全 文 ：第 47卷　增刊 2
2008年 12月
厦门大学学报(自然科学版)
JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)
Vol.47　Sup.2
Dec.2008
　　
　　收稿日期:2008-09-19
　　基金项目:福建省重大专项前期研究项目(2005YZ1022),国家基础
科学人才培养基金(J0630649), 细胞生物学与肿瘤细胞
工程教育部重点实验室开放基金(2005104)资助
　　＊通讯作者:liugfls@xmu.edu.cn
富含 β-胡萝卜素杜氏藻的紫外线诱变筛选
钟　政 , 刘广发＊
(厦门大学生命科学学院 , 福建 厦门 361005)
摘要:以本实验室保存的 7种(13株)杜氏藻为材料 , 筛选出 β-胡萝卜素含量较高的藻株 Dunaliela.bardawil(1-7)进行
紫外线诱变.以橙-红色藻落为初筛标志 , 再经高盐 、强光 、低氮诱导 ,检测其 β-胡萝卜素含量 ,即复筛.发现突变株 11-1具
有高产 β-胡萝卜素的能力 , 其 β-胡萝卜素含量高达干质量的 9.48%,显著高于原出发株.此外 11-1的细胞体积是原出发
株的 5倍多 , 有利于养殖和收集.
关键词:杜氏藻;诱变;β-胡萝卜素
中图分类号:Q 949.21　　　　　文献表识码:A　　　　　文章编号:0438-0479(2008)S2-0158-04
　　随着陆地资源日益减少 ,开发海洋生物资源已迫
在眉睫.迄今世界范围内从海洋动植物和微生物中分
离得到的新型化合物已有 1.5万种之多 [ 1] .在众多生
物中 ,藻类具有光合作用效率高 、环境适应能力强 、生
长周期短 、生物产量高的特点 [ 2] .杜氏藻 (Dunaliela
spp.),我国简称盐藻.它们是一类单细胞真核绿藻 ,在
特定条件(强光 、高盐 、低氮)下 ,可在胞内大量积累 β-
胡萝卜素 ,是目前自然界中已知 β-胡萝卜素含量最高
的物种 ,从而使藻体呈现橙红色而不是绿色 [ 3] .β-胡萝
卜素作为维生素 A的前体和食品着色剂具有突出的
抗氧化 、延缓衰老 、提高免疫力 、降低肿瘤和心血管疾
病发生率等作用以及鲜艳的颜色 ,被广泛应用于保健
品 、食品 、饲料和化妆品等领域 ,被联合国粮农组织确
认为最优秀的食品添加剂 ,在世界范围内的需求量与
日俱增 ,价格逐年攀升 ,开发利用的前景十分诱人.本
文以紫外线诱变结合筛选的方法获得富含 β-胡萝卜
素的杜氏藻突变株 ,为进一步提高杜氏藻胡萝卜素的
产量奠定了良好的基础.
1　材料与方法
1.1　藻种及其来源
7种(13株)供试杜氏藻见表 1.
其中 1 ～ 6号杜氏藻购自青岛海洋大学 , 7号藻株
采集于大连海域 , 8号藻株由以色列 M.Ginzburg博士
惠赠 , 9号为 D.bardawil的耐低温突变株(L-5)[ 4] , 10
号为 D.bardawil的耐高温突变株(H-42)[ 5] , 13号为
新加坡国立大学李元昆博士赠送.
1.2　杜氏藻的培养条件
本次实验采用了 3种培养基 ,即正常培养基(改
进的 A.Ben-Amotz培养基 [ 6] )、琼脂培养基(含琼脂 0.
8%)和高盐培养基.其中正常培养基用于保种和一般
培养 ,琼脂培养基用于紫外诱变筛选 ,而高盐培养基则
用于诱导积累 β-胡萝卜素(表 2).
表 1供试杜氏藻及其编号
Tab.1　Thetestedspecies(strains)ofDunaliellaspp.
编号 杜氏藻种(株)名
1 D.bioculata
2 D.parva
3 D.peircei
4 D.primolecta
5 D.minuta
6 D.salina
7 Dunaliellasp.
编号 杜氏藻种(株)名
8 D.bardawil
9 D.bardawil(L-5)
10 D.bardawil(H-42)
11 D.bardawil(1-7)
12
D.bardawil(W-8-
1)
13
D. bardawil
(30861)
1.3　β-胡萝卜素含量检测
取 100 mL藻液 , 4 000 g离心 5 min得藻泥 ,冻
干或 80℃烘干 24 h, 称量.每 1 mg藻粉添加 0.5
mL90%丙酮 ,振动混匀 ,离心 5 min,萃取 2次 ,合
并萃取液 ,用紫外分光光度计(UNICAMUV300)测
定波长为 453 nm的 OD值.通过标准曲线 (y=0.
