全 文 ：应用与环境生物学报 2011，17 ( 2 ): 202~206
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X
2011-04-25
DOI: 10.3724/SP.J.1145.2011.00202
盐生杜氏藻（Dunaliella salina）是世界上最耐渗的单
细胞真核绿藻，能在0.5~5.5 mol/L NaCl环境下正常生长. D.
salina抵抗外界高渗胁迫主要是通过快速积累相容性溶质甘
油平衡细胞内外渗透压 [1]. 已有研究发现，甘油的产生主要通
过两个途径—— 体内淀粉的降 解 [2]和光合作用固定的二氧
化碳 [3]. 这两种途径都要利用糖酵解途径的中间产物磷酸二
羟基丙酮作为甘油产生的底物[4]. 糖酵解途径在D. salina甘油
快速产生的过程中可能发挥着重要的作用.
烯 醇 酶 作为 糖 酵 解 途 径中的 重 要 蛋白，其 研 究 主 要
集中在酶活方面 [5]，在调控功能上的作用研究十分缺乏 . 在
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞中，烯醇酶有两
个同工酶，即ENO1和ENO2，其中ENO1是酵母细胞在高温
环境下生长所必需的，受高温诱导，具有稳定DNA的作用；
ENO2呈组 成型表 达 [6]. 随 后的研究 [7~8]发现枯草芽 孢杆菌
（Bacillus subtilis）﹑嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）
中的烯醇酶也受高温诱导. 另外，玉米（Zea mays）﹑拟南芥
（Arabidopsis thiliana）及灰霉菌（Botrytis cinerea）烯醇酶受
低温诱导 [9~11]，具有转录因子功能. 迄今为止尚未有真核藻类
烯醇酶温度应答的报道.
本实验室前期发现 D. salina烯醇酶在高渗胁迫时出现
表达差异，并且已经成功克隆到了D. salina烯醇酶基因的全
长cDNA（DsENO）[12]，证明其 参与甘油补偿代谢的基本过
程 [13] . 在 此 基 础 上，本 研 究 利用 基因组步行方 法克 隆 D.
salina烯醇酶启动子，通过生物信息学手段对其核心元件与
调控元件进行预测分析；针对预测分析结果采用实时荧光定
量PCR（Real-time fl uorescence guantitative PCR，RT-PCR）方
法研究了高渗﹑高温及低温胁迫下D. salina烯醇酶在转录水
平的变化，以期为进一步研究D. salina的耐渗机制和甘油合
成机制奠定基础.
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 藻株及其培养 盐生杜氏藻（D. salina FACHB 435）购
自中国科学院水生生物研究所. D. salina的培养：将原藻种按
5%的接种量加入D. salina培养基 [14]，于25 ℃光照条件培养，
光照强度为2 000 lx，明暗周期为16 h : 8 h.
1.1.2 主要试剂和菌株 限制性内切酶（Dra Ⅰ﹑EcoR Ⅴ﹑
Pvu Ⅱ和Stu Ⅰ）、LA TaqTM﹑T4 DNA Ligase﹑pMD18-T
盐生杜氏藻烯醇酶基因启动子的克隆分析
及胁迫转录应答*
段静波 李少贺 阮 琨 白林含**
（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 成都 610064）
Cloning of Promoter of the Enolase Gene from Duanliella salina and
Its Transcriptional Response to Stress*
DUAN Jingbo, LI Shaohe, RUAN Kun & BAI Linhan**
(Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment of Ministry of Education, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)
Abstract With the genome walking method and nested PCR, enolase gene DsENO 5’ upstream regulatory sequence (about
2 000 bp) was cloned from Dunaliella salina, and its sequence analysis was made to investigate the specifi c function of D.
