全 文 ：收稿日期:2004-11-22
基金项目:四川省科技厅应用基础项目(04JY029-080-2)
＊通讯作者
文章编号:　0490-6756(2005)02-0403-05
氮 、磷 、硫对盐生杜氏藻色素积累的影响
孙辉 ,徐文华 ,雷高鹏 ,邓婷婷 ,杨旺贵 ,刘玉坤 ,曹 毅 ,白林含＊
(四川大学生命科学学院 ,成都 610064)
摘要:研究了盐生杜氏藻(Dunal iella salina)在不同浓度氮 、磷 、硫等营养条件下对细胞积累 β-
胡萝卜素和叶绿素的影响.发现盐生杜氏藻细胞经过 10d生长 ,在营养缺乏条件下其 β-胡萝
卜素和叶绿素的比率达到最大 ,积累 β-胡萝卜素的最适条件是无氮 、无磷和无硫 ,但是不利于
盐生杜氏藻的生长.讨论了此结果的机理和意义 ,为利用盐生杜氏藻大规模生产 β-胡萝卜素
提供了理论依据.
关键词:盐生杜氏藻;氮 、磷 、硫;色素积累;β-胡萝卜素
中图分类号:Q945　　　文献标识码:A
盐生杜氏藻(Dunaliella sal ina)是真核生物中抗盐性最强的一种藻类.营养缺乏条件下能大量积累 β-
胡萝卜素 ,其 β-胡萝卜素含量可高达干重的 10%左右 ,最高时可达 14%[ 1] ,为自然界中所有生物之首 ,而
植物叶子和其它藻类中 β-胡萝卜素含量仅为 0.3%左右[ 2] .β-胡萝卜素积累于叶绿体内的中性脂质小体
中 ,分布在内囊体片层之间.这也是盐生杜氏藻区别于其他藻类的典型生理特征.β-胡萝卜素是一种广泛
存在于光合生物中的脂溶性捕光色素 ,天然 β-胡萝卜素分子呈顺式与反式混合构型 ,摄入人体后 ,一部分
裂解为维生素 A分子 ,另一部分具有淬灭体内自由基 ,防止衰老以及癌变的生物学活性 ,具有广阔的应用
前景.本文重点研究了氮 、磷 、硫营养元素对盐生杜氏藻积累 β-胡萝卜素和叶绿素及其二者比率的影响 ,
为研究盐生杜氏藻的 β-胡萝卜素积累机理做出了初步的探讨 ,以及为工业上建立高产盐生杜氏藻 β-胡萝
卜素的生产条件提供了理论依据.
1　材料和方法
1.1　材料
盐生杜氏藻(Dunal iella salina)为本实验室保存藻种.
1.2　方法
1.2.1　培养基和培养条件　采用三角瓶培养 ,按 10%接种量接种 , 在光照与黑暗周期为 16h/8h ,温度
(28±1)℃环境中培养 ,培养液成分参照 Johnson M K和 Goyal A[ 3 , 4]的方法配制.不同浓度氮源的处理方
法:以 NaNO3 为氮源 ,设置 6种不同氮浓度试验组 ,即 0 、1mmol/L 、2mmol/L 、3mmol/L 、4mmol/L 、5mmol/
L ,经过 10d生长 ,分别测定它们的细胞生长情况以及 β-胡萝卜素和叶绿素的含量;不同浓度磷源的处理
方法:以 KH2PO4 为磷源 ,设置 6 种不同磷浓度试验组 , 即 0 、0.1mmol/L 、0.2mmol/L 、0.3mmol/ L 、
0.4mmol/ L 、0.5mmol/L , 10d生长后分别测出它们的细胞生长情况以及 β-胡萝卜素和叶绿素的含量;不
同浓度硫源的处理方法:以 MgSO4 为硫源 , 设置 6 种不同硫浓度试验组 ,即 0 、1mmol/L 、2mmol/ L 、
3mmol/L 、4mmol/L 、5mmol/L , 10d生长后分别测定它们的细胞生长情况以及 β-胡萝卜素和叶绿素的含
2005年 4月
第 42卷第 2期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan Universi ty (Natural Science Edition)
Apr.2005
Vol.42　No.2
量.
1.2.2　分析检测方法　取 10mL藻液 ,离心弃上清 ,加入 4mL 丙酮提取色素 ,重复 2 ～ 3 次 ,直至藻体呈
灰白色 ,测定提取液的光吸收值 ,根据 Jensen公式[ 5]分别计算出叶绿素和 β-胡萝卜素的含量.每组取 3个
样 ,测 3次 ,取平均值 ,以减小试验误差.