056x+0.327, R2 =0.998, n=5)的换算得出 β-胡萝卜
素含量 [ 4-5] .
增刊 2 钟　政等:富含 β -胡萝卜素杜氏藻的紫外线诱变筛选 · 159　 ·
表 2　杜氏藻培养条件
Tab.2　TheculturalconditionsofDunalielaspp.
培养基 光照强度 /lx 光照周期 温度 / ℃ NaCl浓度 /(mol· L-1)
氮源 /
(mmol· L-1)
磷源 /
(mmol· L-1) pH
正常培养基 12000 全天光照 28 1.5 5 0.1 7.4
琼脂培养基 12000 全天光照 28 2.5 2.4 0.04 7.4
高盐培养基 30000 全天光照 30 3.5 0.6 0.02 7.4
1.4　紫外线诱变及筛选
在杜氏藻固体培养基表面加入 100 ～ 200 μL处于
指数生长期的杜氏藻藻液 ,用三角玻棒均匀涂抹 ,置于
30 W紫外灯下 13cm处 ,照射 40 ～ 100 s后暗培养 48
h[ 6-7] ,然后在光强 12 000 lx, 28℃下培养 15d.挑取黄
色至橙红色藻落(初筛)到装有少量正常培养基的试
管中光照培养 10 d后 ,转移到小锥形瓶再培养 14 d.
离心收集藻泥 , 转移到高盐培养基中 , 高光强
(30 000lx)30℃下继续培养 15 d,诱导积累 β-胡萝卜
素 ,不时摇动.检测其中的 β-胡萝卜素含量(复筛)[ 8] .
1.5　显微观察及显微测量
显微镜下随机取 50个突变藻株和原出发株的细
胞进行显微测量 ,记录每个细胞的短径 a和长径 b,由
体积公式 V=4 /3π·(a/2)2· (b/2)得到各藻株细胞
的平均体积 [ 9] .
1.6　电镜切片观察
将正常藻株和待检突变藻株按常规方法进行电镜
切片制备 ,用 JEM2100透射电镜进行观察 ,比较其差
异.
2　结果与分析
2.1　7种(13株)供试杜氏藻细胞中 β-胡萝卜
素的含量
　　经检测 , 7种(13株)杜氏藻的 β-胡萝卜素含量如
表 3所示:
从表 3可以看出 ,杜氏藻藻株间 β-胡萝卜素含量
和产量的差异很大 ,其中 1号 、4号 、10号 、11号 、12号
和 13号具有较高的 β-胡萝卜素干质量 、含量和产量.
因此以 11号为出发株进行紫外线诱变和筛选.
表 3　7种(13株)杜氏藻的 β-胡萝卜素含量
Tab.3　Theβ-carotenecontentof7species(13 strains)ofDunaliela
藻种(株)及代号 β-胡萝卜素占藻干质量 /% 细胞中 β-胡萝卜素含量 /(pg·个 -1) β-胡萝卜素产量 /(mg· L-1)
1 1D.bioculata 1.77 3.10 19.14
2 1D.parva 0.94 1.67 9.18
3 1D.peircei 0.73 1.31 5.50
4 1D.primolecta 1.94 3.37 25.11
5 1D.minuta 1.46 2.61 11.25
6 1D.salina 1.03 1.85 7.50
7 1Dunalielasp. 1.65 2.95 13.54
8 1D.bardawil 1.07 1.91 9.36
9 1D.bardawil(L-5) 0.45 0.81 3.00
10D.bardawil(H-42) 2.11 3.69 23.79
11D.bardawil(1-7) 2.07 3.69 16.86
12D.bardawil(W-8-1) 2.05 3.65 17.54
13D.bardawil(30861) 1.79 3.15 17.64
· 160　 · 厦门大学学报(自然科学版) 2008年
图 1　高盐强光胁迫后突变株藻液(右)呈现深橙色
Fig.1　Deep-orangecolorofmutatedstrainofDunaliela
(right)afterexposuretohighNaClconcentrationand
highlightintensity
图 2　高盐强光培养 3株杜氏藻 β-胡萝卜素含量的变化
Fig.2　TheefectofhighNaClconcentrationandhighlightin-
tensityonthevariationofβ-carotenecontentof3
strainsofDunaliela
2.2　诱变筛选获得富胡萝卜素突变株
紫外线辐射诱变之后 , 90%以上的杜氏藻死亡.经
培养在琼脂培养基上长出少数橙黄色 -红色藻落.挑取
其中 2株较大(生长较快)的藻落 ,命名为 11-1和 11-
2.经少量试管培养 、正常培养基锥形瓶培养和高盐强
光培养基大量培养 , 11-1转变成明显的深橙色(图 1).
