全 文 ：收稿日期:2006-07-28.
基金项目:教育部新世纪人才(NCET-05-0785);国家自然科学基金(3.470928 , 30671125)
作者简介:邓婷婷(1981-),女, 2004级硕士研究生 ,研究方向为微生物分子生物学.
通讯作者:曹毅.E-mail:caoyi -01@163.com
文章编号:　0490-6756(2007)01-0176-05
盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶(MnSOD)
在大肠杆菌中的功能鉴定
邓婷婷 , 李　静 , 马　根 , 王晓林 , 赵向丽 , 张飞伟 , 乔代蓉 , 曹　毅
(四川大学生命科学学院四川省生物信息与代谢工程共享实验平台 , 成都 610064)
摘　要:将极端耐盐的盐生杜氏藻(Dunaliella sal ina)的锰超氧化物歧化酶(DsMnSOD)基因
克隆到表达载体 pET32a中 ,并转入 SOD缺陷型大肠杆菌菌株 K12(SOD-)中 ,诱导重组蛋白
表达 ,在耐盐 、抗辐射和抗寒方面对其功能进行验证.结果显示 ,导入外源 DsM nSOD基因的工
程菌 ,在有氧条件下受到各种胁迫时 ,生长状况明显优于原菌 ,其耐受 NaCl浓度从 8%提高到
10%,耐受紫外线(295 nm , 83 μW/cm2)照射时间从 45 s提高到 65 s , 4℃培养的存活率从
10.7%提高 19.0%,且 SOD的酶活表达依赖于 Mn2+的存在.
关键词:盐生杜氏藻;锰超氧化物歧化酶;K12(SOD-);SOD酶活
中图分类号:Q81　　　文献标识码:A
Identification of the function of superoxide dismutase gene from
Dunaliella salina in SOD deleted strain K12
DENG Ting-t ing , LI J ing , MA Geng , WANG X iao-lin , ZHAO Xiang-l i ,
ZHANG Fei-wei , QIAO Dai-rong , CAO Y i
(Sichuan Public Experiment Platform of Bioinformatics and Me tabolic Engineering , Colleg e of
Life Sciences , Sichuan University , Chengdu 610064 , China)
Abstract:The recombinant plasmid pET32a-DsMnSOD was const ructed by subcloning the ORF of DsMnSOD
gene from Dunaliel la salina , which is a unicellular alg a possessing ext remely ef fective mechanisms fo r tolerating
such osmotic stress , into the pET32a vector.Then the recombinant plasmid w as transformed into E .coli K12 ,
a double mutant devoid of Mn-SOD and Fe-SOD activi ties.The gene was induced to express proteins and the
function of the superoxide dismutase gene DsMnSOD was identified.Analysis of the results suggests that:in dif-
ferent st ress , comparing the g row ing situation and living condition as aerobes in LB culture medium between
K12pET32a-DsM nSOD , K12pET32a and K12 show s that the fo rmer is better.I t indicated that DsMnSOD has
been successfully fo r expressed in K12 to have enhanced its tolerance to salt(NaCl concentration from 8% to
10%)、ult raviolet radiation(time from 45s to 65s)、cold(4℃10d , livabili ty f rom 10.7% to 19%)and oxygen.
In addi tion , the act ivity of M n-SOD also depends on M n2+.
Key words:Dunaliella salina , Mn superoxide dismutase , K12(SOD-), activi ty of SOD
2007年 2月　
第 44卷第 1期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edit ion)
　 Feb.2007
Vol.44　No.1
1　引　言
超氧化物歧化酶(SOD)是一种能催化超氧阴离
子(O2-)发生歧化反应的金属酶.由于超氧自由基
(O2-)被认为对各种生物大分子及其它细胞组分具
有严重的损伤作用 ,因此 SOD的分子生物学基础及
其应用研究备受关注 ,被认为是体内对抗自由基的
第一道防线.按照结合金属离子种类不同 ,目前已知
的SOD 主要有以下 3 种 ,即 Fe-SOD , Mn-SOD 和
Cu/Zn-SOD[ 1] .其中 Mn-SOD 多为诱导表达型 , 氧
自由基对 Mn-SOD的表达有显著的诱导作用[ 2] .因
此 ,Mn-SOD在机体适应环境变化 ,尤其在应对环境
胁迫方面可能发挥重要作用.