2　结果
2.1　氮对盐生杜氏藻 β-胡萝卜素和叶绿素积累的影响
　　图 1阐明了不同氮浓度下盐生杜氏藻的生长情况 ,可见经过 10d的生长 ,在氮浓度为 2mmol/ L 时最
适于盐生杜氏藻的生长 ,当缺氮时其生长基本停滞.而由于在氮浓度为 2mmol/ L 时藻液中含有更多的细
胞 ,当以单位体积藻液来测定 β-胡萝卜素和叶绿素的含量时 ,在这个条件下单位体积的含量最高 ,而 N 为
0时含量最低(图 2),这时 β-胡萝卜素和叶绿素的比率达到最高(图 3).
图 1　不同氮浓度下细胞浓度变化
Fig.1　Cell concentration in the cultures under
different concentration
图 2　β-胡萝卜素 、叶绿素含量的变化
F ig.2　Volumetric β-caro tene, chlo rqphyll production
in the cultures
图 3　β-胡萝卜素和叶绿素的比率变化
ig.3　Vo lumetric β-carotene/ chlo rophyll ratio production
in the cultures
图 4　不同磷浓度下盐生杜氏藻的细胞浓度
Fig.4　Cell concentration in the cultures under
different KH2PO 4 concentration
404 四川大学学报(自然科学版) 第 42卷
2.2　磷对盐生杜氏藻 β-胡萝卜素和叶绿素积累的影响
从图 4上可以看出 , 10d生长后 ,在P 为 0.2mmol/L 时盐生杜氏藻细胞数量最多 ,P 为 0时最少.在以
单位体积藻液来测定 β-胡萝卜素和叶绿素的含量时 ,在 P 为 0.2mmol/L 和 0.4mmol/L 时较高 ,而 P 为 0
时最低(图 5).但是 β-胡萝卜素和叶绿素的比率在 P 为 0时最高 ,随着磷浓度增高到 0.2mmol/L 上时 ,这
个比率又有缓缓增高的趋势 ,且很接近(图 6).
图 5　不同磷浓度下 β-胡萝卜素 、叶绿素含量的变化
Fig.5　Volumetricβ-carotene , chlorophyll productionin the
cultures under different KH2PO4 concentration
图 6　不同磷浓度下 β-胡萝卜素和叶绿素的比率变化
Fig.6　Volumetric β-carotene /chlorophyll ratio production in
the cultures under different KH2PO 4 concentration
2.3　硫对盐生杜氏藻 β-胡萝卜素和叶绿素积累的影响
　　在不同的硫浓度下 ,盐生杜氏藻细胞的生长情况和不同氮浓度下相似 ,(图 7 ～ 9).可见三者中氮和硫
缺乏是增加 β-胡萝卜素积累的主要因素 ,而在缺磷的试验中就没有上两个试验那么明显的效果 ,但磷还
是对 β-胡萝卜素积累有一定的影响.
图 7　不同硫浓度下盐生杜氏藻的细胞浓度
Fig.7　Cell concentration in the cultures under
different MgSO4 concentration
图 8　不同硫浓度下 β-胡萝卜素 、叶绿素含量的变化
Fig.8　Volume tric β-carotene , chlorophy ll production in
the cultures under different MgSO4 concentration
3　讨论
3.1　营养缺乏胁迫对盐生杜氏藻 β-胡萝卜素和叶绿素比率的影响
通过以上的研究可以得出 ,营养缺乏对盐生杜氏藻合成类胡萝卜素有促进作用 ,尤其是缺乏氮时更明
405第 2期 孙辉等:氮 、磷 、硫对盐生杜氏藻色素积累的影响
显 ,其次是硫 ,而磷影响较小.当 N 、S 、P 均为 0 时都能促进盐生杜氏藻细胞 β-胡萝卜素的积累 ,而当
氮 、硫 、磷浓度分别达到3mmol/ L 、0.1mmol/L和3mmol/ L以上时 ,对 β-胡萝卜素的积累不再有大的影响.
图 9　不同硫浓度下 β-胡萝卜素和叶绿素的比率变化
Fig.9 　Volumetric β-caro tene /chlorophyll ratio produc-
tion in the cultures under different MgSO4 concentration
在不同营养浓度盐生杜氏藻细胞的生长情况和
其体内 β-胡萝卜素积累情况不一致 ,可能是由
于当这些必需元素缺失时盐生杜氏藻细胞停止
了分裂 ,细胞浓度降低 ,单位体积 β-胡萝卜素
和叶绿素含量也随之减少 ,但仍导致 β-胡萝卜
素和叶绿素含量比显著增大.单位细胞中 β-胡
萝卜素含量可能会增加 ,叶绿素含量会减少 ,这
是因为叶绿素是含氮色素 ,细胞内叶绿素含量
与氮源利用有关.在缺氮的时候叶绿素的合成
受阻 ,叶绿素含量随之减少 ,细胞介质中的碳 、
氢元素就会更多地参与非氮的光合色素的合成
反应 ,胡萝卜素是不含氮的色素 ,在氮等元素缺
乏使得叶绿素难以合成时 ,就启动了 β-胡萝卜
素的积累 ,它的含量会增加以补充色素 ,因此在
缺氮条件下 β-胡萝卜素的积累基本上是与叶
绿素含量下降相伴随的.在缺磷和硫元素时和
缺氮是类似的机理 ,但是没有氮那么明显.