salina during osmotic stress tolerance. The result shows that it includes several conserved sequences related to transcriptional
regulation, such as CAAT-box, TATA-box, and it is rich in light, drought and other stress responsive elements. With the
real-time fl uorescence quantitative PCR method, the DsENO transcription under hyperosmotic, high-temperature and low-
temperature stress were studied to fi nd that it was strongly inhibited by hyperosmotic stress and signifi cantly induced by high-
temperature, but slightly induced by low-temperature. Fig 4, Tab 2, Ref 19
Keywords Dunaliella salina; enolase; genome walking; promoter; real-time fl uorescence quantitative PCR; response to stress
CLC Q785+Q949.210.5
摘 要 为了解盐生杜氏藻（Dunaliella salina）烯醇酶（Enolase）在渗透耐受中的具体功能，利用基因组步行方法和巢
式PCR，从D. salina中克隆了烯醇酶基因DsENO 5’上游约2 000 bp的调控序列，并对其进行序列分析. 分析表明，它包含
多个与转录调控有关的保守序列（如CAAT-box，TATA-box），富含光﹑干旱及其它胁迫应答元件. 利用实时荧光定量
PCR的方法，研究了高渗﹑高温以及低温外界胁迫条件下DsENO的转录情况，发现其受高渗强烈抑制，高温显著诱导
而低温微弱诱导. 图4 表2 参19
关键词 盐生杜氏藻；烯醇酶；基因组步行；启动子；实时荧光定量PCR；胁迫应答
CLC Q785+Q949.210.5
收稿日期：2010-04-22 接受日期：2010-07-01
*国家自然科学基金项目（Nos. 30500006，30970043）资助 Supported by
the National Natural Science Foundation of China (No. 30500006, 30970043)
**通讯作者 Corresponding author (E-mail: bailinhan@scu.edu.cn)
2032 期 段静波等：盐生杜氏藻烯醇酶基因启动子的克隆分析及胁迫转录应答
Vector﹑PrimeScriptTM RT reagent Kit﹑SYBR® Premix Ex
TaqTM﹑DL2,000TM DNA Marker购自TaKaRa公司. E. Z. N.A.TM
Gel Extraction Kit﹑E. Z. N.A.TM Plasmid Mini Kit购自Omega
Bio-tek公司. TRI REAGENTTM购自SIGMA公司. 用于转化的
宿主菌株E. coli JM109由本实验室保存.
1.1.3 接头序列和接头引物 参照文献[15~16]，合成基因组
步行接头长序列和短序列以及接头引物（Adaptor primer，
AP）AP1和AP2. 引物序列见表1.
1.1.4 DsENO基因特异性引物 根据NCBI上的DsENO基因
序列（Accession No. AY245549），设计一对基因特异性引物
（Gene specifi c primer, GSP）GSP1和GSP2. 引物序列见表1.
1.1.5 接头﹑接头引物和基因特异性引物相应位置 接头长序
列和短序列以及接头引物AP1和AP2，DsENO基因特异性引
物GSP1和GSP2的相应位置见图1.
1.1.6 RT-PCR引物 以NCBI上的D. salina 18S rRNA
（Accession No. DQ009779）作为内参基因，设 计引物18S
For.和18S Rev. 根 据NCBI上的DsENO基因序列设 计引物
DsENO For.和DsENO Rev. 引物序列见表1. 所有引物均由上海
Invitrogen公司合成.
1.2 方 法
1.2.1 D. salina基因组DNA的提取和步行文库的构建 D. salina
基因组DNA的提取和纯度鉴定参见文献[17]. 基因组步行文
库的构建参见文献[15]，构成平端限制性内切酶Dra Ⅰ酶切
的文库D、EcoR Ⅴ酶切的文库E、Pvu Ⅱ酶切的文库P和Stu
Ⅰ酶切的文库S，备用.
1.2.2 巢式PCR扩增DsENO 5’上游区 用合成的接头引物
AP1﹑AP2和DsENO基因特异性引物GSP1﹑GSP2做巢式PCR
扩增DsENO的5’上游调控区. 分别从上述4种文库中取1 μL用
于第一次PCR. PCR反应体系（50 μL）：DNA模板1 μL，10×LA
PCR Buffer 5 μL，MgCl2（25 mmol/L）4 μL，dNTP（2.5 mmol/
L）4 μL，AP1（25 μmol/L）1 μL，GSP1（25 μmol/L）1 μL，LA
TaqTM 0.25 μL及无菌水33.75 μL. 反应条件：94℃ 90 s；94℃
45 s，50℃ 45 s，72℃ 90 s，35 cycles；72℃ 10 min. 每反应体系
取8 µL进行1%琼脂糖电泳. 将上述PCR产物稀释100倍，取1
μL作模板进行第二次PCR. 反应体系除AP2﹑GSP2分别替换
AP1﹑GSP1外其余组分与第一次PCR相同. 反应条件除退火
温度变为48 ℃外其余条件与第一次PCR相同. 反应结束后，
进行1%琼脂糖凝胶电泳检测.
