组
均具有较好活性；其中水提液高剂量组在血清中的 GSH-PX活性显著高于 Vc组。综合MDA结果：水提液高低剂量组和 50%、95%醇提高剂量组均
具有较好的效果，而且这些组在血清和肝脏中的MDA含量与 Vc组相比，降低无显著性差异（P＞0.05）。[结论]红腺忍冬叶的不同溶剂提取物都具有
一定的体内外抗氧化效果，特别是对提高GSH-PX活性和对MDA的清除效果较强。其中水提液抗氧化效果优于醇提物，值得深入研究。
关键词：红腺忍冬叶；抗氧化；抗衰老；自由基；DPPH；SOD；GSH-PX；MDA
中图分类号：R331 文献标识码：A 文章编号：1005-5509(2012)10-1117-06
Experimental Study of Antioxidant Effect on Leaves of Lonicera Hypoglauca Miq. Zhu Ying，Li Jian College of Pharmacy，Zhejiang Chinese Medical Uni－
versity，Hangzhou（310053）
Abstract:[Objective] To study the antioxidant effect on leaves of Lonicera Hypoglauca Miq.and provide an experimental basis for the development and uti－
lization of leaves of Lonicera Hypoglauca Miq.. [Methods] Antioxidant activities of leaves of Lonicera Hypoglauca Miq. were studied by the experiments in
vivo and in vitro of different extracts. ① Compared with Vc and BHT, the vitro antioxidant activities were studied by DPPH radical scavenging and the re－
ducing capacity of Fe3+. ② Senile mouse models induced by D-galactose were used. Compared with Vc, the vivo antioxidant activities of extracts were
studied by measuring SOD, GSH-PX activity and MDA content of serum and liver tissue. [Results] ①In 0.5～5mg·mL-1, the scavenging effect of water ex－
tract, 50% ethanol extract and 95% ethanol extract on DPPH free radicals had no significant difference or the more excellent performance with that of Vc but
mostly a gap with that of BHT. Three extracts showed no significant difference from one another. In 0.1～5mg·mL-1, the reducing capacity of three extracts
on Fe3+ significantly enhanced with the increasing of concentration, but had a certain gap with that of BHT and Vc. Three extracts showed no significant dif－
ference from one another. ②The comprehensive results of SOD: the high dose group of water extract had a better effect than the other drug groups. Its SOD
activity in the serum had no significant difference with that of VC group. For the SOD activity in the liver, only this group showed a significant effect com－
pared with the model group. Comprehensive GSH-PX activity results: except high and low dose groups of 50% ethanol extract, the other groups all had
good activity. Among which in the high dose group of water extract, GSH-PX activity in the serum was significantly higher than that of VC group. Inte－
grated MDA results: high and low dose groups of water extract, high dose groups of 50% ethanol extract and 95% ethanol extract had good effects. And in
these groups, the MDA content in the serum and liver had no significant difference or significant reduction compared with that of VC group.[Conclusion]
The different extracts of leaves of Lonicera Hypoglauca Miq.had antioxidant activity both in vitro and in vivo, especially obviously increasing GSH-PX ac－
tivity and remarkably removing effect of MDA. The water extract had the more excellent performance compared with ethanol extract. Antioxidant effect of
water extract on leaves of Lonicera Hypoglauca Miq. is worthy of further research.