盐生杜氏藻(Dunaliel la salina)具有极强的耐
盐能力 ,能在高达 5.5 mol/L NaCl的培养液中生
存.其耐盐机制中 ,已知甘油是作为一种主要的渗透
调节物质参与其渗透调节过程[ 3] .除此之外 , 高盐
环境会导致超氧自由基的大量产生 ,此时 SOD发挥
的作用值得关注.据报道[ 4] ,耐盐能力高的棉花品
种清除氧自由基的能力高 ,说明 SOD确实与耐盐相
关.因此 ,研究盐生杜氏藻 SOD基因及其蛋白功能
帮助揭示盐藻的耐盐机理.另外 ,SOD 还具有抗冷
寒[ 5] 、抗辐射 、耐缺氧[ 6] 等功效.根据其特性 , 本实
验对盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶的耐盐 、抗辐射
及抗寒功能进行了鉴定.
2　材料与方法
2.1　材料及试剂
E .coli SOD缺陷株 K12由美国犹太大学爱因
斯坦医学院生物化学系教授 Howard M.Steinman
赠予.锰超氧化物歧化酶 DsMnSOD基因由本实验
室从盐生杜氏藻中克隆得到 ,表达质粒 pET32a 由
本实验室保存 , SOD酶活测试盒和蛋白测试试剂盒
均购自南京建成生物工程研究所.
2.2　实验方法
2.2.1　载体 pET32a-DsM nSOD的构建及转化子的
筛选与鉴定　方法参见分子克隆实验指南[ 7] .
2.2.2 　氧胁迫实验 　将两个 LB 平板(含 0.5
mmol/L Mn2+ , 0.5 mmol/L IPTG)均分为 3个区 ,
分别划线接种过夜培养的 K12 、K12pET32a 和
K12pET32a-DsM nSOD ,分别在有氧 、厌氧条件下培
养24 ～ 36 h ,观察比较两 LB平板上菌的生长情况.
实验重复 3次.
2.2.3　盐胁迫实验　分别接种初始量相同的 K12 、
K12pET32a和 K12pET32a-DsM nSOD 到不同盐浓
度(1%、2%、4%、8%、10%)的 LB 培养基(含 0.5
mmol/L M n2+ ,0.5 mmol/ L IPTG)中 ,37℃下相同
条件培养 18 h 后 ,测菌液 OD 值及粗酶液的 SOD
酶活和蛋白含量.实验处理平行样 3个 ,重复 3次.
2.2.4　紫外照射胁迫实验　参照文献[ 8] 所描述的
方法 ,紫外(波长 295 nm ,强度为 83 μW/cm2)照射
经 IPTG 诱导后的 K12 、K12pET32a、K12pET32a-
DsM nSOD一定时间(5 、15 、30 、40 、45 、60 、65 s).
37℃培养 36 h后 ,计算存活率.另一方面 ,吸取等量
的经 IPTG诱导后的 3种菌液至石英比色杯中 ,轻
轻摇匀 ,经过与前面相同的紫外照射后 ,立即进行菌
液 SOD酶活测定和蛋白含量测定.实验均处理平行
样品 3个 ,重复 3次.
2.2.5　温度胁迫实验　接种初始量相同的 K12 、
K12pET32a、K12pET32a-DsMnSOD 菌液到新的液
体 LB 培养基中(0.5 mmol/L M n2+ , 0.5 mmol/L
IPTG),混匀 ,做活菌计数.然后在有氧条件下置于
4℃培养 , 4 、7 、10 d 之后 ,再分别做活菌计数 ,计算
菌的存活情况.实验处理平行样品 3个 ,重复 3次.
图 1　pET32a-DsMnSOD酶切和 PCR鉴定
Fig.1 Restriction map of the recombinant plasmid
pET32a-DsMnSOD and PCR identification
M:DNA Marker;1:PCR production amplified w ith pET 32a-
DsMnSOD template; 2: pET32a-DsMnSOD digested w ith
EcoR Ⅰ and X ho Ⅰ ;3:plasmid pET 32a-DsMnSOD
3　结　果
3.1　重组质粒载体的构建与鉴定
电泳结果如图 1 ,经酶切和 PCR验证 ,均能得
到大小约 680 bp的基因片段 ,与 DsMnSOD基因片
段大小一致 , DNA 测序后证明读框正确 ,说明表达
载体构建成功.
177第 1期 邓婷婷等:盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶(MnSOD)在大肠杆菌中的功能鉴定 　
3.2　DsMnSOD在工程菌中的功能鉴定
3.2.1　氧胁迫实验　与厌氧条件不同 ,在有氧环境
下 ,活性氧代谢平衡紊乱时产生的超氧化物自由基
含量增加 ,会抑制细胞生长.如表 1所示 ,在有氧条
件下 , K12pET32a-DsM nSOD 的 生长明 显优 于
K12pET32a ,可能是由于 DsM nSOD 基因的表达保
护了细胞免受 O2-积累造成的损伤.在厌氧条件下 ,
两菌的生长情况相当 ,说明造成在有氧条件下两菌
生长差异的原因很可能是活性氧毒害.但无论在有
氧还是无氧条件下 , K12 的生长情况均好于
K12pET32a和 K12pET32a-DsM nSOD ,可能是外源
质粒的导入对菌的生长造成了影响.然而在有氧条
件下 ,K12的生长优势较厌氧条件时小 ,说明氧的存
在对 K12的生长造成了一定负面影响.