1.2.3 DsENO 5’上游区序列分析 第二次PCR产物经胶回收纯
化，用pMD18-T Vector进行连接，转入E. coli JM109. 质粒的
小量提取按E. Z. N.A.TM Plasmid Mini Kit说明书进行，目的插
入片段的酶切鉴定等按文献[17]方法进行. 酶切鉴定正确的
克隆进行测序，利用DNA分析软件Vector NTI Advance 10以
及启动子数据库Fruitfl y及Plantcare，对所得序列进行分析.
1.2.4 DsENO转录活性的RT-PCR检测 将生长至对数生
长期的30 mL D. salina转移到50 mL三角瓶中，进行高渗﹑
高温及低温胁迫 . 即直接向含有30 mL D. salina的9个三角
瓶中加入NaCl 1.755 g（终浓度为3 mol/L）或将其移至37℃﹑
4℃，分别处理0﹑5 min﹑10 min﹑30 min﹑90 min﹑3 h﹑6 h﹑
9 h﹑12 h. 收集各种胁迫时间点处理的D. salina细胞，按TRI
REAGENTTM试剂说明提取细胞总RNA. 分别取等量各胁迫
时间点的RNA进行反转录. 参照PrimeScriptTM RT reagent Kit,
SYBR® Premix Ex TaqTM说明书进行两步法RT-PCR检测. 反
转录体系为10 μL，采用Oligo dT Primer及Random 6 mers，条
件为：37 ℃ 15 min；85 ℃ 15 s. PCR体系为25 μL，条件为：94
℃ 60 s；94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40 cycles. 融解
曲线分析：94 ℃ 60 s；94 ℃ 15 s，55 ℃ 60 s，0.5 ℃/10 s
程序升温经80 cycles. 利用Bio-Rad iCycler iQ5 Software
对RT-PCR结果进行C T 值以及基线自动分析. 利用2 -ΔΔCT方
法 [18]分析基因转录的差异，ΔCT = CT（目的基因）- CT（内参基因），
ΔΔCT = ΔCT（某一处理）- ΔCT（初始处理）.
2 结 果
2.1 DsENO 5’上游区的PCR扩增
选用4种平端限制性内切酶消化D. salina基因组DNA，
酶切结果都较为理想，达到了构建基因组步行文库所要求的
酶切效果.
经过两次PCR反应，在P文库出现了3条特异性扩增带，
两条在500 bp左右，一条在300 bp左右（图2）. 基于基因上游
区应包含尽可能多的调控元件，故回收在P文库中扩增到的
500 bp左右PCR产物.