Key words: leaves of Lonicera Hypoglauca Miq.; antioxidant; intiating; free radical; DPPH; SOD; GSH-PX; MDA
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基金项目:浙江省中医药管理局项目（2009CA010）
Fund project: Programme of Zhejiang Provincial TCM Administration（2009CA010）
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DOI:10.16466/j.issn1005-5509.2012.10.031
浙江中医药大学学报 2012年 10月第 36卷第 10期
红腺忍冬 lonicera hypoglauca Miq. 的干燥花蕾
或带初开的花为 2010年版《中国药典》山银花的收载
品种，也曾是 2000年版《中国药典》金银花的收载品
种。在 2010年版《中国药典》中，山银花和金银花项下
的“性味与归经”、“功能与主治”完全一样，具有清热
解毒、疏散风热之功效[1]。
金银花不仅是温病要药，用于治疗急性支气管
炎、呼吸道感染等疾病[2]，而且属于“药食同源”的绿色
天然产物。现代研究表明，红腺忍冬花蕾和金银花、金
银花叶都具有抗氧化、抗菌等药理活性，均含黄酮、绿
原酸等成分[3-8]，现已有人把金银花叶提取物加到化妆
品中，结果表明具有很好的防腐和抗氧化效果[9]。而红
腺忍冬叶和金银花、金银花叶、红腺忍冬花蕾在化学方
面也具有一定的相似性，含有黄酮、绿原酸等成分[10-12]。
鉴于金银花和山银花原植物在我国大部分产区一年
四季均不落叶，一直被视为非药用部位。而红腺忍冬
作为浙江省山银花主要基原植物之一[13]，资源丰富。为
了合理利用这一废弃资源，本实验室对浙江产红腺忍
冬叶已做初步的化学分析和部分药理实验，现将其抗
氧化实验结果报告如下。
1 材料仪器
1.1 药材 红腺忍冬叶 2007 年 11 月采集于浙江
省，经浙江中医药大学药用植物教研室陈锡林副教授
鉴定为忍冬科植物红腺忍冬（Lonicera hypoglauca
Miq．）的叶子。
1.2 药品与试剂 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-
diphenyl-2-picrylhy drazyl，DPPH）由日本WAKO公司
生产；Vc（东北制药厂，批号：20080952）；超氧化物歧
化酶（superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（malondi－
aldehyde, MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione
peroxidase, GSH-Px）、考马斯亮蓝试剂盒均由南京建
成生物工程研究所提供；D-半乳糖（上海化学试剂二
厂）；二丁基羟基甲苯 （butylated hydroxytoluene,
BHT）等试剂均为分析纯。
1.3 仪器 UV-2550紫外-可见分光光度计（日本岛
津）；HH-S型恒温水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；
电子天平（BS224S，德国赛多利斯）；L-210 型漩涡混
合器（北京来亨科贸有限责任公司）。Power Wave
340型酶标仪（美国 Bio-TEK公司）；Biofuge Stratos
全能台式高速冷冻离心机；XHF-D高速分散器（宁波
新芝生物科技股份有限公司）。
1.4 动物 ICR 小鼠，SPF 级，雄性，体重（20±2）g，
148只，来源：中国科学院上海实验动物中心，生产许
可证：SCXK（沪）2008-0007。小鼠饲养于浙江中医药
大学动物实验研究中心 SPF 级小鼠饲养室：温度
（22±1）℃，湿度 50%～70%，光照 150～200Lx，12h明暗
交替，噪音<50dB。
2 实验方法
2.1 供试液和对照品溶液的制备 （1）水提液：称取
干燥红腺忍冬叶粗粉 5.0g，石油醚脱脂后用 12倍量的
水煎煮 2次，2h/次，合并提取液，用时稀释到 5、2、1、
0.5、0.2、0.1mg·mL-1。（2）醇提液：称取两份干燥红腺忍
冬叶粗粉 5.0g，石油醚脱脂后分别用 12倍量的 50%
和 95%乙醇回流提取 2次，2h/次，合并提取液，回收乙
醇，用时分别稀释成 5、2、1、0.5、0.2、0.1mg·mL-1 的
50%乙醇提取液和 95%的乙醇提取液。（3）Vc对照品
溶液：将 Vc片剂 100mg，用蒸馏水溶解，分别配成 5、
2、1、0.5、0.2、0.1mg·mL-1的 Vc水溶液。（4）BHT对照