表 1　K12、K12pET32a与 K12pET32a-DsMnSOD 在 LB 平板上的生长情况
Tab.1　Grow th condition of K12 , K12pET32 and K12pET32a-DsMnSOD in LB plate
培养条件 K12 K12pET32a K12pET32a-DsMnSOD
有氧培养 生长良好 , 培养 24 h 可形成直径
1.5～ 2.0 mm 的圆形菌落
生长较慢 ,培养 24 h 可形成微小菌
落
生长良好 , 培养 24 h 可形成直径
1.0～ 1.5 mm 的圆形菌落
厌氧培养 生长良好 , 培养 36 h 可形成直径
1.5～ 2.0 mm 的圆形菌落
生长较好 , 培养 36 h 可形成直径
1.0～ 1.5 mm 的圆形菌落
生长较好 , 培养 36 h 可形成直径
1.0～ 1.5 mm 的圆形菌落
3.2.2　盐胁迫影响　在正常培养基中(NaCl 1%),
3 种 菌 的 生 长 情 况 差 别 不 大 , K12 最 好 ,
K12pET32a-DsM nSOD 、K12pET32a次之.随着培养
基盐浓度的增加 , K12pET32a-DsMnSOD的生长优
势趋于明显.如图 2 所示 , 当盐浓度达到 4%时 ,
K12pET32a-DsM nSOD的生长已经明显超过其他两
菌;当外界盐浓度达到 8%时 , K12 和 K12pET32a
已几乎不能生长 ,而 K12pET32a-DsMnSOD生长良
好 ,它能耐受的盐浓度高达 10%.如图 3所示 ,随着
盐浓度的增加 , K12pET32a-DsMnSOD 菌液 SOD酶
活呈递增趋势.结果显示 ,导入外源 DsM nSOD基因
能够提高菌株耐盐的能力.
图 2　不同盐浓度下 K12 、K12pET32a与 K12pET32a-
DsMnSOD的生长情况
F ig.2 Comparison o f the g row th of K12 , K12pET32a
and K12pET32a-DsMnSOD under different con-
centration of NaCl
3.2.3　紫外照射胁迫　如图 4所示 ,随着紫外照射
图 3　不同盐浓度下 K12pET32a-DsMnSOD 菌液粗提
物的 SOD酶活
Fig.3 Activity of SOD from K12pET32a-DsMnSOD ex-
tra crude under different concentration of NaCl
的时间延长 ,3种菌株的存活率都不可避免的下降.
其中 ,K12和 K12pET32a的下降较快且下降速度相
当 ,说明外源空载质粒的导入并没有对 K12 菌株的
紫外耐受能力造成影响;而 K12pET32a-DsMnSOD
的下降速度较前两者缓慢 ,说明其紫外耐受时间有
所延长.下降百分率与菌株抗紫外能力呈负相关 ,反
映出 K12pET32a-DsM nSOD 有较 K12pET32a 和
K12高的抗紫外能力.菌株 K12pET32a-DsMnSOD
的最长耐受紫外照射的时间达到了 65 s ,较对照株
的 45 s提高了 20 s.又如图5所示 ,随着照射强度的
增加 , SOD的酶活性也有小幅提升 ,两者呈现出正
比例的关系.结果显示 ,导入外源 DsM nSOD基因能
够提高菌株耐受紫外照射的能力.