巢 式PCR得到的特 异性产物进行T/A克隆，经测序和
表1 设计的引物和引物序列
Table 1 Designes and sequences of primers
引物 Primers 引物序列 Primer sequences
基因组步行接头长序列
Genome walking
adaptor long sequence
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCG-
GCCGCCCGGGCAGGT-3’
基因组步行接头短序列
Genome walking
adaptor short sequence
5’-PO4-ACCTGCCC-NH2-3’
AP1 5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3’
AP2 5’-AATAGGGCTCGAGCGGC-3’
GSP1 5’-TGTACTCCTGCACGGTGGC-3’
GSP2 5’-GCGCCTTGCTGCTGCTTA-3’
GSP3 5’-TGCACCCTGAGCCATGAGTGAC-3’
GSP4 5’-AGAAGAGGGAGCGTGAGTCAGT-3’
18S For. 5’-TTGGGTAGTCGGGCTGGTC-3’
18S Rev. 5’-CGCTGCGTTCTTCATCGTT-3’
DsENO For. 5’-TGTTGCTTGGTGGAAATGTTG-3’
DsENO Rev. 5’-TATCCGATTAACCCACGAGACAC-3’
图1 接头﹑接头引物和基因特异性引物相应位置
Fig. 1 Location of adaptor and its corresponding primers
AP1：接头引物1；AP2：接头引物2；GSP1：基因特异性引物1；GSP2: 基因特
异性引物2
AP1: Adaptor primer 1; AP2: Adaptor primer 2; GSP1: Gene specifi c primer 1;
GSP2: Gene specifi c primer 2
204 17 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol
序列分析证实，从P文库中扩增到的稍小条带的3’端核苷酸
序列与已知DsENO 5’非翻译区核苷酸序列完全一致，提 示
该PCR产物为DsENO 5’上游区序列. 在新获得的500 bp上游
序列基础上再设计一对基因特异性引物GSP3和GSP4. 引物
序列见表1. 最后成功获得2 000 bp左右的DsENO启动子序列
（Accession No. GU295152）.
2.2 PCR产物的序列分析
序列（Accession No. GU295152）与GenBank中的序列
进行BLAST分析，结果发现除本实验室在GenBank提交的
DsENO之外，未有与本文报道序列高度相似的序列. 经分析，
DsENO 5’上游区在682~732 nt有明显的启动子序列特征（表2）.
利用Plantcare数据库对DsENO启动子序列进行进一步
分析，此序列包含真 核生物启动子核心元件，如CAAT-box
和TATA-box，以及光应答元件（如G-Box﹑GA-motif﹑GATA-
motif﹑I-box﹑Sp1﹑TCT-motif及as-2-box）﹑赤霉素应答元件
（如GARE-motif及P-box）﹑干旱响应元件（如MBS）及防御
与胁迫应答元件（如TC-rich repeats）等调控元件（图3）. 由此
推知DsENO可能会对高渗等不同胁迫产生应答.
2.3 DsENO在各种胁迫不同时期的转录活性
在高渗胁迫下，DsENO基因出现了转录下调的趋势（图
4-A）. 当胁迫10 min后，DsENO转录水平下降了约95.7%，随
后其转录水平呈现小幅波动但直至胁迫12 h后仍未能回升至
初始水平.
在高温胁迫下，DsENO基因出现了转录上调的趋势（图
4-B）. 当胁迫6 h后，DsENO转录水平达到初始水平的23倍，
随后其转录水平呈现逐渐回落趋势.
在低温胁迫下，DsENO基因转录呈现小幅波动（图4-C）.
DsENO转录水平在5 min短时胁迫后出现微弱上调，胁迫6 h
后达到峰值，其后逐渐回落至胁迫以前水平.
3 讨 论
3.1 启动子克隆
首 轮巢 式 扩增获得的序列较 短，为了尽可能多地了解
DsENO的5’上游转录调控区信息，我们进行了第二轮巢式扩
增. 通过序列分析，两轮巢式扩增得到的约2 000 bp PCR产物
的3’端与已知DsENO的5’端非翻译区序列完全一致，提示该
序列是DsENO的5’上游调控区. 经分析，此序列包含一些启动
子特征序列，如CAAT-box和TATA-box等，这表明，所分离的
序列可能是DsENO的5’上游启动子区.
由于D. salina独特的生物学特 性，以其作为植物耐盐
模式种进行研究日益受到关注. 而在D. salina渗透耐受研究
中，糖酵解途径参与甘油代谢是其胞内调渗的一个重要因
素[13]. 其中DsENO在高渗胁迫下出现表达差异. 从自身启动子
角度研究基因受调情况是 D. salina研究的核心内容之一. 启
动子根据其转录模式不同分为组成型启动子和诱导型启动
子. 糖酵解途 径关键基因之一的DsENO能够在转录水平受
光﹑干旱及其它胁迫的调节控制，因此，DsENO可能对渗透
等胁迫产生应答.