品溶液：称 BHT粉末 200mg，用 95%乙醇溶解，分别配
成 5、2、1、0.5、0.2、0.1mg·mL-1的 BHT乙醇溶液。
2.2 体外抗氧化实验[14-17]
2.2.1 对 DPPH 自由基的抑制作用 准确称取
20mgDPPH用 50%乙醇溶解并定容于 250mL容量瓶
中，则 DPPH浓度为 2×10-4mol·L-1，取等体积供试液
及 2×10-4mol·L-1DPPH溶液加入同一具塞试管中，摇
匀。30 min后用 50％乙醇做参比在 525nm下测定其
吸光度 Ai，同时测定 2×10-4mol·L-1DPPH溶液与等体
积 50％乙醇混合液的吸光度 Ac，以及供试液与等体
积95％乙醇混合液的吸光度 Aj。清除率=[1-(Ai-Aj)
／Ac]×100％。
2.2.2 对 Fe3+的还原作用 取 2.5mL 供试液，加入
2.5mL 的磷酸盐缓冲液(0.2mol·L-1，pH=6.6)及 2.5mL
的 1% K3Fe(CN)6溶液，于 50 ℃水浴反应 20 min后，
急速冷却，加入 2.5mL的 10%三氯乙酸溶液，取反应
液 5mL，加入 5mL的 H2O和 0.1%FeCl3溶液 1mL，混
合均匀，10min后于 700nm处测定其吸光度值，以水
为空白，吸光度值越大表示还原能力越强。
以上实验均以 Vc和 BHT作阳性对照。
2.3 体内抗氧化实验
2.3.1 造模试验
2.3.1.1 动物分组 取体重约 (20±2)g的小鼠 40只，
随机分成正常组和模型组，每组 20只，模型组每天于
颈背部皮下注射 D-半乳糖 1g·kg-1（10%的 D-半乳
糖），正常组每天于颈背部皮下注射等量的生理盐水，
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同时两组均灌胃给予 0.02mL·g-1的饮用水。自由饮
水，自由摄食。28d后，两组各取出 10只，眼眶取血后
处死；分离血清，测定血清 SOD活性和 MDA含量。余
下 20只仍分成正常模型两组饲养给药至 42d时，摘
眼球取血后处死；分离血清，测定血清 SOD活性和
MDA含量。
2.3.1.2 SOD活性和 MDA含量测定 按照试剂盒说
明书测定。
2.3.2 红腺忍冬叶不同溶剂提取物的体内抗氧化实验
2.3.2.1 动物分组 选取 108只小鼠，随机分成 9组，
每组 14只。各组分别为正常组、模型组、水煎液 4g·kg-1
和 8g·kg-1剂量组、50%醇提液 4g·kg-1和 8g·kg-1剂量
组、95%醇提液 4g·kg-1和 8g·kg-1剂量组(各剂量组均为
生药含量)、Vc阳性对照组 50mg·kg-1。小鼠分组适应 5d
后，各给药组分别灌胃给药 0.02mL·g-1，1次/d，正常组
给同剂量的饮用水。并对除正常组以外各组，于颈背部
皮下注射 D-半乳糖 1g/（kg·d），正常组注射等量生理盐
水。自由饮水，自由摄食。持续 42d，最后 1次给药后禁
食 12h，但可自由饮水。摘眼球取血，分离血清。取肝脏。
测定肝脏及血清 SOD、GSH-PX活性和MDA含量。
2.3.2.2 SOD、GSH-PX 活性以及 MDA 含量的测定
（1）血清 SOD活性和MDA含量测定方法见 2.3.1.2项
下。（2）脏器 SOD活性和MDA含量测定：组织匀浆中
SOD活力（U·mg-1prot）=[(对照管吸光度－测定管吸光度)
÷对照管吸光度]÷50%×反应液总体积÷取样量÷组织中
蛋白含量。组织匀浆中MDA含量（nmol·mL-1）=[（测定
管吸光度－测定空白管吸光度）÷(标准管吸光度－标准空
白管吸光度)]×标准品浓度÷蛋白含量。（3）公式中的组
织蛋白含量采用考马斯亮蓝测试盒测定。（4）GSH-PX
活力测定见试剂盒说明书。组织中 GSH-PX活力=[（非
酶管吸光度－酶管吸光度）÷（标准管吸光度－空白管吸
光度）]×标准管浓度×稀释倍数÷反应时间÷（取样量×样
本蛋白含量）。（5）血清中 GSH-PX活力=[（非酶管吸光
度－酶管吸光度）÷（标准管吸光度－空白管吸光度）]×标
准管浓度×稀释倍数×样本测试前稀释倍数。
2.4 数据处理 所有数据采用 EXCEL2003 软件统
计分析，实验结果采用平均值±标准差（x±s）表示，用 t
检验分析各组间差异的显著性。
3 结果
3.1 体外抗氧化实验
3.1.1 红腺忍冬叶不同溶剂提取物对 DPPH自由基的
抑制作用 在 0.5～5mg·mL-1范围内，水提液、50%乙醇
提取液和 95%乙醇提取液对 DPPH自由基的清除效果
与 Vc无显著性差异（P＞0.05）或优于 Vc，多与 BHT尚
有显著性差距（P<0.01）。3种提取液之间无显著性差异。
见表 1
3.1.2 红腺忍冬叶提取物对 Fe3+的还原作用 在 0.1～
表 1 不同溶剂提取物对 DPPH自由基的抑制率(%，n=5，x±s）