178 四川大学学报(自然科学版) 第 44卷
图 4 　紫外照射对 K12、K12pET32a 和 K12pET32a-
DsMnSOD生长的影响
Fig.4 Different sur vival rates of K12 , K12pET32a and
K12pET32a-DsMnSOD under different UV dose
图 5　不同紫外照射时间对 K12pET32a-DsM nSOD 菌
液粗提物的 SOD 酶活影响
Fig.5 Activity of SOD from K12pET32a-DsMnSOD ex-
tra crude under different UV dose
表 2　4℃下 , K12、K12pET32a和 K12pET32a-DsMnSOD 的存活情况(X ±S , n=5)
Tab.2　Survival condition of K12 , K12pET32a and K12pET32a-DsMnSOD under 4℃ in LB culture medium
时间(d) K12 K12pET32a K12pET 32a-DsMnSOD
　0 N:(167.9±3.5)×106个/mL N:(165.9±4.5)×106个/mL N:(174.1±5.9)×106 个/mL
4 N:(114.2±2.0)×106个/mL
(R=68.0%)
N:(101.5±3.3)×106 个/mL
(R=61.2%)
N:(125.2±4.9)×106 个/mL
(R=71.9%)
7 N:(56.1±2.2)×106个/mL
(R=33.4%)
N:(52.1±2.7)×106 个/mL
(R=31.4%)
N:(71.3±3.2)×106 个/mL
(R=40.9%)
10
N:(20.7±3.5)×106个/mL
(R=12.3%)
N:(17.8±4.6)×106 个/mL
(R=10.7%)
N:(33.1±3.9)×106 个/mL
(R=19.0%)
X:菌落平均数;S :相对误差;n:平行样品个数;N:活菌数;R:存活率 ,分别用第 4 d 、第 7 d 、第 10 d的活菌数与 0 d的活菌数相比
3.2.4　温度胁迫实验　如表 2所示 ,低温培养 4 ～
10 d后 ,菌的存活率都有所减少 ,但 K12pET32a-
DsM nSOD的存活率始终高于 K12pET32a 和 K12 ,
证明导入的外源 DsM nSOD基因赋予了菌株一定的
抗寒能力.10d后 ,K12pET32a-DsM nSOD的存活率
较空载对照株提高了 8.3%,较阴性对照株提高了
6.7%.虽然低温会对 SOD活性的自身正常表达产
生一定影响 ,但从结果显示 ,这个影响并没有很突
出 ,SOD依然对菌株耐受低温胁迫起到了作用.
4　讨　论
4.1　突变菌株以及 MnSOD酶特性的验证
实验中 ,在各种情况下 ,阴性对照 K12 以及空
载对照 K12pET32a 的菌细胞溶解物中均未检测出
有SOD活性 ,证明突变株没有发生回复突变.正常
培养时发现 , K12pET32a-DsMnSOD 菌的细胞溶解
物中 SOD活性在 IPTG 诱导后 ,无 Mn2+时活性较
低 ,为 7.37 U/mg ,有 Mn2+时达 59.58 U/mg ,证明
了盐生杜氏藻MnSOD酶活性受到 Mn2+调节 ,显示
出金属酶的特性.
4.2　质粒的导入对菌株生长的影响
在正 常 培 养 条 件 下 , K12 的 生 长 优 于
K12pET32a 和 K12pET32a-DsMnSOD(如图 2 、表
1 、表 2),可能是因为后两者导入了外源质粒 ,外源
基因表达等因素消耗大量能量 ,增加了菌的生长负
荷 ,在一定程度上影响了菌的生长.但在胁迫环境
下 ,胁迫对菌的生长影响已远远超过了上述影响 ,
K12pET32a-DsMnSOD显示出明显的生长优势 ,证
明了 DsMnSOD基因的抗逆功能.
4.3　SOD对细胞的保护作用
在逆境条件下(如低温 、盐渍 、辐射等),细胞内
活性氧代谢系统的平衡被破坏 ,自由基的生成量增
加 ,损伤细胞膜系统 ,影响细胞的生长.相关研究表
明 ,SOD是通过清除过量的超氧自由基来降低胁迫
179第 1期 邓婷婷等:盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶(MnSOD)在大肠杆菌中的功能鉴定 　
对细胞生长的不利影响.
众所周知 ,盐生杜氏藻具有极端的耐盐和抗辐
射能力.功能互补研究显示 ,导入盐生杜氏藻锰超氧
化物歧化酶基因提高了工程菌 K12(SOD-)的多种
抗逆能力 ,其中耐盐和抗辐射能力尤为突出.由此可
见 ,盐藻锰超氧化物歧化酶在其耐盐和抗辐射机制
中很可能发挥了重要的作用.结果显示 ,盐藻中的
SOD具有超氧化物歧化酶的普遍特性 ,但在长期的
进化演变过程中 ,受环境诱导 ,也逐渐形成了功能上
一定的偏好性.
本实验中 ,通过应用 K12(SOD-)我们获得了
盐生杜氏藻(Dunal iella sal ina)DsMnSOD基因的许
多信息 ,从宏观的角度证实了 DsMnSOD 基因具备
的部分生理功能 ,大肠杆菌的 SOD缺陷株对研究外
源SOD的各种生物学功能提供了很大的帮助.盐藻
DsM nSOD基因的成功表达 ,为进一步在分子水平
上研究 DsM nSOD 基因与逆境的关系奠定了基础 ,
不仅对解释盐藻的耐盐机制有所帮助 ,还有助于阐
述生物体在逆境中生长的其它相关机制 ,开展有经
济价值的 SOD应用研究.
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