3.2　盐藻细胞色素合成分子机理
在类胡萝卜素的生物途径当中 ,植物细胞中的碳水化合物 、蛋白质和脂质代谢后会经丙酮酸形成乙酰
辅酶 A和乙酰乙酰辅酶 A ,两者合成为 3-羟-3-甲-戊二酸单酰辅酶 A(HMG-CoA),紧接着还原为 3-甲-3 ,
5-二羟戊酸化合物(MVA).而 MVA是类异戊二烯化合物的前体 ,由 MVA形成重要中间体异戊烯二磷酸
酯(IDP),逐步加合为 C10的GDP 、C15的 FDP 、C20的GGDP和 C40的八氢番茄红素.八氢番茄红素逐步
脱氢为六氢番茄红素 、ζ-胡萝卜素 、链孢红素和番茄红素.番茄红素又逐步环化为 γ-胡萝卜素 、β-胡萝卜
素.而这一系列路径的每一步反应都必须要有相应的酶来参与.
在上述途径中有着两个关键环节:一个是 HMG-CoA的合成和还原 ,另一个是八氢番茄红素的合成.
八氢番茄红素是类胡萝卜素生物合成的第一个中间体 ,从 IDP 经 GDP 、FDP 、GGDP 到八氢番茄红素 ,这
个合成过程和细胞内其他物质的合成存在着不同程度的竞争 ,合成是否向八氢番茄红素方向进行依赖于
相应的各种酶的活性 ,特别是与八氢番茄红素合成酶的活性有关.在营养缺乏时盐生杜氏藻细胞生长变
慢 ,分裂减少 ,细胞体积增大 ,细胞中编码类胡萝卜素生物合成酶基因(cbr 基因)被激活 ,从而产生新的转
录和翻译.有人发现当被胁迫的盐生杜氏藻细胞中 β-胡萝卜素积累水平提高时 ,总是先有 cbr基因转录水
平的提高和积累[ 6] ,这使类胡萝卜素生物合成酶的活性增加或被重新合成.同时已合成的 β-胡萝卜素的
降解速率也减低.所以就会出现盐生杜氏藻细胞中 β-胡萝卜素的含量增高的现象.
3.3　“碳库”的假设
为了解释氮 、磷 、硫这些营养元素对盐生杜氏藻细胞色素积累作用的分子机理 ,我们已对类胡萝卜素
生物合成酶基因(Cbr 基因和 PDS基因)做了研究[ 7] .另外 , β-胡萝卜素正是一种合适的“中性物质” ,它可
以起到光损伤保护作用 ,我们可以用来解释营养限制对 β-胡萝卜素积累的影响.
综合以上结果我们可以得出 ,营养元素的缺乏会导致盐生杜氏藻中 β-胡萝卜素的积累.本文的研究
第一次把这三个营养元素一起作了分析 ,得出在不同的营养浓度下盐生杜氏藻中色素积累的变化趋势 ,从
而为研究盐生杜氏藻 β-胡萝卜素积累机理做出了初步的探讨 ,也为工业上利用盐生杜氏藻生产 β-胡萝卜
素设置生产条件提供了更加详细的理论依据.
406 四川大学学报(自然科学版) 第 42卷
参考文献:
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[ 7] 　郑鸣 , 白林含.四川大学学报(自然科学版), 2003 , 40(3):590-593.
The Effect of Nitrogen Phosphorus and Sulfur on the Pigments
Accumulation of Dunaliella salina
SUN Hui , XU Wen-hua , LEI Gao-peng , DENG Ting-t ing , Y ANG Wang-gui ,
LIU Y u-kun , CAO Y i , BAI Lin-han
(College of Life Science , Sichuan Universi ty , Chengdu 610064 , China)
Abstract:Dunaliel la salina is an unicellular g reen alga , that accumulates large amounts of β-carotene w hen
cultivated in special st ress conditions.The optimum parameters of N -NaNO3 , P-KH2PO4 and S-MgSO4 fo r
both alg al important events , cell g row th and accumulation of pigments , were established basis on series of ex-
periment w ith different concentration under the normal condit ions.Results show ed that the alg al cellular max-
imum content of β-caro tene w as obtained at N , P ,S-f ree in period of 10 days.The β-carotene /chlorophyll ra-
tio arrived the largest value , but i ts g row th rate is limited under these condition.Based on the above results ,
the controlled mechanism and its effect on ni trogen , phosphate and sulfur for available cell accumulation of β-
carotene w as thus discussed.
Key words:Dunaliel la salina;nit rogen phosphate and sulfur;pigments accumulation;β-caro tene
407第 2期 孙辉等:氮 、磷 、硫对盐生杜氏藻色素积累的影响