生长曲线检测表明 ,到生长平衡期 11-1的 β-胡萝卜素
占藻干质量 9.48%,显著高于原出发株(图 2).而 11-
2产 β-胡萝卜素的能力弱 ,不是一株优良突变株.
2.3　突变株 11-1的形态和显微测量
在显微镜下 , 11号藻株细胞较小 ,绿色 ,卵形 ,游
动迅速.突变株 11-1藻株细胞比 11号藻株细胞大很
多 ,呈橙红色 ,梨形或圆形 ,游动较慢(图 3).
11号藻株和突变株 11-1的藻细胞大小测量结果
表明 ,前者的平均细胞体积只有 8.23 μm3 ,而后者的
体积达 44.65 μm3 ,是 11号原出发株的 5倍多 ,这对
提高产量和方便收获是很有利的.
增刊 2 钟　政等:富含 β -胡萝卜素杜氏藻的紫外线诱变筛选 · 161　 ·
2.4　电镜切片观察结果
11号藻株和突变株 11-1细胞的电镜观察结果如
图 4所示:
图 4中深灰色椭圆形颗粒为富含 β-胡萝卜素小
囊 ,黑色不规则颗粒状物质为淀粉粒 [ 10] .可以看出 , 11
号藻株细胞内含有少量的 β-胡萝卜素颗粒和数量相
当的淀粉粒.而突变株 11-1的藻细胞内含有大量的 β-
胡萝卜素颗粒 ,几乎充满整个细胞 ,只有很少量的淀粉
粒.这说明 11号藻株的 β-胡萝卜素含量较低 ,而突变
株 11-1的 β-胡萝卜素含量高得多.
3　讨　论
某些种的杜氏藻具有高产 β-胡萝卜素的能力 ,在
一定的胁迫条件下可以合成和积聚比其他生物高很多
的 β-胡萝卜素 ,但由于积累 β-胡萝卜素和杜氏藻生长
的最适条件是相互矛盾的 ,往往导致生物量很低.为了
解决这一矛盾可以采用二步法培养.首先提供有利的
培养条件促进细胞的快速生长 ,保证获得较高的生物
量;然后收集鲜藻 ,转移到强光照 、高盐度 、高温度和营
养盐缺乏(低氮 、低磷)等逆境中 ,促进杜氏藻合成并
积累高含量的 β-胡萝卜素 [ 8] .但二步法培养对大面积
杜氏藻养殖实用性不强.可以考虑适当降低培养液中
氮和磷的含量 ,在杜氏藻大量繁殖充分利用氮 、磷营养
盐后 ,导致培养液中氮 、磷含量降低到接近零 ,营造出
低氮 、低磷的胁迫逆境 ,从而使得杜氏藻基本停止细胞
分裂 ,转而合成并积累大量的 β-胡萝卜素.
通过紫外线诱变 、初筛和复筛 ,获得一株富含 β-
胡萝卜素的杜氏藻突变株 11-1,其 β-胡萝卜素含量为
国内同类报道的最高值[ 5] .今后进一步优化光强 、盐
度 、氮磷浓度等因素 ,获得更高产 β-胡萝卜素也是可
能的.
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369.
UVRadiationandScreenforβ-carotene-richStrainofDunaliela
ZHONGZheng, LIUGuang-fa＊
(SchoolofLifeSciences, XiamenUniversity, Xiamen361005, China)
Abstract:Thestrainscontaininghighcontentofβ-carotenewereobtainedafterthedetectionof7species(13 strains)ofDunalieladeposi-
tedinourlaboratory.OneofthestrainswasselectedandradiatedbyUV.Experimentresultsdemonstratedthattheorange-redcoloniesofal-
gaecouldbeusedasthepreliminarymarkerforscreeningβ-carotene-richcel.Amutant, dominatedas11-1, containingβ-caroteneashigh
as9.48% (driedmass)wasselectedafteraseriousofhighsaltconcentration, highlightintensitycultivationandlowernitrogensourcecon-
duction.Meanwhilethesizeofmutant11-1 was5 timesmorethanitsoriginalpatern.Itwaspropitioustocultivationandcolectionofthe
β-carotenehyper-producingnewstrainsofDunaliela.
Keywords:Dunaliela;mutation;β-carotene