浓度（mg·mL-1） 水提液 50%醇提液 95%醇提液 BHT Vc
0.1 47.6±0.70**ΔΔ 56.6±1.86**ΔΔ 48.4±2.94**ΔΔ 74.2±2.13 64.5±2.62
0.2 56.4±1.09**ΔΔ 61.4±1.36*ΔΔ 50.2±1.72**ΔΔ 81.2±1.26 63.8±1.36
0.5 65.0±2.21ΔΔ 61.5±2.58ΔΔ 63.9±1.41ΔΔ 80.1±1.09 63.9±0.90
1 65.9±3.00ΔΔ 67.4±2.48*ΔΔ 64.7±0.58ΔΔ 80.8±1.78 63.8±1.41
2 68.3±2.47*ΔΔ 64.9±0.83ΔΔ 71.3±0.94**ΔΔ 81.8±2.04 63.0±3.34
5 67.8±2.58**ΔΔ 70.9±2.89**ΔΔ 82.6±1.99**Δ 79.7±0.67 62.2±2.56
注：与 BHT对照组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与 Vc对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
5mg·mL-1范围内，红腺忍冬叶的水提液、50%乙醇提取
液和 95%乙醇提取液对 Fe3+的还原能力随着浓度的上
升显著增强，但与 Vc、BHT相比，尚有显著性差距（P<
0.01）。三种提取液之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见
表 2。
3.2 体内抗氧化实验
3.2.1 造模试验 造模 28d后，正常组和模型组在血
清中的 SOD和MDA差别均无统计学意义（P＞0.05），而
在 42d后，SOD 和 MDA都有显著差别（P<0.01），说
明造模成功。见表 3。
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3.2.2 红腺忍冬叶不同溶剂提取物的体内抗氧化实验
3.2.2.1 红腺忍冬叶不同溶剂提取物对 SOD活性的
影响水提液高剂量组作用优于其他各药物组，且其
血清 SOD与 Vc组无显著性差异，肝脏中 SOD活力
只有水提液高剂量组与模型组比较有显著性效果。
综合 SOD结果，见表 4。
表 4红腺忍冬叶不同溶剂提取物对 SOD活性的影响（n=14，x±s）
组别 剂量（g/（kg·d）） 血清(U·mL-1) 肝脏(U·mg-1prot)
正常组 —— 189.4±25.0 351.7±25.5
模型组 —— 148.3±41.2Δ 309.2±26.4ΔΔ
Vc对照组 0.05 205.7±13.6**ΔΔ 380.4±25.2**ΔΔ
水提液 低剂量 4 190.0±20.3** 327.8±58.4
50%醇提低剂量 4 187.5±44.1* 314.1±72.4
95%醇提低剂量 4 173.5±41.7 247.3±45.2
水提液 高剂量 8 201.3±15.9**ΔΔ 335.2±26.1*
50%醇提高剂量 8 198.1±18.4**Δ 273.1±59.0
95%醇提高剂量 8 154.8±39.1 318.1±63.6
注：与正常组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
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表 2 不同溶剂提取物对 Fe3+的还原作用 (吸光度，n=5，x±s）
浓度（mg·mL-1） 水提液 50%醇提液 95%醇提液 BHT Vc
0.1 0.03±0.002**ΔΔ 0.10±0.054**ΔΔ 0.05±0.009**ΔΔ 0.96±0.030 1.37±0.165
0.2 0.09±0.008**ΔΔ 0.13±0.007**ΔΔ 0.08±0.009**ΔΔ 1.68±0.075 3.72±0.148
0.5 0.24±0.02**ΔΔ 0.29±0.028**ΔΔ 0.19±0.007**ΔΔ 2.66±0.292 4.31±0.407
1 0.41±0.02ΔΔ 0.56±0.043ΔΔ 0.38±0.010ΔΔ 4.33±0.056 #
2 0.93±0.54 1.18±0.122 0.66±0.040 # #
5 1.42±0.12 3.19±0.796 1.51±0.137 # #
注：与 BHT对照组比较，△△P＜0.01；与 Vc对照组比较，**P＜0.01；#BHT和 Vc因低浓度时吸光度已经很大，所以后面的高浓度未测定
表 3 不同造模时间的模型结果（n=10，x±s）
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01
组别 造模时间 SOD MDA
正常组
28 228.9±17.2 5.329±0.96