3.2 荧光定量PCR
荧光定量PCR技术具有高通量、特异性强、解决PCR污
染和操作简单等优点[19]. 它的灵敏性以及对扩增过程进行实
时监控的能力提高了基于PCR进行定量的有效性. 该技术是
对PCR反应过程中的每一个循环根据CT值进行定量分析，因
此只要在仪器检测的灵敏度范围内，就可以进行精确的外源
图2 巢式PCR从基因组步行文库中扩增DsENO 5’上游区
Fig. 2 Nested PCR amplifi cation for 5’ fl anking region of DsENO from four genome walking libraries
M: DL2,000TM DNA marker; D: Library from genomic DNA digested with Dra Ⅰ; E: Library from genomic DNA digested with EcoR Ⅴ; P: Library from
genomic DNA digested with Pvu Ⅱ; S: Library from genomic DNA digested with Stu Ⅰ; AP1: Amplifi cation products by singly AP1-primed PCR; Normal:
Amplifi cation products by AP1 and GSP2 primed PCR; GSP2: Amplifi cation products by singly GSP2-primed PCR
表2 Fruitfl y数据库启动子分析结果
Table 2 The analysis of DsENO promoter using Fruitfl y Database
Start End Score Promoter Sequence
471 521 0.91 TGGGGTGGCCCAAAAAGCCTCGAGGCAGCTT-CTAGTAAACTTTTTAGCCT
682 732 0.94 CTGAGATGCCTTAAAATGCGTGAAAAGTTTGA-GCTTGATAAATTGTGAGG
录用分数线：0.8（斜体字示转录起始）
Cutoff score: 0.8 (Transcription start shown by Italic letters)
2052 期 段静波等：盐生杜氏藻烯醇酶基因启动子的克隆分析及胁迫转录应答
基因拷贝数定量. 荧光定量PCR分为相对定量和绝对定量，
本实验采用的是相对定量法. 与绝对定量不同，相对定量不
关心每个样品中目的基因表达产物的具体拷贝数，而关注目
的基因在不同的细胞类型、不同的发育周期等条件下不同的
转录效率，即基因的差异化表达. 就研究目的而言，该方法比
绝对定量的应用范围更广泛、更符合研究的目的.
从图4-A可以看出，在高渗胁迫的情况下，DsENO转录水
平明显降低，说明其受高渗强烈抑制. 这是由于当外界渗透
压增加时，D. salina细胞需要快速且大量地合成甘油来平衡
膜内外的渗透压差异 [1]. 对D. salina的研究 [5]表明，其烯醇酶
蛋白的表达及酶活受到高渗抑制，减少光合作用固定的二氧
化碳流向三羧酸循环的同时推动3-磷酸甘油酸参与甘油合
成，通过它的减量表达达到快速平衡细胞内外渗透压的目
的，故而它的调控是通过渗透相关的信号途径实现的. 本研
究结合DsENO启动子分析揭示了高渗胁迫下D. salina烯醇酶
在转录﹑翻译及翻译后功能执行水平变化具有一致性，这表
明其参与了D. salina的渗透调节.
图4-B表明DsENO的转录受高温显著诱导，使得D. salina
烯醇酶在高温胁迫下于转录与翻译水平 [13]呈现紧密正相关，
该蛋白的高表达从根本而言是其相应基因高水平转录的体
现. D. salina烯醇酶可能作为一种热激蛋白而存在，是提高细
胞逆境耐受能力所不可或缺的.
DsENO的转录对低温的应答明显不及高温（图4-C），这
与此前报道 [10~12]一致. 推测烯醇酶在D. salina中可能具有转
录调控功能，使得烯醇酶不需要通过表达量的巨大改变对
低温胁迫作出应答，这一点在其翻译水平已经得到证实[13].