42 202.4±13.8 6.171±0.49
模型组
28 200.2±55.8 5.673±1.27
42 142.0±35.0** 7.312±0.76**
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3.2.2.2 红腺忍冬叶不同溶剂提取物对 GSH-PX活
性的影响 综合 GSH-PX活性结果（见表 5）：除 50%
醇提高低剂量组外，其余各组均具有较好活性；其中
水提液高剂量组在血清中的 GSH-PX活性显著高于
Vc组。
3.2.2.3 红腺忍冬叶不同溶剂提取物对 MDA含量的
4 讨论
DPPH实验中，较多文献选测定波长为 517nm[14-15]，
而本实验选用 525nm。原因是测试样品的溶液介质有
水和乙醇不等，故考虑 DPPH的介质为 50%乙醇，实
验中测得其最大吸收波长为 525nm。后尝试扫描
DPPH的无水乙醇溶液，其最大吸收波长为 517nm，与
文献一致。另有报道[16]用 95%乙醇做介质的 DPPH溶
液的最大吸收波长也为 525nm。为此 DPPH的乙醇-
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影响 水提液高低剂量组和 50%、95%醇提高剂量组
均具有较好的效果，而且这些组在血清和肝脏中的
MDA含量与 Vc组相比无显著性差异或显著降低。综
合 MDA结果，见表 6。
表 5红腺忍冬叶不同溶剂提取物对GSH-PX活性的影响（n=14，x±s）
组别 剂量（g/（kg·d）） 血清(酶活力单位) 肝脏（酶活力单位）
正常组 —— 446.5±58.6 439.4±21.1
模型组 —— 384.3±42.3ΔΔ 332.3±47.3Δ
Vc对照组 0.05 419.75±19.27* 1314.0±148.5**ΔΔ
水提液 低剂量 4 429.4±51.0* 1024.1±94.7**ΔΔ
50%醇提低剂量 4 379.9±30.0 1162.9±129.8**ΔΔ
95%醇提低剂量 4 462.2±61.3** 1164.8±339.7**ΔΔ
水提液 高剂量 8 473.5±79.0** 1183.5±129.0**ΔΔ
50%醇提高剂量 8 375.3±20.7 941.2±229.8**ΔΔ
95%醇提高剂量 8 448.6±47.2** 1018.8±117.4**ΔΔ
注：与正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
表 6 红腺忍冬叶不同溶剂提取物对MDA含量的影响（n=14，x±s）
组别 剂量[g/(kg·d）] 血清(nmol·mL-1) 肝脏(nmol·mg-1prot)
正常组 —— 15.06±1.20 8.80±1.79
模型组 —— 23.54±1.34ΔΔ 11.83±3.16Δ
Vc对照组 0.05 11.29±2.09**ΔΔ 6.90±2.59**Δ
水提液 低剂量 4 8.869±1.28**ΔΔ 6.00±2.08**ΔΔ
50%醇提低剂量 4 24.82±2.70 8.44±2.00**
95%醇提低剂量 4 21.79±2.99 7.86±1.88**
水提液 高剂量 8 11.52±1.10**ΔΔ 5.48±1.12**ΔΔ
50%醇提高剂量 8 11.38±3.52**ΔΔ 4.65±1.43**ΔΔ
95%醇提高剂量 8 10.18±2.434**ΔΔ 6.20±1.00**ΔΔ
注：与正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01
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浙江中医药大学学报 2012年 10月第 36卷第 10期
水介质的溶液最大吸收波长选 525nm为宜。
红腺忍冬叶提取物对 GSH-PX 的活性有显著性
提高，由于 GSH-PX活性中心是硒半胱氨酸，所以
GSH-PX的高活力也可以反应机体内的硒水平较高。
结合抗衰老的微量元素学说，推测红腺忍冬叶除了
清除体内自由基抗氧化以外，还可能通过提高机体
内微量元素的水平而达到抗衰老效果，此推测值得
进一步研究。
本实验证明红腺忍冬叶不同溶剂提取物都具有
一定的体内外抗氧化效果，特别是对提高 GSH-PX
活性和对 MDA的清除效果较强。其中水提液抗氧化
效果优于醇提物，多数指标表现与 Vc无显著性差别
或略优于 Vc，所以有必要对红腺忍冬叶水提液作进
一步的醇沉分离及其抗氧化活性实验。
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(收稿日期 2012-05-15)
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