References
1 Avron M. The osmotic component of halotolerant algae. Trends Biochem
Sci, 1986, 11 (1): 5~6
2 Ben-Amotz A, Avron M. The role of glycerol in the osmotic regulation of
the halophilic alga Dunaliella parva. Plant Physiol, 1973, 51 (5): 875~878
3 Goyal A. Osmoregulation in Dunaliella, Part Ⅱ: Photosynthesis and
starch contribute carbon for glycerol synthesis during a salt stress in
图3 Plantcare数据库启动子分析结果
Fig. 3 The analysis of DsENO promoter using Plantcare Database
图4 不同胁迫下DsENO的转录变化
Fig. 4 The relative transcription level of DsENO under different stresses
A：高渗胁迫；B：高温胁迫；C：低温胁迫 A: Hyperosmotic stress; B: High temperature stress; C: Low temperature stress
206 17 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol
Dunaliella tertiolecta. Plant Physiol Biochem, 2007, 45 (9): 705~710
4 Goyal A, Lilley RMcC, Brown AD. The size and turnover of the glycerol
pool in Dunaliella. Plant Cell Environ, 1986, 9 (9): 703~706
5 Brewer JM, Lebioda L. Current perspectives on the mechanism
of catalysis by the enzyme enolase. In: Bush CA ed. Advances in
Biophysical Chemistry. Greenwich, Conn: JAI Press, 1997, 6: 111~141
6 Iida H, Yahara I. Yeast heat-shock protein of Mr 48, 000 is an isoprotein
of enolase. Nature, 1985, 315: 688~690
7 Miller BS, Kennedy TE, Streips UN. Molecular characterization of
specifi c heat shock proteins in Bacillus subtilis. Curr Microbiol, 1991, 22
(4): 231~236
8 O’Sullivan T, van Sinderen D, Fitzgerald G. Structural and functional
analysis of pC165st, a 6.5 kb plasmid from Streptococcus thermophilus
ND1-6. Microbiology, 1999, 145 (1): 127~134
9 Lal SK, Johnson S, Conway T, Kelley PM. Characterization of a maize
cDNA that complements an enolase-defi cient mutant of Escherichia coli.
Plant Mol Biol, 1991, 16 (5): 787~795
10 Lee H, Guo Y, Ohta M, Xiong LM, Stevenson B, Zhu JK. LOS2, a
genetic locus required for cold-responsive gene transcription encodes a
bi-functional enolase. EMBO J, 2002, 21 (11): 2692~2702
11 Pandey AK, Jain P, Podila GK, Tudzynski B, Davis MR. Cold induced
Botrytis cinerea enolase (BcEnol-1) functions as a transcriptional
regulator and is controlled by Camp. Mol Genet Genomics, 2009, 281 (2):
135~146
12 Bai LH (白林含), Qiao DR (乔 代蓉 ), Zheng M (郑鸣), Xu H (徐
辉), Li Q (李茜), Jiang Y (蒋彦), Yang ZH (杨志荣), Cao Y (曹毅).
Cloning enolase gene of Dunaliella salina with modified degenerate
PCR technology. J Beijing For Univ (北京林业大学学报), 2004, 26 (4):
25~29
13 Ruan K, Duan JB, Bai FW, Lemaire M, Ma XZ, Bai LH. Function of
Dunaliella salina (Dunaliellaceae) enolase and its expression during
stress. Eur J Phycol, 2009, 44 (2): 207~214
14 Chitlaru E, Pick U. Selection and Characterization of Dunaliella salina
Mutants Defective in Haloadaptation. Plant Physiol, 1989, 91 (2):
788~794
15 Siebert PD, Chenchik A, Kellogg DE, Lukyanov KA, Lukyanov SA. An
improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic
Acids Res, 1995, 23 (6): 1087~1088
16 Noguchi A, Takekawa N, Einarsdottir T, Koura M, Noguchi Y, Takano
K, Yamamoto Y, Matsuda J, Suzuki O. Chromosomal mapping and
zygosity check of transgenes based on f lanking genome sequences
determined by genomic walking. Exp Anim, 2004, 53 (2): 103~111
17 Sambrook J, Russell D. Molecular Cloning: Laboratory Manual. 3rd ed.
Cold Spring Harbor, New York, USA: Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 2001
18 Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data
using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C (T)) Method.
Methods, 2001, 25 (4): 402~408
19 Becker K, Pan D, Whitley CB. Real-time quantitative polymerase
chain reaction to assess gene transfer. Hum Gene Ther, 1999, 10 (15):
2559~2566